使用水解酶來增加廢物流中的單體含量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于富集環(huán)烷氧化工藝混合的有機廢物流中的單體含量的方法。具體地，所述方法涉及將生物催化劑與來自環(huán)烷氧化工藝的混合的有機廢物流組合，并將所述廢物流的二聚體和/或寡聚體組分酶促轉(zhuǎn)化成單體組分。所述方法可富集混合的有機廢物流中二酸、己二酸和/或其他α,ω-雙官能C6烷的含量。另外，經(jīng)處理的混合的有機廢物流可具有改進的燃燒效率。
【專利說明】使用水解酶來增加廢物流中的單體含量
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月17日提交的臨時申請N0.61/498404和2011年11月11日提交的臨時申請N0.61/558718的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過提述完整并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及用于從工業(yè)環(huán)烷氧化的廢物流富集單體組分、二酸和己二酸濃度、和/或產(chǎn)生α，ω-雙官能烷的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]尼龍是一般通過二胺與二羧酸、ω-氨基酸或內(nèi)酰胺的縮合聚合作用合成的聚酰胺。尼龍的一種常見變體是尼龍6，6，其通過六亞甲基二胺和己烷-1，6-雙酸(己二酸)的反應(yīng)形成?；蛘?，尼龍6可通過己內(nèi)酰胺的開環(huán)聚合作用合成。因此，己烷-1，6-雙酸(己二酸)、氨基己酸、六甲基二胺和己內(nèi)酰胺均是尼龍生產(chǎn)中的重要中間物(Anton，Α.和 Baird, B.R.2005.Polyamides, Fibers.Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology)。
[0006]在工業(yè)上，這些中間物已使用基于石油化學(xué)品的原料合成。在目前使用的商業(yè)性工藝中，用于生產(chǎn)己二酸和己內(nèi)酰胺的起始材料是環(huán)己烷，其然后在一系列步驟中經(jīng)空氣氧化以形成環(huán)己酮(K)和環(huán)己醇(A)的混合物，其中該混合物稱為KA油。對于己二酸，KA油在后續(xù)步驟中經(jīng)由硝酸氧化而氧化成己二酸。對于己內(nèi)酰胺，環(huán)己酮經(jīng)由幾個公知的步驟轉(zhuǎn)化成己內(nèi)酸胺(Oppenheim, J.P.和 Dickerson, G.L.2003.Adipic Acid.Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology)。該工藝和各種改進已披露于美國專利 N0.2，439，513 ;2，557，282 ;2，791，566 ;2，840，607 ;2，971，010 和 3，338，959。
`[0007]在環(huán)己烷到KA油的空氣氧化中，產(chǎn)生大量體積的廢物流，其包含二羧酸、一元酸、羥基酸、環(huán)己酮、環(huán)己醇和它們的酯/寡聚體的混合物。這些廢物流被稱為不揮發(fā)性殘余物(NVR)、水洗物或COP酸流。已有大量關(guān)于從這些混合物回收材料的化學(xué)方法和工藝的公開出版物，如美國專利N0.4，058，555。然而，從這些流回收碳受制于低產(chǎn)量，且大部分碳未被利用。
[0008]經(jīng)濟和環(huán)境考慮保證了對石油化學(xué)品原料環(huán)己烷的更有效的碳利用。在數(shù)十年前，對來自苛性(caustic)環(huán)己基氫過氧化物(CHHP)分解過程的NVR中組分作為發(fā)酵底物的利用進行了簡單研究(Ramsay 等，Applied&Environmental Microbiology, 1986, 52(1):152-156)，但迄今為止由于這些流對微生物的高毒性性質(zhì)，尚未開發(fā)出用于這些廢物流處理或用于利用這些廢物流中碳的生物學(xué)工藝。如此，這些廢物流需要通過燃燒進行處置，而且根據(jù)流的性質(zhì)這可能需要在專門設(shè)計的焚化爐中燃燒。
[0009]因此，需要用于更有效地利用在這些廢物流中損失的碳和/或?qū)⑻嫁D(zhuǎn)化成有用產(chǎn)品的其他方法，而非出于燃料值燃燒它或棄去它。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明經(jīng)由酶、天然和非天然存在的微生物的使用以改進混合的有機廢物流的特性和組成，從而解決此需要和其他需要。具體地，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以使用酶和微生物將來自商業(yè)性環(huán)烷氧化(例如環(huán)己烷氧化)的這些混合的有機廢物流(例如，NVR、COP酸和水洗廢物流)中存在的化學(xué)物的復(fù)雜毒性混合物的組分進行轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生富集有單體的流，所述單體隨后可轉(zhuǎn)化成有用的化合物如多元醇、二酸、尼龍中間物或可轉(zhuǎn)化成尼龍中間物的前體，或聚氨酯(polyurethane)中間物，盡管這些混合物中的組分有生物毒性。這使得能夠從商業(yè)性環(huán)烷氧化工藝回收和/或重復(fù)利用副產(chǎn)物，如此提供更經(jīng)濟和更可持續(xù)的工藝。
