甜菊醇糖苷類的重組生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了經(jīng)過改造能夠表達(dá)編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)之重組基因的重組微生物、植物和植物細(xì)胞。這樣的微生物、植物或植物細(xì)胞可以產(chǎn)生甜菊醇糖苷類，例如萊鮑迪苷A和/或萊鮑迪苷D，其可用作食品中的天然甜味劑和膳食補(bǔ)充劑。
【專利說明】甜菊醇糖苷類的重組生產(chǎn)
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán):2011年8月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 /521,084 ;2011年8月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 / 521，203 ;2011年8月8日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 / 521,051 ;2011年8月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 / 523, 487 ；2011年12月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 / 567, 929以及2012年2月27日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)61 / 603，639，其全部通過引用整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開內(nèi)容涉及甜菊醇糖苷類(steviol glycosides)的重組生產(chǎn)。具體地,本公開內(nèi)容涉及通過重組宿主例如重組微生物、植物或植物細(xì)胞來生產(chǎn)甜菊醇糖苷類例如萊鮑迪苷(rebaUdi0Side)D。本公開內(nèi)容還提供了包含甜菊醇糖苷類的組合物。本公開內(nèi)容還涉及用于通過調(diào)節(jié)角鯊烯(squalene)途徑的類萜前體之生物合成來生產(chǎn)類萜的工具和方法。
【背景技術(shù)】
[0004]甜味劑作為最常用于食品、飲料或糖果業(yè)的成分是公知的。甜味劑既可以在生產(chǎn)過程中加入最終食品，也可以在適當(dāng)稀釋的情況下作為佐餐甜味劑或者作為烘培中糖的家用替代品來單獨(dú)使用。甜味劑包括天然甜味劑(例如蔗糖、高果糖玉米糖漿、糖蜜、楓糖漿和蜂蜜)和人工甜味劑(例如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以從常青灌木甜葉菊(Stevia rebaudiana)中分離和提取的一種天然甜味劑。甜菊在南美和亞洲被廣泛種植用于商業(yè)生產(chǎn)甜菊提取物。純化程度各不相同的甜菊提取物在商業(yè)中用作食品中的高甜度甜味劑，以及共混或單獨(dú)地作為佐餐甜味`劑。
[0005]甜菊植物的提取物含有萊鮑迪苷和其他帶來甜味的甜菊醇糖苷類，但不同產(chǎn)品批次之間每種糖苷的量往往不同。現(xiàn)有的商品中占優(yōu)勢(shì)的是萊鮑迪苷A，和量少一些的其他糖苷，例如萊鮑迪苷C、D和F。甜菊提取物還可能含有雜質(zhì)，例如造成異味的來源于植物的化合物。這些異味根據(jù)食物系統(tǒng)或應(yīng)用選擇可能會(huì)帶來或多或少的問題。潛在的雜質(zhì)包括色素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酚類、糖類、斯巴醇和其他倍半萜、半日花烷型二萜、單萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆留醇(stigmasterol)、β -谷留醇(β -sitosterol)、α -和 β -香樹素(a -and β -amyrin)、羽扇豆醇酯(Iupeol)、β-香樹醇乙酸酯(β -amryin acetate)、五環(huán)三職、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α -杜松醇(ep1-alpha-cadinol)、carophylIenes 和衍生物、β -薇烯(beta-pinene)、β-谷留醇(beta-sitosterol)以及赤霉素(gibberellin)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了重組宿主，例如微生物、植物或植物細(xì)胞，其包含一個(gè)或更多個(gè)生物合成基因，這些基因的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生甜菊醇糖苷類，例如萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或杜爾可苷(dulcoside)A。特別地，EUGTl I (本文所述的一種尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基轉(zhuǎn)移酶)可單獨(dú)使用或者與一種或更多種其他Μ)Ρ糖基轉(zhuǎn)移酶例如UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2和UGT91D2e組合使用以允許萊鮑迪苷D在重組宿主中產(chǎn)生和累積或者使用體外系統(tǒng)。如本文所述，EUGTll具有強(qiáng)1，2-19-0-葡萄糖糖基化活性，其為萊鮑迪苷D產(chǎn)生的一個(gè)重要步驟。
[0007]通常來說，甜菊苷(stevioside)和萊鮑迪苷A是在商業(yè)上生產(chǎn)的甜菊提取物中的主要化合物。據(jù)報(bào)道，甜菊苷的味道比萊鮑迪苷A更苦并且甜味更小。根據(jù)種植植物的土壤和氣候，甜菊提取物的組成可大不相同。據(jù)報(bào)道，根據(jù)植物來源、氣候條件和提取工藝，商業(yè)制備物中萊鮑迪苷A的量為甜菊醇糖苷類總含量的20%至97%不等。在甜菊提取物中，其他甜菊醇糖苷類以多種量存在。例如，萊鮑迪苷B通常以小于1%至2%存在,而萊鮑迪苷C可以以高至7% -15%的水平存在。萊鮑迪苷D通常以2%或更低的水平存在，萊鮑迪苷F通常在組合物中以總甜菊醇糖苷類的3.5%或更低存在。次要甜菊醇糖苷類的量影響甜菊提取物的風(fēng)味特征(flavor profile)。此外,認(rèn)為萊鮑迪苷D和其他較高糖化甜菊醇糖苷類是與萊鮑迪苷A相比質(zhì)量更高的甜味劑。因此，本文所述的重組宿主和方法特別可用于生產(chǎn)具有增加量的萊鮑迪苷D的甜菊醇糖苷類組合物，該甜菊醇糖苷類組合物例如用作無(wú)熱量的甜味劑，其功能特性和感覺特性優(yōu)于許多高效甜味劑。
[0008]在一個(gè)方面中，本文描述了這樣的重組宿主，其包含編碼與SEQ ID NO:152中所示氨基酸序列具有至少80%同一性之多肽的重組基因。
[0009]本文的特征還在于這樣的重組宿主，其包含編碼具有將第二糖部分轉(zhuǎn)移至甜葉懸鉤子苷(rubusoside)之19_0_葡萄糖的C-2’處之能力的多肽的重組基因。本文的特征還在于這樣的重組宿主，其包含編碼具有將第二糖部分轉(zhuǎn)移至甜菊苷(stevioside)之19-0-葡萄糖的C-2’處之能力的多肽的重組基因。
[0010]在另一個(gè)方面中，本文描述了這樣的重組宿主，其包含編碼具有將第二糖部分轉(zhuǎn)移至甜葉懸鉤子苷之19-0-葡萄糖的c-2’處和轉(zhuǎn)移至甜葉懸鉤子苷之13-0-葡萄糖的C-2’處之能力的多肽的重組基 因。
[0011]本文還描述了這樣的重組宿主，其包含編碼具有將第二糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷A之19-0-葡萄糖的C-2’處以產(chǎn)生萊鮑迪苷D之能力的多肽的重組基因，其中當(dāng)反應(yīng)在相應(yīng)條件下進(jìn)行時(shí)，該多肽的催化速率比具有SEQ ID NO:5中給出之氨基酸序列的91D2e多肽快至少20倍(例如，快25倍或30倍)。