[0012]具體地，發(fā)明人已鑒定出其中可使用特定酶來將不可用的C6組分(在NVR和COP酸中以寡聚體酯存在)的相當(dāng)大的量轉(zhuǎn)化成單體的方法。一旦可作為單體獲得，水解的混合物中的組分即可以高得多的產(chǎn)率化學(xué)轉(zhuǎn)化成有用的產(chǎn)物如多元醇。
[0013]或者，可利用代謝工程化的微生物將這些單體轉(zhuǎn)化成有用的產(chǎn)物，如二酸、1，6-己二酸(己二酸)、或可用于生產(chǎn)聚合物的其他C6化合物的混合物，所述其他C6化合物例如
1,6-己二醇、己內(nèi)酯、6-氨基己酸、六亞甲基二胺和己內(nèi)酰胺。
[0014]發(fā)明人亦已鑒定出戊內(nèi)酯是NVR中的抑制性組分。通過處理混合的有機廢物流以除去或減少混合物中存在的戊內(nèi)酯量，不能在NVR中自然生長的宿主細(xì)胞能在存在經(jīng)處理混合物的情況下生長，并催化其他混合的有機廢物流組分轉(zhuǎn)化成期望的化合物。
[0015]因此，本發(fā)明提供用于富集環(huán)烷氧化工藝混合的有機廢物流，例如NVR、COP酸或水洗廢物流中的單體含量的方法，其通過將生物催化劑與來自環(huán)烷氧化工藝的混合的有機廢物流組合，并將所述廢物流的二聚體和/或寡聚體組分酶促轉(zhuǎn)化成單體組分。
[0016]在一些實施方案中，水解混合的有機廢物流中的寡聚體酯組分以增加流中單體組分的量。在一個方面，所述方法包括用生物催化劑處理所述混合的有機廢物流，所述生物催化劑包含至少一種水解酶、天然存在的宿主細(xì)胞或非天然存在的宿主細(xì)胞，其將所述廢物流中的寡聚體酯水解成單體并增加混合的有機廢物流中的單體組分量。
[0017]在另一個方面，所述方法包括用天然或非天然存在的宿主細(xì)胞處理混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地將所述廢物流中的至少一部分寡聚體酯水解成單體，將混合的有機廢物流中的至少一部分內(nèi)酯水解成羥基酸，或?qū)⑺龌旌系挠袡C廢物流中存在的至少一部分直鏈C4-C6 —元酸、羥基酸和含氧酸(oxo-acid)氧化成相應(yīng)的二酸，增加混合的有機廢物流中的單體組分量。
[0018]在一個方面，所述生物催化劑是分離的酶或由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶。在另一個方面，所述生物催化劑是非天然存在的宿主細(xì)胞，其分泌作用于寡聚體酯或內(nèi)酯的內(nèi)源性或異源性水解酶和/或具有ω-羥基化途徑以將一元酸轉(zhuǎn)化成二酸和/或環(huán)己醇降解途徑以將環(huán)己醇和環(huán)己酮轉(zhuǎn)化成己二酸。所述生物催化劑還可具有削弱的經(jīng)由β -氧化降解己二酸、6-羥基己酸和/或己酸的能力。全細(xì)胞生物催化劑還可表達(dá)將羥基己酸、6-氧己酸和己二酸轉(zhuǎn)化成α，ω-雙官能烷的酶，其中官能團選自-0H、-C00H和-ΝΗ2。
[0019]在一個方面，寡聚體酯到單體的水解由分離的或固定化的水解酶，或由天然或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間催化。
[0020] 在另一個方面，所述水解酶(EC3.1.1._)是脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角質(zhì)酶(EC3.1.1.74)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、內(nèi)酯水解酶如1,4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)、或其組合。
[0021 ] 在一個方面，寡聚體酯到單體的水解由在酸性pH、生理學(xué)pH或堿性pH有活性的水解酶催化。在另一個方面，將混合的有機廢物流用非天然存在的宿主細(xì)胞處理，所述宿主細(xì)胞能在PH5.0-8.0利用并轉(zhuǎn)化廢物流中的碳源。
[0022]在一個方面，用水解酶處理降低混合的有機廢物流的粘度以改進流的燃燒效率和/或準(zhǔn)備該流用于進一步化學(xué)或生物學(xué)處理。具體地，經(jīng)處理的混合的有機廢物流可燃燒用于燃料值或產(chǎn)生合成氣，或者經(jīng)處理的混合的有機廢物流的一種或多種組分用于酯化以產(chǎn)生混合的酯或多元醇、氫化為二醇、氧化為二酸、還原性氨基化、磺化、或用NH4OH或多胺處理。
[0023]在一個方面，寡聚體酯到單體的水解與另外的分離、化學(xué)轉(zhuǎn)化或通過生物催化劑的酶促轉(zhuǎn)化同時進行?；蛘撸丫垠w酯到單體的水解在另外的分離、化學(xué)轉(zhuǎn)化或通過生物催化劑的酶促轉(zhuǎn)化之前進行。