[0012]在本文所述的任意重組宿主中，所述多肽與SEQ ID NO:152中所示氨基酸序列可以具有至少85%的序列同一性(例如，90%、95%、98%或99%序列同一性)。所述多肽可以具有SEQ ID NO:152中所示氨基酸序列。
[0013]本文所述的任意宿主還可以包含編碼與SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列具有至少90%同一性之UGT85C多肽的重組基因。UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID NO:3的第
9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444以及471位殘基處的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換。
[0014]本文所述的任意宿主還可以包含編碼與SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有至少90%同一性之UGT76G多肽的重組基因。UGT76G多肽可以具有位于SEQ ID NO:7的第29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位殘基處的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換。
[0015]本文所述的任意宿主還可以包含編碼UGT74G1多肽的基因(例如，重組基因)。
[0016]本文所述的任意宿主還可以包含編碼功能性UGT91D2多肽的基因(例如，重組基因)。UGT91D2多肽與SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列可以具有至少80%的序列同一性。UGT91D2多肽可以具有位于SEQ ID NO:5的第206、207或343位處的突變。UGT91D2多肽還可以具有位于SEQ IDNO:5的第211和286位處的突變(例如，L211M和V286A，稱為UGT91D2e-b)。UGT91D2多肽可以具有SEQ ID NO:5、10、12、76、78或95中所示氨基酸序列。
[0017]本文所述的任意宿主還可以包含以下中的一個(gè)或更多個(gè):
[0018](i)編碼香葉基香葉基二憐酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase)的基因;
[0019](ii)編碼柯巴基二憐酸合酶(copalyl diphosphate synthase)和貝殼杉烯合酶(kaurene synthase)雙功能的基因、或者編碼柯巴基二磷酸合酶的基因和編碼貝殼杉烯合酶的基因；
[0020](iii)編碼貝殼 杉烯氧化酶(kaurene oxidase)的基因；以及
[0021](iv)編碼甜菊醇合成酶(steviol synthetase)的基因。
[0022](i)、(ii)、(iii)和(iv)基因中的每一個(gè)都可以是重組基因。
[0023]本文所述的任意宿主還可以包含以下中的一個(gè)或更多個(gè):
[0024](V)編碼截短的HMG-CoA的基因；
[0025](vi)編碼CPR的基因；
[0026](vii)編碼鼠李糖合成酶的基因；
[0027](viii)編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因；以及
[0028](ix)編碼UDP-葡糖醒酸脫羧酶的基因。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、
(viii)或(ix)基因中的至少一個(gè)可以是重組基因。
[0029]香葉基香葉基二磷酸合酶與SEQ ID NO:121-128中所示氨基酸序列之一可以具有大于90%的序列同一性?？掳突姿岷厦概cSEQ ID NO:129-131中所示氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性。貝殼杉烯合酶與SEQ ID NO:132-135中所示氨基酸序列之一可以具有大于90%的序列同一性。貝殼杉烯氧化酶與SEQ ID NO:138-141中所不氨基酸序列之一可以具有大于90%的序列同一性。甜菊醇合成酶與SEQ ID NO:142-146中所示氨基酸序列之一可以具有大于90%的序列同一性。
[0030]當(dāng)任意重組宿主被培養(yǎng)在使每個(gè)基因都能得以表達(dá)的條件下時(shí)可以產(chǎn)生至少一種甜菊醇糖苷類。所述甜菊醇糖苷類可以選自:甜葉懸鉤子苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、杜爾可苷A、甜菊苷、甜菊醇-19-0-葡萄糖苷、甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷(steviol-1，2-bioside)、甜菊醇-1，3-二糖苷(steviol-1, 3-bioside)、1，3_甜菊苷(I, 3_stevioside)以及其他鼠李糖化或木糖化(xylosylated)中間體。當(dāng)在所述條件下培養(yǎng)時(shí)，甜菊醇糖苷類(例如，萊鮑迪苷D)可以累積到至少Img /升(例如至少IOmg /升、20mg /升、IOOmg/升、200mg/升、300mg/升、400mg/升、500mg/升、600mg /升或700mg /升或更大)的培養(yǎng)基。
[0031]本文還描述了生產(chǎn)甜菊醇糖苷類的方法。該方法包括:在基因能得以表達(dá)的條件下，將本文所述的任意宿主培養(yǎng)在培養(yǎng)基中；和回收由宿主產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類。培養(yǎng)步驟可以包括誘導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)基因表達(dá)。甜菊醇糖苷類可以是13-0-1，2-二糖基化的和/或19-0-1，2- 二糖基化的甜菊醇糖苷類(例如，甜菊苷、甜菊醇1，2 二糖苷、萊鮑迪苷D或萊鮑迪苷E)。例如，甜菊醇糖苷類可以是萊鮑迪苷D或萊鮑迪苷E。甜菊醇糖苷類的另一些實(shí)例可以包括萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷F和杜爾可苷A。
[0032]本文還描述了重組宿主。該宿主包含:⑴編碼UGT74G1的基因；(ii)編碼UGT85C2的基因；(iii)編碼UGT76G1的基因；(iv)編碼具有將第二糖部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷或甜菊苷之19-0-葡萄糖的C-2’處之能力的糖基化轉(zhuǎn)移酶的基因；以及(V)任選的編碼UGT91D2e的基因，其中所述基因中的至少一個(gè)是重組基因。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)所述基因都是重組基因。當(dāng)宿主在每個(gè)基因(例如，重組基因)都能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生至少一種甜菊醇糖苷類(例如，萊鮑迪苷D)。宿主還可以包含:(a)編碼柯巴基二磷酸合酶和貝殼杉烯合酶雙功能的基因、或者編碼柯巴基二磷酸合酶的基因和編碼貝殼杉烯合酶的基因；(b)編碼貝殼杉烯氧化酶的基因；(c)編碼甜菊醇合成酶的基因；(d)編碼香葉基香葉基二磷酸合酶的基因。
[0033]本文還描述了由本文所述的任意宿主產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類組合物。相對(duì)于甜菊提取物，該組合物具有降低水平的來源于甜菊植物的雜質(zhì)。
[0034]在另一個(gè)方面中，本文描述了本文所述的任意宿主所產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類組合物。相對(duì)于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷類組成，該組合物具有富含萊鮑迪苷D的甜菊醇糖苷類組成。
[0035]在另一個(gè)方面中，本文描述了生產(chǎn)甜菊醇糖苷類組合物的方法。該方法包括:在每個(gè)基因都能得以表達(dá)的條件下，將本文所述的宿主培養(yǎng)在培養(yǎng)基中；和回收由宿主(例如，微生物)產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類組合物。相對(duì)于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷類組成，該組合物富含萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或杜爾可苷A。相對(duì)于甜菊提取物，所述宿主(例如微生物)所產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類組合物可以具有降低水平的來源于甜菊植物的雜質(zhì)。
[0036]本文還描述了用于將第二糖部分轉(zhuǎn)移至甜菊醇糖苷類中的19-0-葡萄糖之C-2’處或13-0-葡萄糖之C-2’處的方法。該方法包括使甜菊醇糖苷類與本文所述的EUGTll多肽或本文所述的UGT91D2多肽(例如，UGT91D2e-b)與UDP-糖在適合第二糖部分轉(zhuǎn)移到甜菊醇糖苷類上的反應(yīng)條件下接觸。甜菊醇糖苷類可以是甜葉懸鉤子苷，其中第二糖部分是葡萄糖，并且在第二葡萄糖部分轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生甜菊苷。甜菊醇糖苷類可以是甜菊苷，其中第二糖部分是葡萄糖，并且在第二葡萄糖部分轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生萊鮑迪苷E。甜菊醇糖苷類可以是萊鮑迪苷A，并且在第二葡萄糖部分轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生萊鮑迪苷D。
[0037]在如本文所公開的改進(jìn)的下游甜菊醇糖苷類途徑之另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于蔗糖合酶之重組生產(chǎn)的材料和方法；和用于在宿主中增加UDP-葡萄糖之產(chǎn)生的材料和方法，特別是在體內(nèi)增加UPD-葡萄糖的利用率，其目的是促進(jìn)細(xì)胞中的糖基化反應(yīng)；以及提供了用于降低細(xì)胞中之UDP濃度的方法。
[0038]本文還提供了重組宿主，其包含一個(gè)或更多個(gè)編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蔗糖合酶的外源核酸，其中具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase)的一個(gè)或更多個(gè)外源核酸的表達(dá)導(dǎo)致宿主中升高水平的`Μ)Ρ-葡萄糖。任選地，所述一個(gè)或更多個(gè)外源核酸包含SUSl序列。任選地，所述SUSl序列來自小果咖啡(Coffea arabica),或編碼由小果咖啡SUSl序列編碼的蔗糖合酶的功能同源物，但如本文所述可以等同地使用擬南芥(Arabidopsisthaliana)或甜葉菊SUS。在本發(fā)明的重組宿主中，所述一個(gè)或更多個(gè)外源核酸可以包含編碼具有SEQ ID NO:180中給出之序列的多肽的序列，或者與其具有至少90%同一性的氨基酸序列，并且任選地，所述一種或更多種外源核酸包含SUCl序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，SUCl序列來自擬南芥，或者SUCl序列編碼由擬南芥SUCl序列編碼的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能同源物。在重組宿主中，所述一個(gè)或更多個(gè)外源核酸可以包含編碼具有SEQ ID NO:179中給出之序列的多肽的序列，或者與其具有至少90%同一性的氨基酸序列。與缺乏所述一種或更多種外源核酸的相應(yīng)宿主相比，所述重組宿主降解外源蔗糖的能力降低。
[0039]所述重組宿主可以是微生物，例如酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)?；蛘?所述微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。在一個(gè)替選實(shí)施方案中，所述重組宿主是植物或植物細(xì)胞。
[0040]本發(fā)明還提供了用于在細(xì)胞中提高UDP-葡萄糖水平和降低UDP水平的方法，該方法包括:在包含蔗糖的介質(zhì)中，于細(xì)胞中表達(dá)重組蔗糖合酶序列和重組蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，其中所述細(xì)胞是蔗糖降解缺陷的。
[0041]本發(fā)明還提供了用于在細(xì)胞中促進(jìn)糖基化反應(yīng)的方法，其包括在包含蔗糖的介質(zhì)中，于細(xì)胞中表達(dá)重組蔗糖合酶序列和重組蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，其中該表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中降低水平的m)P和細(xì)胞中升高水平的UDP-葡萄糖，使得細(xì)胞中的糖基化增加。
[0042]在用于提高UDP-葡萄糖水平的方法或促進(jìn)糖基化的方法中，所述細(xì)胞可以產(chǎn)生香草醛葡萄糖苷(vanillin glucoside)，導(dǎo)致細(xì)胞的香草醛葡萄糖苷產(chǎn)生增加，或者可產(chǎn)生甜菊糖苷，導(dǎo)致細(xì)胞的甜菊糖苷產(chǎn)生增加。任選地，SUSl序列是擬南芥、甜葉菊或小果咖啡SUSl序列(參見例如圖17，SEQ ID N0.175-177)，或者是編碼由擬南芥、甜葉菊或小果咖啡SUSl序列編碼的蔗糖合 酶之功能同源物的序列。重組蔗糖合酶序列任選地包含編碼具有SEQ ID NO:180中給出之序列的多肽的核酸，或與其具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中任選地，重組蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列是SUCl序列，或者其中任選地，SUCl序列是擬南芥SUCl序列，或者是編碼由擬南芥SUCl序列編碼的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之功能同源物的序列，或者其中任選地，重組蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列包含編碼具有SEQ ID NO:179中給出之序列的多肽的核酸，或者與其具有至少90%同一性的氨基酸序列。在任一種方法中，所述宿主是微生物，例如酵母，任選地例如釀酒酵母?；蛘咚鏊拗骺梢允谴竽c桿菌?；蛘咚鏊拗骺梢允侵参锛?xì)胞。
[0043]本文還提供了重組宿主，例如微生物，其包含一種或更多種生物合成基因，所述基因的表達(dá)導(dǎo)致類二萜的產(chǎn)生。這樣的基因包括編碼對(duì)映-柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyldiphosphate synthase) (Q)PS) (EC5.5.1.13)的基因、編碼對(duì)映-貝殼杉稀合酶(ent-kaurene synthase)的基因、編碼對(duì)映-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase)的基因；或編碼甜菊醇合成酶的基因。所述基因中的至少之一是重組基因。所述宿主可以是植物細(xì)胞。這些基因在甜菊植物中的表達(dá)可能導(dǎo)致所述植物中提高的甜菊醇糖苷類水平。在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主還包含編碼⑶PS多肽(EC5.5.1.13)(缺少葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(chloroplast transit peptide)序列)之重組基因的多個(gè)拷貝。Q)PS多肽與圖14中所示截短的⑶PS氨基酸序列可以具有至少90%、95%、99%或100%的同一性。所述宿主還可以包含編碼KAH多肽之多個(gè)拷貝的重組基因，例如，與圖12中所示KAH氨基酸序列具有至少90%、95%、99%或100%同一性的KAH多肽。所述宿主還可以包含以下中的一個(gè)或更多個(gè):(i)編碼香葉基香葉基二磷酸合酶的基因；(ii)編碼對(duì)映-貝殼杉烯氧化酶的基因；和