[0024]在一些實施方案中，不揮發(fā)性殘余物、COP酸或水洗物中的C4-C6 —元酸和羥基酸被轉(zhuǎn)化成二酸，其通過用天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞處理混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞能夠?qū)⒅辽僖徊糠值墓丫垠w酯水解成單體；將至少一部分的內(nèi)酯水解成羥基酸；和/或?qū)⑺龌旌嫌袡C酸流中至少一部分的直鏈C4-C6 —元酸、羥基酸和含氧酸氧化成相應(yīng)的二酸。在一個方面，二酸混合物在分離成C4、C5、或C6 二酸之前進行酯化。
[0025]在另一個方面，將混合的有機廢物流用非天然存在的宿主細(xì)胞處理，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地將至少一部分寡聚體酯水解成單體；將至少一部分戊內(nèi)酯水解成5-羥基-戊酸；將至少一部分己酸、6-羥基己酸和6-氧己酸氧化成己二酸；將廢物流的至少一部分環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成己二酸；將所述混合的有機廢物流中存在的至少一部分C3、C4和C5組分分解代謝；和/或以低于C3、C4和C5組分的速率分解代謝所述混合的有機廢物流中的C6組分。這類處理增加己二酸在流中的相對濃度并降低一元酸和羥基酸在流中的量。在一個方面，二酸混合物在分離成C4、C5、或C6 二酸之前進行酯化?；蛘?，己二酸從混合物結(jié)晶。
[0026]在再一個方面，將混合的有機廢物流用非天然存在的宿主細(xì)胞處理，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地將至少一部分寡聚體酯水解成單體；將至少一部分己酸氧化成6-羥基己酸；將至少一部分環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸或6-氧己酸；將所述混合的有機廢物流中存在的至少一部分C3、C4和C5組分分解代謝；和/或以低于C3、C4和C5組分的速率分解代謝所述混合的有機廢物流中的C6組分；表達(dá)至少一種生物合成途徑酶以將己二酸、6-羥基己酸或6-氧己酸轉(zhuǎn)化成1，6-己二醇、6-氨基己酸、ε-己內(nèi)酰胺或六亞甲基二胺。這類處理將所述流中存在的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω -雙官能C6烷。
[0027]在一個方面，將寡聚體酯、己酸和環(huán)C6化合物轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸和己二酸的非天然存在的宿主細(xì)胞還生成1，6_己二醇。在一個具體的方面，產(chǎn)生1，6_己二醇的宿主細(xì)胞表達(dá)催化6-氧己酸到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化的醛脫氫酶和催化6-羥基己酸到1，6-己二醇的轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶。
[0028]在另一個方面，將寡聚體酯、己酸和環(huán)C6化合物轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸和己二酸的非天然存在的宿主細(xì)胞還生成6-氨基己酸。在一個具體的方面，生成6-氨基己酸的非天然存在的宿主細(xì)胞表達(dá)將6-氧己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸的氨基轉(zhuǎn)移酶。在一個方面，生成6-氨基己酸的非天然存在的宿主細(xì)胞還表達(dá)將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成ε -己內(nèi)酰胺的氨基(amidohydrolase)水解酶?；蛘撸?_氨基己酸的非天然宿主細(xì)胞還經(jīng)由將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛的醛脫氫酶和將6-氨基己醛轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺的1-氨基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生六亞甲基二胺。
[0029]在一個方面，將C4-C6或C6 —元酸、羥基酸和含氧酸經(jīng)由含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸的天然或非天然存在的宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑，其催化丁酸、戊酸和/或己酸到琥珀酸、戊二酸和/或己二酸的轉(zhuǎn)化；丁酸、戊酸和/或己酸到4-羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化；4_羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸到4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸的轉(zhuǎn)化；和/或4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸到琥珀酸、戊二酸和/或己二酸的轉(zhuǎn)化。