(iii)編碼對(duì)映-貝殼杉烯合酶的基因。所述宿主還可以包含以下中的一個(gè)或更多個(gè):(iv)編碼截短的HMG-CoA的基因；(V)編碼CPR的基因；(vi)編碼鼠李糖合成酶的基因；(vii)編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因；和(viii)編碼UDP-葡糖醛酸脫羧酶的基因。例如，可以存在兩種或更多種外源CPR。這樣的基因中的一個(gè)或更多個(gè)的表達(dá)可以是可誘導(dǎo)的?；?br> (i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)、(vii)或(viii)中的至少一個(gè)可以是重組基因。在一些情況下，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)基因中的每一個(gè)都是重組基因。香葉基香葉基二磷酸合酶與SEQ ID NO:127中所示氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性；貝殼杉烯氧化酶與SEQ ID NO:138中所示氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性；CPR與SEQ ID NO:168中所不氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性；CPR與SEQ ID NO:170中所示氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性；并且貝殼杉烯合酶與SEQ ID NO:156中所不氨基酸序列可以具有大于90%的序列同一性。
[0044]在一個(gè)方面中，本文描述了編碼具有SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列之多肽的分離的核酸，其中所述多肽含有SEQ ID NO:5的第211和286位處的替換。例如，所述多肽可以包含第211位處的甲硫氨酸和第286位處的丙氨酸。
[0045]在一個(gè)方面中，本文描述了編碼與圖12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO:164)具有至少80%同一性(例如，至少85%、90%、95%或99%同一性)之多肽的分離的核酸。所述多肽可以具有圖12C中所示氨基酸序列。
[0046]在另一個(gè)方面中，本文描述了包含調(diào)節(jié)區(qū)的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)節(jié)區(qū)與編碼與圖12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO:164)具有至少80%同一性(例如，至少85 %、90%、95%或99%同一性)之多肽的核酸有效連接。所述多肽可以具有圖12C中所示氨基酸序列。`
[0047]本文還描述了重組宿主，其包含編碼與圖12C中所示氨基酸序列具有至少80%同一性(例如，至少85%、90%、95%或99%同一性)之KAH多肽的重組基因(例如，重組基因的多個(gè)拷貝)。所述多肽可以具有圖12C中所示氨基酸序列。所述宿主可以是微生物例如酵母菌(例如，釀酒酵母)或大腸桿菌。所述宿主可以是植物或植物細(xì)胞(例如，甜菊(Stevia)、小立碗蘚(Physcomitrella)或者煙草植物或植物細(xì)胞)。甜菊植物或植物細(xì)胞是甜葉菊植物或植物細(xì)胞。當(dāng)重組宿主在每個(gè)基因都能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生甜菊醇。所述重組宿主還可包含編碼UGT74G1多肽的基因；編碼UGT85C2多肽的基因；編碼UGT76G1多肽的基因；編碼UGT91D2多肽的基因；和/或編碼EUGTll多肽的基因。當(dāng)這樣的宿主在每個(gè)基因都能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生至少一種甜菊醇糖苷類。所述甜菊醇糖苷類可以是甜菊醇-13-葡萄糖苷、甜菊醇-19-葡萄糖苷、甜葉懸鉤子苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F和/或杜爾可苷A。所述重組宿主還可包含以下中的一種或更多種:編碼脫氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因；編碼D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)的基因；編碼4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶(CMS)的基因；編碼4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)的基因；編碼4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸合酶(MCS)的基因；編碼1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯基4- 二磷酸合酶(HDS)的基因；以及編碼1-羥基-2-甲基-2 (E)-丁烯基4-二磷酸還原酶(HDR)的基因。所述重組宿主還可以包含以下中的一個(gè)或更多個(gè):編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶的基因；編碼截短的HMG-CoA還原酶的基因；編碼甲羥戊酸激酶的基因；編碼磷酸甲羥戊酸激酶的基因；以及編碼甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的基因。在另一個(gè)方面中，本文描述了這樣的重組宿主，其還包含編碼對(duì)映-貝殼杉烯合酶(EC4.2.3.19)的基因和/或編碼赤霉素20-氧化酶(EC1.14.11.12)的基因。當(dāng)這樣的宿主培養(yǎng)在每個(gè)基因都能得以表達(dá)的條件下時(shí)產(chǎn)生赤霉素GA3。
[0048]本文還描述了分離的核酸，其編碼與圖13中所示甜葉菊CPR氨基酸序列具有至少80%序列同一性(例如，至少85%、90%、95%或99%序列同一性)的CPR多肽。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有圖13中所示甜葉菊CPR氨基酸序列(SEQ ID NO:169和170)。
[0049]在本文所述的任意宿主中，一個(gè)或更多個(gè)基因的表達(dá)可以是可誘導(dǎo)的。
[0050]在本文所述的任意宿主中，可以缺失或破壞一個(gè)或更多個(gè)編碼內(nèi)源磷酸酶的基因以使內(nèi)源磷酸酶的活性降低。例如，可以破壞或缺失酵母基因DPPl和/或LPPl以使法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)向法尼醇的降解減少，并且香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)向香葉基香葉醇(geranylgeraniol,GGOH)的降解減少。
[0051]在另一個(gè)方面中，如本文所述，可以按照下文所定義來修飾ERG9，導(dǎo)致角鯊烯合酶(SQS)的產(chǎn)生減少和類萜前體的累積。所述前體可以分泌到培養(yǎng)基中或者可以不分泌到培養(yǎng)基中，并且可以進(jìn)而用作能夠?qū)㈩愝魄绑w代謝為期望的類萜的酶的底物。
[0052]因此，在一個(gè)主要 的方面中，本發(fā)明涉及包含核酸序列的細(xì)胞，所述核酸包含:
[0053]i)啟動(dòng)子序列，其有效連接至
[0054]ii)異源插入序列，其有效連接至
[0055]iii)開放閱讀框，其有效連接至
[0056]iv)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；
[0057]其中異源插入序列具有通式⑴:
[0058]-X1-X2-X3-X4-X5-,
[0059]其中，X2包含與X4的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)并且形成發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸，并且
[0060]其中X3是任選的，并且如果存在的話，包含參與在X2與X4之間形成發(fā)夾環(huán)的不成對(duì)核苷酸，并且
[0061]其中X1和X5獨(dú)立地且任選地包含一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，并且
[0062]其中開放閱讀框通過表達(dá)編碼與角鯊烯合酶(EC2.5.1.21)具有至少70%同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段與所述角鯊烯合酶具有至少70%序列同一性的片段在至少100個(gè)氨基酸重疊的范圍內(nèi)。
[0063]本發(fā)明的細(xì)胞可用于提高工業(yè)上令人關(guān)注的類萜的產(chǎn)率。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)通過鯊烯途徑合成的類萜化合物的方法，所述方法包括以下步驟:
[0064](a)提供如上文所定義的細(xì)胞；
[0065](b)培養(yǎng)(a)的細(xì)胞；[0066](c)回收類萜產(chǎn)物化合物。
[0067]通過提供如上文所定義的包含經(jīng)遺傳修飾構(gòu)建體的細(xì)胞，增加類萜前體的累積(參見，例如，圖20)。
[0068]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)來源于選自以下的類萜前體的類萜的方法:法尼基焦磷酸(FPP)、異戊二烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香葉基焦磷酸(GPP)和/或香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)，所述方法包括:
[0069](a)使所述前體與角鯊烯合酶途徑的酶相接觸，
[0070](b)回收所述類萜產(chǎn)物。
[0071]本發(fā)明可以通過至少部分地、空間上阻止核糖體與RNA的結(jié)合從而減少角鯊烯合酶的翻譯來進(jìn)行。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于降低功能性角鯊烯合酶(EC2.5.1.21)之翻譯速率的方法，所述方法包括:
[0072](a)提供上文所定義的細(xì)胞，
[0073](b)培養(yǎng)(a)的細(xì)胞。
[0074]類似地，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于減少法尼基-PP周轉(zhuǎn)(turnover)為角鯊烯的方法，所述方法包括:
[0075](a)提供上文所定義的細(xì)胞，
[0076](b)培養(yǎng)(a)的細(xì)胞。
[0077]如圖20所示，ERG9的敲減導(dǎo)致前體到角鯊烯合酶的累積。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于增加選自以下之化合物的累積的方法:法尼基焦磷酸、異戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香葉基焦磷酸以及香葉基香葉基焦磷酸，所述方法包括以下步驟:
[0078](a)提供上文所定義的細(xì)胞，和
[0079](b)培養(yǎng)(a)的細(xì)胞。
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)以及可以由香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)制備的其他類萜的生產(chǎn)。
[0081]在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，上述角鯊烯合酶(SQS)生產(chǎn)的減少可以與香葉基香葉基焦磷酸合酶(GGPPS)活性的升高組合，其將FPP轉(zhuǎn)化為香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)，導(dǎo)致GGPP產(chǎn)生增加。
[0082]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含核酸序列的微生物細(xì)胞，所述核酸包含:
[0083]i)啟動(dòng)子序列，其有效連接至
[0084]ii)異源插入序列，其有效連接至
[0085]iii)開放閱讀框，其有效連接至
[0086]iv)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；
[0087]其中，異源插入序列和開放閱讀框如上文所定義，
[0088]其中所述微生物細(xì)胞還包含編碼GGPPS的異源核酸，該異源核酸與在所述細(xì)胞中指導(dǎo)GGPPS表達(dá)的核酸序列有效連接。
[0089]此外，本文還涉及用于生產(chǎn)甜菊醇或甜菊醇糖苷類的方法，其中所述方法包括使用上述微生物細(xì)胞中的任意一種。
[0090]本文所述的任意宿主可以是微生物(例如，酵母例如釀酒酵母或大腸桿菌)或植物或植物細(xì)胞(例如，甜菊例如甜葉菊、小立碗蘚或者煙草植物或植物細(xì)胞)。
[0091]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。雖然在下文中描述了合適的方法和材料，但與本文所述的方法和材料類似或等同的方法和材料也可以用于實(shí)施本發(fā)明。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和本文中提及的其他參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。在存在矛盾的情況下，以本說明書包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅用于舉例說明的目的而無(wú)意于限制。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將由以下詳述而明顯。 申請(qǐng)人:保留按照專利法的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，使用過渡短語(yǔ)“包含”、“基本由...組成”或者“由...組成”替代地要求保護(hù)任意公開的發(fā)明的權(quán)利。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0092]圖1是多種甜菊醇糖苷類的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0093]圖2A-D示出由甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷類的代表性途徑。
[0094]圖3是用EUGTll和UGT91D2e進(jìn)行的19_0_1，2_ 二糖基化反應(yīng)的示意性圖。數(shù)字是來自液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)層析圖的反應(yīng)底物或產(chǎn)物的平均信號(hào)密度。