具體地，具有內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑的天然或非天然存在的宿主細(xì)胞能將脂肪族脂肪酸經(jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸，且所述宿主細(xì)胞是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。在一個具體的方面，利用η-烷的酵母是解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iipolytica)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、白色假絲酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis、C.zeylenoides 或其組合，或紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)的酵母或其組合，且其中利用η-烷的細(xì)菌是假單胞菌屬，如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)、食油假單胞菌(P.0leoverans)、除經(jīng)海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)菌種如Acinetobacter venetianus>OleiphiIus messinensis、粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosus)、Cupriavidus metallidurans、紅球菌屬菌種如紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)和紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、Delftiaacidovorans、Alcanivorax diesolei 或其組合。
[0030]在一個方面，將廢物流的至少一部分環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸或己二酸的天然或非天然存在的宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性或異源性途徑，其催化環(huán)己醇到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化；1，2-環(huán)己二醇到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化；和/或6-氧己酸到己二酸的轉(zhuǎn)化。
[0031]在一個方面，消弱經(jīng)由β -氧化對己二酸和/或6-羥基己酸和/或己酸的降解，其通過阻止C6酸活化成CoA酯，或通過缺失一個或多個編碼?；?CoA氧化酶的POX基因進行。
[0032]在一個具體的方面，I, 2-環(huán)己二醇到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化包括環(huán)己烷-1，2-二醇到環(huán)己烷-1，2- 二酮的轉(zhuǎn)化和/或環(huán)己烷-1，2- 二酮到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化。
[0033]在另一個具體的方面，環(huán)己醇到環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化包括環(huán)己酮到ε -己內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化；ε -己內(nèi)酯到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化；和/或6-羥基己酸到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化。
[0034]在多個實施方案中，將不揮發(fā)性殘余物或水洗物中的一些6碳組分(包括6-羥基己酸和/或己酸)轉(zhuǎn)化成己二酸。
[0035]在多個實施方案中，將不揮發(fā)性殘余物或水洗物中的一些殘余環(huán)己酮和/或環(huán)己醇轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸或6-氧`己酸。
[0036]在一個方面，所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞對NVR耐受。在一個具體的方面，所述宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的混合的有機廢物流耐受。在另一個方面，宿主細(xì)胞對混合的有機廢物流的耐受性通過降低所述流中抑制性化合物的量得到改進。在一個具體的方面，所述抑制性化合物是內(nèi)酯，且在用天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞處理混合的有機廢物流之前或期間，通過用一種或多種生物催化劑處理所述流將混合的有機廢物流中內(nèi)酯的量降低，所述生物催化劑能將內(nèi)酯水解成相應(yīng)的羥基酸。在另一個方面，所述生物催化劑是在發(fā)酵期間由宿主細(xì)胞表達(dá)并分泌的酶。