[0095]圖4包含LC-MS層析圖，其示出使用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的UGT91D2e (SEQ ID NO:5)(左圖)或EUGTll (SEQ ID NO:152)(右圖)由萊鮑迪苷A(RebA)生產(chǎn)萊鮑迪苷D (RebD)。LC-MS設(shè)置為檢測(cè)某些對(duì)應(yīng)于甜菊醇+5個(gè)葡萄糖(例如RebD)、甜菊醇+4個(gè)葡萄糖(例如RebA)等的質(zhì)量。每個(gè)“泳道”根據(jù)最高峰來標(biāo)度(scaled)。
[0096]圖5包含LC-MS層析圖，其示出用UGT91D2e (左圖)和EUGTll (右圖)來將甜葉懸鉤子苷轉(zhuǎn)化成甜菊苷和化合物'2'和'3' (RebE)。
[0097]圖6 是EUGT11(SEQ ID NO: 152，上面的行)的氨基酸序列與 UGT91D2e (SEQ ID NO:5，下面的行)的氨基酸序列的比對(duì)。
[0098]圖7包含EUGTlI (SEQ ID NO:152)的氨基酸序列、編碼EUGTlI的核苷酸序列(SEQID NO: 153)以及密碼子經(jīng)過優(yōu)化用于在酵母中表達(dá)的編碼EUGTll的核苷酸序列(SEQ IDNO:154)。
[0099]圖8是UGT91D2e與UGT85H2和UGT71G1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的比對(duì)。通過在互聯(lián)網(wǎng)站(world wide web) cbs.dtu.dk / services / NetSurfP /，對(duì)三種 UGT 的氨基酸序列進(jìn)行NetSurfPver.1.1-蛋白質(zhì)表面可及性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(Protein Surface Accessibilityand Secondary Structure Predictions)來進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。這預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中α螺旋、β折疊和卷曲的存在和位置。后來將這些標(biāo)記為UGT91D2e所示。例如,第一 N-末端β折疊標(biāo)記為N β I。y軸代表預(yù)測(cè)的確定性，確定性越高，則置信度越高，X軸代表氨基酸位置。盡管這些UGT之間的一級(jí)序列同一性非常低，但二級(jí)結(jié)構(gòu)示出非常高的保守度。
[0100]圖9是UGT91D1和UGT91D2e(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的比對(duì)。
[0101]圖10是UGT91D2e的雙氨基酸替換突變體之活性的柱狀圖。實(shí)心柱代表甜菊苷產(chǎn)生，空心柱代表1，2-二糖苷產(chǎn)生。
[0102]圖11是用于甜菊醇糖苷類之生物合成的UDP-葡萄糖再產(chǎn)生的示意圖。SUS=蔗糖合酶；甜菊醇=甜菊醇或甜菊醇糖苷類底物；UGT=UDP糖基轉(zhuǎn)移酶。
`[0103]圖12A是編碼甜葉菊KAH的核苷酸序列(SEQ ID NO:163)，在本文中命名為SrKAHeI。[0104]圖12B是經(jīng)過密碼子優(yōu)化用于在酵母中表達(dá)的編碼甜葉菊KAHel的核苷酸序列(SEQ ID NO:165)。
[0105]圖12C是甜葉菊KAHel的氨基酸序列(SEQ ID NO:164)。
[0106]圖13A包含來自以下之CPR多肽的氨基酸序列:釀酒酵母(由NCPl基因編碼)(SEQ ID NO:166)、擬南芥(由ATRl編碼和由ATR2編碼)(SEQ ID NO:148和168)以及甜葉菊(由CPR7編碼和由CPR8編碼)(SEQ ID NO:169和170)。
[0107]圖13B包含:密碼子經(jīng)過優(yōu)化用于在酵母中表達(dá)的ATRl核苷酸序列(登錄號(hào)CAA23011) (SEQ ID NO:171);密碼子經(jīng)過優(yōu)化用于在酵母中表達(dá)的ATR2核苷酸序列(SEQID NO:172);甜葉菊CPR7核苷酸序列(SEQ ID NO:173);以及甜葉菊CPR8核苷酸序列(SEQID NO:174)。
[0108]圖14A包含編碼來自玉米(Zea mays)的CDPS多肽(SEQ ID NO:158)的核苷酸序列(SEQ ID NO:157)?？梢匀笔б源煮w和下劃線示出的序列以移除編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的序列。
[0109]圖14B包含來自玉米的⑶PS多肽(SEQ ID NO:158)的氨基酸序列。可以缺失以粗體和下劃線示出的序列以移除葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。
[0110]圖15A包含密碼子經(jīng)過優(yōu)化的編碼來自藤倉(cāng)赤霉(Gibberella fujikuroi)的雙功能CDPS-KS多肽(SEQ ID NO:162)的核苷酸序列(SEQ ID NO:161)。圖15B包含來自藤倉(cāng)赤霉的雙功能CDPS-KS多肽(SEQ ID NO:162)的氨基酸序列。
[0111]圖16是兩種釀酒酵母菌株(增強(qiáng)的EFSC1972(命名為T2)和擬南芥貝殼杉烯合酶(KS-5)進(jìn)一步過表達(dá)的增強(qiáng)的EFSC1972(命名為T7，正方形)的生長(zhǎng)圖。Y軸上的數(shù)字是細(xì)胞培養(yǎng)物的0D600值，而X軸上的數(shù)字代表在30°C下，在合成的完全培養(yǎng)基(syntheticcomplete based medium)中 培養(yǎng)的小時(shí)數(shù)。
[0112]圖17包含編碼擬南芥、甜葉菊(來自重疊群10573選擇_0RF SI 1E，具有以粗體、小寫字母示出的Sll至谷氨酸(E)之改變的突變)和咖啡(小果咖啡)蔗糖合酶的核酸序列，分別為 SEQ ID NO:175、176 和 177。
[0113]圖18是通透化釀酒酵母中rebD產(chǎn)生的柱狀圖，所述釀酒酵母已轉(zhuǎn)化有EUGTll或空質(zhì)粒(“空”)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在PBS緩沖液中洗滌，然后在30°C下，用TritionX-100 (0.3%或0.5%在PBS中)處理30分鐘。在通透化之后，在PBS中洗滌細(xì)胞，并在包含100 μ M RebA和300 μ M UDP-葡萄糖的反應(yīng)混合物中重懸。在30°C下，反應(yīng)進(jìn)行20小時(shí)。
[0114]圖19A是擬南芥UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT72E2的氨基酸序列(SEQ ID NO:178)。
[0115]圖19B是來自擬南芥的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUCl的氨基酸序列(SEQ ID NO:179)。
[0116]圖19C是來自咖啡的蔗糖合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:180)。
[0117]圖20是酵母中的類異戊二烯途徑的示意圖，其示出ERG9的位置。
[0118]圖21包含釀酒酵母Cycl啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 185)和釀酒酵母Kex2啟動(dòng)子(SEQID NO:186)的核苷酸序列。
[0119]圖22是包含兩個(gè)區(qū)HRl和HR2的PCR產(chǎn)物的示意圖，HRl和HR2分別與ERG9開放閱讀框(ORF)之5’端或ER9啟動(dòng)子中的基因組序列的一部分同源。此外，PCR產(chǎn)物上有抗生素標(biāo)記NatR，其可以嵌入兩個(gè)Lox位點(diǎn)(L)之間用于后續(xù)用Cre重組酶切除。PCR產(chǎn)物還可以包含啟動(dòng)子，例如野生型ScKex2、野生型ScCycl，并且該啟動(dòng)子還可以包含其3’端的異源插入序列例如發(fā)夾(S EQ ID NO =181-184)(參見圖23)。
[0120]圖23是啟動(dòng)子和在翻譯起始位點(diǎn)(箭頭)的緊上游處具有發(fā)夾莖環(huán)的ORF的示意圖，以及野生型釀酒酵母Cycl啟動(dòng)子序列之一部分和ERG90PR的初始ATG的比對(duì)，所述比對(duì)為不含異源插入序列(SEQ ID NO:187)和含有四個(gè)不同的異源插入序列(SEQ IDN0.188-191)的比對(duì)。75%是指包含ScCycl啟動(dòng)子接著SEQ ID NO:184的構(gòu)建體(SEQ IDNO:191) ;50%是指包含 ScCycl 啟動(dòng)子接著 SEQ ID NO:183 的構(gòu)建體(SEQ ID NO:190)；20%是指包含ScCycl啟動(dòng)子接著SEQ ID NO:182的構(gòu)建體(SEQ ID NO:189) ;5%是指包含 ScCycl 啟動(dòng)子接著 SEQ ID NO:181 的構(gòu)建體(SEQ ID NO:188)。
[0121]圖24是示出用在宿主基因組的ERG9基因之前插入的不同啟動(dòng)子構(gòu)建體在酵母菌株中產(chǎn)生的紫穗槐二烯的柱狀圖。CTRL-ADS是指沒有修飾的對(duì)照菌株；ERG9-CYC1-100%是指包含ScCycl啟動(dòng)子且沒有插入序列的構(gòu)建體；ERG9-CYCl-50%是指包含ScCycl啟動(dòng)子接著 SEQ ID NO:183 的構(gòu)建體(SEQ ID NO:190) ;ERG9-CYC1_20%是指包含 ScCycl 啟動(dòng)子接著 SEQ ID NO:182 的構(gòu)建體(SEQ ID NO:189)。ERG9_CYC1_5%是指包含 ScCycl 啟動(dòng)子接著 SEQ ID NO:181 的構(gòu)建體(SEQ ID NO:188)。ERG9-KEX2_100%是指包含 ScKex2 啟動(dòng)子的構(gòu)建體。
[0122]圖25包含來自以下的角鯊烯合酶多肽的氨基酸序列:釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂亞羅酵母(Yarrowia Iipolytica)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii) > Cyberlindnera jadini1、白色念珠菌(Candida albicans)、釀酒酵母、智人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)以及褐家鼠(Rattus norvegicus) (SEQ ID NO: 192-202);和來自構(gòu)巢曲霉(Aspergilusnidulans)和釀酒酵母的香葉基香葉基二磷酸合酶(GGPPS)的氨基酸序列(SEQ ID N0203和 167)。
[0123]圖26是在72小時(shí)后ERG9-CYC1-5 %菌株和ERG9-KEX2菌株中香葉基香葉醇(GGOH)累積的柱狀圖。
[0124]圖27是示出對(duì)于通過UGT91D2e和EUGTll來生產(chǎn)RebF的甜葉懸鉤子苷轉(zhuǎn)化為木糖化中間體的代表性層析圖。
[0125]在不同的附圖中，相同的附圖標(biāo)記表示相同的元件。
[0126]發(fā)明詳述
[0127]本文基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即可以開發(fā)重組宿主例如植物細(xì)胞、植物或微生物來表達(dá)可用于生物合成甜菊醇糖苷類的多肽，所述甜菊醇糖苷類例如萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或杜爾可苷A。本文所述的重組宿主特別地可用于生產(chǎn)萊鮑迪苷D。這樣的宿主可以表達(dá)一種或更多種適合產(chǎn)生甜菊醇糖苷類的尿苷5’- 二磷酸(UDP)糖基轉(zhuǎn)移酶。這些生物合成多肽在多種微生物類別(classis)中的表達(dá)使得可以由能量和碳源(例如糖、甘油、C02、H2和陽(yáng)光)以持續(xù)、可重復(fù)的方式產(chǎn)生甜菊醇糖苷類。重組宿主產(chǎn)生的每種甜菊醇糖苷類的比例可以通過將預(yù)先選定的生物合成酶引入宿主并以合適的水平表達(dá)這些酶來調(diào)整，從而產(chǎn)生具有一致口味特征譜的甜味劑組合物。此外，重組宿主產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類的濃度預(yù)期比甜菊植物中產(chǎn)生的甜菊醇糖苷類水平更高，這樣可以提高下游純化的效率。相對(duì)甜菊提取物中存在的雜質(zhì)的量，這樣的甜味劑組合物含有極少甚至沒有植物基雜質(zhì)。
[0128]所述基因中至少有一個(gè)是重組基因，具體的重組基因取決于所選用于使用的物種或菌株。為了提高甜菊醇糖苷類的產(chǎn)量，提高能量和碳源轉(zhuǎn)化為甜菊醇及其糖苷的效率，和/或提高細(xì)胞培養(yǎng)物或植物的產(chǎn)率，可以包含進(jìn)其他基因或生物合成模塊。這樣的其他生物合成模塊包括參與合成類萜前體、異戊二烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸的基因。其他生物合成模塊包括萜合酶和萜環(huán)化酶基因，例如編碼香葉基香葉基二磷酸合酶和柯巴基二磷酸合酶的基因；這些基因可以是內(nèi)源基因或重組基因。
[0129]1.甜菊醇和甜菊醇糖苷類生物合成多肽
[0130]A.甜菊醇生物合成多肽
[0131]甜菊提取物中發(fā)現(xiàn)的幾種化合物包括二萜甜菊醇和各種甜菊醇糖苷類的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1中。下表A中示出了它們的CAS編號(hào)。另參見Harriet Wallin, Food Agric.0rg.(2007)準(zhǔn)備的 Steviol Glycosides Chemicaland Technical Assessment 第 69 屆TECFA。
[0132]表A
[0133]
【權(quán)利要求】
1.重組宿主，其包含編碼與SEQID NO:152中所示氨基酸序列具有至少約80%同一性之多肽的重組基因； 所述宿主任選地包含以下中的一個(gè)或更多個(gè): (a)重組基因，其編碼UGT91d2e或UGT91d2m多肽，例如，在SEQID NO:5的第211和286位殘基處具有替換的UGT91d2e多肽，例如UGT91D2e_b，其在SEQ ID NO:5的第211位殘基處具有甲硫氨酸和在第286位殘基處具有丙氨酸； (b)重組基因，其編碼與圖12C中所示氨基酸序列(SEQID NO:164) (KAHel)具有約80%同一性之甜菊醇合酶多肽； (c)重組基因，其編碼缺少葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽之對(duì)映-柯巴基二磷酸合酶(EC5.5.1.13 ；⑶PS)多肽； (d)一種或更多種外源核酸，其編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如擬南芥的SUCl序列和蔗糖合酶例如小果咖啡、擬南芥或甜葉菊的SUSl序列，特別地，其中所述一種或更多種外源核酸的表達(dá)和糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)導(dǎo)致所述宿主中尿苷二磷酸葡萄糖(M)P-葡萄糖)水平提高； (e)重組基因，其編碼與圖13中所示甜葉菊CPR氨基酸序列(SEQID NO: 170)具有至少約80%序列同一性之CPR多肽； (f)核酸序列，所述核酸包含與開放閱讀框有效連接的異源插入序列，其中所述異源插入序列具有通式(I):