[0037]在一個方面，降低宿主細(xì)胞對C6化合物分解代謝的速率以提供來自廢物流更高的C6組分產(chǎn)率。在一個具體的方面，降低己酸、羥基己酸和己二酸經(jīng)由宿主細(xì)胞的β-氧化降解成乙?；?CoA。在一個更具體的方面，己酸、羥基己酸和己二酸經(jīng)由氧化的降解通過缺失或抑制使用己酸、羥基己酸和己二酸來形成CoA酯的酶得到降低。在一個方面，降低己酸、羥基己酸和己二酸經(jīng)由氧化的降解，其通過缺失或抑制氧化CoA酯的酶。形成CoA酯的例示性酶是CoA連接酶和CoA轉(zhuǎn)移酶。氧化CoA酯的例示性酶是?；?CoA氧化酶和?；?CoA脫氫酶。
[0038]有利的是，本文中描述的方法減少基于石油化學(xué)品的原材料的使用且提供可持續(xù)工藝，其利用來自商業(yè)性工業(yè)工藝的廢產(chǎn)物。盡管，在期望時這些工藝可在新設(shè)備中進行，但這些工藝可在現(xiàn)有商業(yè)工廠(plant)中進行且如此不需要建造新的昂貴的工廠。此外，由于所述原料是原位生成的，運輸費用得到最小化，因為產(chǎn)生的己二酸可直接補料到現(xiàn)有純化和/或結(jié)晶設(shè)備中。
[0039]在多個實施方案中，NVR或水洗流的一些4碳和5碳組分被分解代謝或轉(zhuǎn)化成相
應(yīng)的二酸。
[0040]本發(fā)明還提供組合物，其包含環(huán)烷氧化工藝的混合的有機廢物流和生物催化劑。在一個方面，所述混合的有機廢物流包含NVR、水洗物/COP酸、或苛性水流。在另一個方面，所述生物催化劑是分離的酶或 由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶或全細(xì)胞。
[0041]在另一個方面，所述宿主細(xì)胞對NVR耐受。在一個具體的方面，所述宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的混合的有機廢物流耐受。
[0042]在一個方面，所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞包含能將脂肪族脂肪酸經(jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸的內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑，且所述宿主細(xì)胞是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。在一個具體的方面,利用η-燒的酵母是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、白色假絲酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides 或其組合，或紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)的酵母或其組合；且其中利用η-燒的細(xì)菌是假單胞菌屬，如突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)、食油假單胞菌(P.0leoverans)、除烴海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、不動桿菌屬菌種如 A.venetianus、Oleiphilusmessinensis、粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosus) > Cupriavidus metallidurans、紅球菌屬菌種如紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)和紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia) > Delftia acidovorans、或 Alcanivorax diesolei 或其組合。[0043]對本發(fā)明各實施方案的詳細(xì)描述
[0044]本發(fā)明的方法使用至少一種生物催化劑，從而能夠具有更高的產(chǎn)率和改進的從有機廢物流的組分回收。如本文中使用的，術(shù)語“生物催化劑”指分離或純化的酶，或由實施有機分子的單一化學(xué)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞原位生成的酶，或催化一種或多種有機分子的一系列連續(xù)轉(zhuǎn)變的全細(xì)胞。所述分離或純化的酶可購自商業(yè)來源，或從天然或非天然表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞純化。宿主細(xì)胞可以是天然存在或非天然存在的，例如經(jīng)遺傳工程化的。宿主細(xì)胞可以是原核生物的，如細(xì)菌或古細(xì)菌，或者是真核生物的，如酵母或動物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可表達(dá)或分泌能夠催化特定反應(yīng)例如水解的酶。另外，宿主細(xì)胞可含有催化不同反應(yīng)的其他酶途徑。舉例而言，宿主細(xì)胞可含有ω-羥基化途徑，其催化混合的有機廢物流中單羥基酸或含氧酸組分的氧化，或含有轉(zhuǎn)化從廢物流組分形成的化合物如6-氧己酸以生成更具商業(yè)價值的產(chǎn)物如6-氨基己酸的酶。