-X1-X2-X3-X4-X5-⑴， 其中，X2包含與X4的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸，其中X3包含零個(gè)核苷酸或者形成發(fā)夾環(huán)的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，其中X1和X5各自獨(dú)立地由零個(gè)核苷酸或者一個(gè)或更多個(gè)核苷酸組成，其中所述開放閱讀框編碼角鯊烯合酶(EC2.5.1.21)； (g)—個(gè)或更多個(gè)外源核酸，其編碼甜葉菊KO多肽，所述多肽包含與SEQID NO:138具有至少約80%同一性的序列，和擬南芥CPR多肽例如SEQ ID NO:168 ； (h)重組基因，其編碼擬南芥KS多肽，所述多肽包含與SEQID NO:156具有至少約80%同一性的序列； (i)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的重組基因，其編碼UGT85C;和 (j)重組基因，其編碼GGPPS。
2.重組宿主，其包含編碼與圖12C中所示氨基酸序列(SEQID NO: 164)具有至少約80%同一‘注之多肽的重組基因，例如約85%同一性、約90%同一性、約95%同一性或約100%同一性。
3.重組宿主細(xì)胞，其包含核酸序列，所述核酸序列包含與開放閱讀框有效連接的異源插入序列，其中所述異源插入序列具有通式(I):
-X1-X2-X3-X4-X5- 其中，X2包含與X4的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸， 其中X3包含零個(gè)核苷酸或者形成發(fā)夾環(huán)的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸， 其中X1和X5各自獨(dú)立地由零個(gè)核苷酸或者一個(gè)或更多個(gè)核苷酸組成， 其中所述開放閱讀框編碼角鯊烯合酶(EC2.5.1.21)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞，其中所述核酸序列包含: i)啟動(dòng)子序列，其有效連接至ii)異源插入序列，其有效連接至 iii)開放閱讀框，其有效連接至 iv)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)； 其中所述異源插入序列具有通式(I):
-X1-X2-X3-X4-X5-⑴， 其中，X2包含與X4的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)并且形成莖二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的至少4個(gè)連續(xù)核苷酸，并且其中X3包含在X2與X4之間形成發(fā)夾環(huán)的核苷酸，并且其中X1和X5獨(dú)立地并且任選地包含一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，并且 其中所述開放閱讀框通過表達(dá)編碼與角鯊烯合酶(EC2.5.1.21)具有至少約70%同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段在至少100個(gè)氨基酸重疊的范圍內(nèi)與所述角鯊烯合酶具有至少約70%序列同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞還包含編碼GGPPS的異源核酸，其與在所述細(xì)胞中指導(dǎo)GGPPS表達(dá)的核酸序列有效連接。
6.重組宿主，其包含重組基因，所述重組基因編碼缺少葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的對(duì)映-柯巴基二磷酸合酶(EC5.5.1.13 ;CDPS)多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主，其中所述多肽是玉米CDPS，其從未經(jīng)修飾的玉米CDPS多肽的羧基末端缺少50 個(gè)氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的宿主，所述宿主還包含以下中的一個(gè)或更多個(gè): 編碼與SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列具有約90%或更大同一性之UGT85C多肽的重組基因； 編碼與SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列具有約90%或更大同一性之UGT76G多肽的重組基因； 編碼UGT74G1多肽的基因例如重組基因；以及 編碼UGT91D2功能性同源物的基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的宿主，所述宿主還包含以下中的一個(gè)或更多個(gè): (i)編碼香葉基香葉基二磷酸合酶的基因； (?)編碼柯巴基二磷酸合酶和貝殼杉烯合酶雙功能的基因，或者編碼柯巴基二磷酸合酶例如與SEQ ID NO =129-131中所示氨基酸序列具有至少約90%序列同一性之柯巴基二磷酸合酶的基因以及編碼貝殼杉烯合酶例如與SEQ ID NO:132-135或SEQ ID NO:156中所示氨基酸序列之一具有至少約90%序列同一性之貝殼杉烯合酶的基因； (iii)編碼貝殼杉烯氧化酶例如與SEQID NO: 138-141中所示氨基酸序列之一具有至少約90%序列同一性之貝殼杉烯氧化酶的基因； (iv)編碼甜菊醇合成酶例如與SEQID NO =142-146和164中所示氨基酸序列之一具有至少約90%序列同一性之甜菊醇合成酶的基因； (V)編碼截短的HMG-CoA的基因； (vi)編碼CPR的基因； (vii)編碼鼠李糖合成酶的基因；(Viii)編碼m)P-葡萄糖脫氫酶的基因；以及 (ix)編碼UDP-葡糖醛酸脫羧酶的基因，特別地，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)之基因中的至少之一是重組基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的宿主，其中所述宿主是微生物，例如酵母例如釀酒酵母。
11.一種產(chǎn)生甜菊醇糖苷類的方法，其包括: a)在所述基因得以表達(dá)、例如誘導(dǎo)所述基因中一種或更多種表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的宿主， b)回收由所述宿主產(chǎn)生的所述甜菊醇糖苷類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在轉(zhuǎn)化有EUGT11多肽的通透化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生所述甜菊醇糖苷類。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷類是萊鮑迪苷A，并且其中通過從糖供體轉(zhuǎn)移葡萄糖部分至萊鮑迪苷A產(chǎn)生萊鮑迪苷D。
14.一種用于在細(xì)胞中提高m)P-葡萄糖水平和降低UDP水平的方法，所述方法包括在含有蔗糖的培養(yǎng)基中于所述細(xì)胞中表達(dá)重組蔗糖合酶和重組蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中所述細(xì)胞是蔗糖降解缺陷型的，或者其中所述表達(dá)導(dǎo)致所述細(xì)胞中UDP水平降低和UDP-葡萄糖水平提高，使得所述細(xì)胞 中的糖基化增加。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK103732753SQ201280038853
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月8日
【發(fā)明者】延斯·霍頓-拉森, 保拉·M·希克斯, 邁克爾·內(nèi)斯比, 通格·托馬斯·厄斯特高, 約恩·漢森, 邁克爾·達(dá)爾格德米克爾森, 漢森·埃斯本·哈爾克耶爾, 埃內(nèi)斯托·西蒙, 薩比娜·德安德雷德佩雷拉塔瓦雷斯 申請(qǐng)人:埃沃爾瓦公司