[0045]具體地，所述生物催化劑將寡聚體酯水解成單體。這改進了廢物流的燃燒價值和/或改進了廢物流的組成，其通過產(chǎn)生可用于后續(xù)化學(xué)或酶促加工的單體，如富集的二酸、己二酸和雙官能烷。開發(fā)本文中所述方法中的一個重要步驟是鑒定出天然表達(dá)和/或已經(jīng)過遺傳修飾來表達(dá)各種酶和途徑的宿主細(xì)胞，所述各種酶和途徑是將工業(yè)環(huán)己烷氧化的NVR、COP酸和水洗物中存在的化合物轉(zhuǎn)化成更期望的化合物所需要的。在一些情況下，天然和非天然存在的宿主細(xì)胞可將NVR和水洗廢物中存在的那些化合物(其不能容易地轉(zhuǎn)化成6-氧己酸)用作生長的營養(yǎng)源。
[0046]發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在存在混合的有機廢物流的情況下，宿主細(xì)胞保持存活且酶保持活性，而且能夠?qū)U物流的不太想要的組分轉(zhuǎn)化成工業(yè)和商業(yè)上有用的化合物或中間物。此外，發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即盡管NVR和水洗廢物中存在作為氧化過程副產(chǎn)物的抑制性化學(xué)物組，但宿主細(xì)胞仍能耐受工業(yè)環(huán)己烷氧化的NVR和水洗廢物流(且在一些情況下，分解代謝其組分)也是未預(yù)料到的。
[0047]附圖簡述
[0048]圖1是酶轉(zhuǎn)化的示意圖，其`涉及將工業(yè)環(huán)己烷氧化的NVR和水洗廢物的脂肪族和環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成己二酸。該圖還例示了將水洗廢物和NVR的C3-C5組分轉(zhuǎn)化成能補料到細(xì)胞的中心代謝中的化合物，從而使得該細(xì)胞能將那些化合物用于生長所需要的轉(zhuǎn)化。此外，該圖例示了可在本發(fā)明的工程化細(xì)胞中抑制以增加期望產(chǎn)物的總產(chǎn)率的那些酶轉(zhuǎn)化。這些抑制的途徑由交叉形的存在指示，箭頭顯示轉(zhuǎn)化的方向。
[0049]圖2是顯示6-羥基己酸到1，6-己二醇和6-氧己酸到6_氨基己酸轉(zhuǎn)化的例示性酶轉(zhuǎn)化的示意圖，6-氨基己酸隨后被轉(zhuǎn)化成己內(nèi)酰胺或經(jīng)由6-氨基己醛轉(zhuǎn)化成己烷-1，6-二胺(六亞甲基二胺)。1:1-氨基轉(zhuǎn)移酶EC2.6.1.191，也是來自Bacillusweihenstephanensis KBAB4、銅綠假單胞菌gi99510722的氨基轉(zhuǎn)移酶；2:羧酸還原酶ECl.2.99.6 或醛脫氫酶 ECl.2.1.3/EC1.2.1.31 ；3:6_ 羥基己酸脫氫酶 ECl.1.1.258 ；4:醇/ 醛脫氫酶 ECl.2.1.10 ；5:氨基水解酶(EC3.5.2.-)，如 EC3.5.2.11。
[0050]圖3是表達(dá)載體構(gòu)建體的示意圖，其用于表達(dá)在宿主菌株解脂西洋蓍霉中靶向胞外分泌的酶。
[0051]圖4顯示測試商業(yè)性酯酶和脂肪酶水解NVR和COP酸寡聚體的能力的代表性清空板測定法的圖。圖4，A部分顯示酯酶對COP酸(4%v/v)的水解:孔I為對照(無酶，僅磷酸鹽緩沖液)；孔2是米黑毛霉(Mucor miehei)酯酶；孔3是熒光假單胞菌酯酶；孔4是假單胞菌屬菌種膽固醇酯酶；孔5是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilu)酯酶；孔6是馬肝酯酶；孔7是解脂假絲酵母(Candida lipolytica)酯酶；孔8是米根霉酯酶；而孔9是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酯酶。圖4, B和C部分顯示脂肪酶對COP酸(4%v/v)的水解:c_無酶對照(磷酸鹽緩沖液)，孔1.疏棉狀嗜熱霉(ThermomycesIanuginosus),孔2.洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶,孔3.米黑毛霉脂肪酶,孔4.曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶，孔5.突光假單胞菌脂肪酶，孔6.沙門柏干酪青霉(Penicillium camemberti)脂肪酶，孔 7.黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶，孔 8.黑曲霉amano脂肪酶A,孔9.南極假絲酵母(Candida antartica)脂肪酶A,孔10.皺落假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶III型，和孔11.雪白根霉(Rhizopus niveus)月旨肪酶。
[0052]圖5顯示選定的酯酶在不同pH對聚己內(nèi)酯二醇聚合物(2%，w/v, MW=530g/mol)的水解。來自米黑毛霉(El)和米根霉(Rhizopus oryzae) (El2)的酯酶在pH3.5有活性。來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diostotochromogenes) (E8)的酯酶是堿性酯酶且僅在pH>8顯示活性。[0053]圖6顯示在生物轉(zhuǎn)化測定法期間磷酸鹽緩沖液(lOOmM，pH7.0)中的NVR反應(yīng)混合物(2%v/v)用選定酯酶處理16小時后己酸、6-羥基己酸、己二酸和總酸濃度中的增加。
[0054]圖7顯示在生物轉(zhuǎn)化測定法期間磷酸鹽緩沖液(lOOmM，pH7.0)中的NVR反應(yīng)混合物(2%v/v)用選定脂肪酶處理16小時后6-羥基己酸濃度中的增加。
[0055]圖8顯示在生物轉(zhuǎn)化測定法期間磷酸鹽緩沖液(lOOmM, pH7.0)中的COP酸(4%v/v)用選定酯酶處理16小時后己酸、6-羥基己酸、己二酸和總酸濃度中的增加。
[0056]圖9顯示在生物轉(zhuǎn)化測定法期間磷酸鹽緩沖液(lOOmM, pH7.0)中的COP酸(4%v/v)用選定脂肪酶處理16小時后己酸、羥基己酸、己二酸和總酸濃度中的增加。
[0057]圖10顯示在生物轉(zhuǎn)化測定法期間磷酸鹽緩沖液(lOOmM, pH7.0)中的NVR(4%v/v)用固定化脂肪酶處理16小時后6-羥基己酸濃度中的增加。
[0058]圖11顯示測試重組解脂西洋蓍霉菌株水解寡聚體酯能力的典型清除板測定法的圖，所述酵母菌株表達(dá)由定向進化創(chuàng)建的內(nèi)源性Lip2脂肪酶的變體。將解脂西洋蓍霉未轉(zhuǎn)化宿主和米黑毛霉酯酶用作對照來評價分泌的脂肪酶變體的相對活性。變體15和36展現(xiàn)出高活性，如由菌落周圍的暈(halo)的大小判斷的。
[0059]圖12是用于選擇能分解代謝NVR中存在的丁酸和戊酸的恒化器(chemo-stat)發(fā)酵設(shè)置的示意圖。
[0060]圖13是顯示在約0.1 DT1]的稀釋速率達(dá)到恒化器穩(wěn)定態(tài)的圖示。
[0061]圖14是顯示在約0.1 DT1]的稀釋速率接近穩(wěn)定態(tài)期間的pH擾動。
[0062]圖15是顯示在約0.1 DT1]的稀釋速率在近穩(wěn)定態(tài)來自pH偏移移動(excursiondrift)實驗的結(jié)果的圖示。
[0063]圖16顯示恒化器，其具有用于研究在作為碳源和能量源的NVR中生長的解脂西洋蓍霉的細(xì)胞截留的細(xì)胞截留實驗設(shè)置。
[0064]圖17顯示具有細(xì)胞截留的穩(wěn)定態(tài)恒化器培養(yǎng)，其以~215[mL/h]的流速和~
0.025 [h—1]的有效生物質(zhì)稀釋速率使用2[%] (v/v) NVR0
[0065]圖18顯示選定的酵母在0.Ι-lg/L內(nèi)酯存在下的生長。Iss#125是釀酒酵母(對照)。Iss#134是在3%(v/v)NVR+YPD培養(yǎng)基上緩慢生長后自板分離的。Iss#137是使用合成的NVR組分給料自恒化器分離的。
[0066]圖19顯示在使用1_2%NVR作為唯一碳源的細(xì)胞截留恒化器中戊內(nèi)酯的積累。
[0067]圖20顯示涉及將環(huán)己酮氧化成己二酸的基因，包括催化己內(nèi)酯到6-羥基己酸轉(zhuǎn)化的ChnC。數(shù)種歸類為ChnC的酶還催化戊內(nèi)酯到5-羥基戊酸的轉(zhuǎn)化。
[0068]圖21例示在與NVR(4%)溫育時，具有受損β -氧化的解脂西洋蓍霉菌株(各種POX突變體)的反應(yīng)上清液中6-羥基己酸和己二酸累積而在親本和野生型菌株中沒有觀察到累積。如此，編碼?；?CoA氧化酶的POX基因的缺失阻止NVR中經(jīng)由β-氧化對己二酸和6-羥基己酸兩者的降解。
[0069]圖22例示NVR中的6_羥基己酸和己二酸被親本和野生型菌株降解，而POX突變體累積兩種酸。Ρ0Χ3對C6組分的降解具有最大影響。
[0070]發(fā)明詳述
[0071 ] 混合的廢物流:不揮發(fā)性殘余物、水洗廢物和COP酸
[0072]商業(yè)性環(huán)烷氧化成二酸工藝一般涉及兩個步驟。在第一步驟中，利用空氣來氧化環(huán)烷以產(chǎn)生環(huán)烷醇和環(huán)烷酮的混合物。然后，使用硝酸將該混合物氧化成二酸。在KA混合物的產(chǎn)生期間生成數(shù)種副產(chǎn)物流。更具體地，當(dāng)用氧或含氧氣體來氧化環(huán)己烷時，產(chǎn)生在環(huán)己烷中含有環(huán)己醇㈧、環(huán)己酮⑷和環(huán)己基氫過氧化物(CHHP)的中間物流。該中間物流還包含共產(chǎn)物，其干擾意圖將CHHP轉(zhuǎn)化成KA的后續(xù)加工步驟。因此，商業(yè)性工藝可包括一個步驟，其中使含有Κ、Α和CHHP的中間物流與水或苛性堿(如記載于美國專利N0.3，365，490的)接觸以除去不想要的共產(chǎn)物。該萃取步驟產(chǎn)生(i)純化的環(huán)己烷流，其含有K、A和CHHP ;和(ii)水廢物流。
[0073]如本文中使用的，術(shù)語“水洗物”、“水洗廢物流”或“水廢物流”指由環(huán)己烷氧化物的水萃取產(chǎn)生的水流(Oppenheim, J.P.和 Dickerson, G.L.2003.Adipic Acid.Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Technology)。水洗物含有在環(huán)己燒的初始氧化期間形成的各
種一元酸和二元酸、羥基酸和其他氧化副產(chǎn)物。
[0074]一旦完成CHHP到K和A的轉(zhuǎn)化，就對所得混合物進行精化以回收⑴用于再循環(huán)的未反應(yīng)的環(huán)己烷，和(ii)獲得純化的K和A用于其后氧化成己二酸或轉(zhuǎn)化為己內(nèi)酰胺。如本文中使用的，術(shù)語“不揮發(fā)性殘余物流”或“NVR”指來自環(huán)己烷氧化產(chǎn)物環(huán)己醇和環(huán)己酮的蒸餾性回收的高溫沸騰蒸餾底部，其具有低鉻含量，更適于燃燒(Oppenheim，J.P.和 Dickerson, G.L.2003.Adipic Acid.Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology)。NVR包含幾種組分,包括但不限于,丁酸、戍酸、己酸、5_羥基戍酸、6-羥基己酸、戊內(nèi)酯、琥珀酸、戊二酸和己二酸，以及環(huán)己醇、環(huán)己二醇和環(huán)己酮。
[0075]總之，共產(chǎn)物流，在本文中有時稱為“副產(chǎn)物”流(可從環(huán)己烷氧化工藝獲得)包含“水洗物”(由環(huán)己烷氧化物的水萃取產(chǎn)生的水流)和“NVR”(來自KA精化的高溫沸騰蒸餾底部，CAS注冊號68411-76-7)。通過除去至少一些水而對水洗物的濃縮產(chǎn)生濃縮的水萃取流，稱為“C0P酸”。如本文中使用的，術(shù)語“C0P酸”指已經(jīng)過熱處理以除去過氧化物并濃縮以除去至少一些水的水洗物流(CAS注冊號68915-38-8)。參見描述NVR產(chǎn)生的美國公開文本N0.US2004/0054235(通過提述并入本文)，和美國公開文本No US2012/0064252和US2012/0101009 (通過提述并入本文)，其描述通過將游離酸官能團轉(zhuǎn)化成單體酯和寡聚體酯，并將寡聚體酯轉(zhuǎn)化成單體酯來處理NVR、水洗物或COP酸。
[0076]在一個實施方案中，“C0P酸”可通過使環(huán)己烷空氣氧化產(chǎn)物與水在萃取步驟中接觸并分離水相來提供，萃取物在后文中稱為“水洗物”。在一個實施方案中，所述“水洗物”經(jīng)過熱處理以破壞掉可能在儲存和裝運期間增加困難的過氧化物。水洗物可通過部分除去水來濃縮以降低儲存體積和運輸成本。
[0077]在一個實施方案中，COP酸一般含有按重量計約10%至70%的水。在一個實施方案中，COP酸可含有按重量計約10%至50%的水。在一個實施方案中，NVR可含有按重量計約10%至50%的水。在一個實施方案中，水洗物可含有按重量計約70%至90%的水。在一個實施方案中，水洗物可含有按重量計約85%的水。 [0078]作為方法的起始材料，可以使用來自環(huán)己烷氧化工藝(或系統(tǒng))的水性萃取的部分產(chǎn)物(后文稱為“水洗物”)、來自環(huán)己烷氧化工藝的濃縮水洗萃取物(后文稱為“C0P酸”)、來自KA精化的蒸餾底部(本文中稱為不揮發(fā)性殘余物或“NVR”)或其組合。關(guān)于“其組合”，任意一種或兩種的組合(例如，水洗物和COP酸；水洗物和NVR ;或COP和NVR)或所有3種的組合(即水洗物、COP酸和NVR)均可視為其組合。
[0079]混合的有機廢物流的組分
[0080]環(huán)己烷氧化的不揮發(fā)性殘余物和水洗廢物流包含化合物的混合物，所述化合物中一些是直鏈C6分子，一些是環(huán)C6分子，而一些是包含直鏈C6分子的聚合酯。其他具有更短鏈長度的化合物亦存在于NVR和水洗廢物流中。
[0081]具體地，所述不揮發(fā)性殘余物和水洗廢物流含有單功能(functional)和多功能性產(chǎn)物?？纱嬖谟谶@些產(chǎn)物上的官能團包括酸、過氧化物、酮、醇、酯和寡聚體。亦可存在其他官能團如醒、內(nèi)酯和烯。單分子可包含一種或更多種官能團(Ramsay等,Applied&Environmental Microbiology, 1986, 52(I):152-156)。
[0082]包含羥基酸基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于，羥基己酸、羥基戊酸、羥基丁酸、羥基丙酸和羥基乙酸。在一個實施方案中，所述酸基團可位于直鏈烴鏈的一端，而羥基基團可存在于鏈上的各個位置。
[0083]在一個實施方案中，所述羥基己酸是2-羥基己酸、3-羥基己酸、4-羥基己酸、5-羥基己酸或6-羥基己酸。
[0084]在一個實施方案中，所述羥基戊酸是2-羥基戊酸、3-羥基戊酸、4-羥基戊酸或
5-羥基戊酸。
[0085]在一個實施方案中，所述羥基丁酸是2-羥基丁酸、3-羥基丁酸或4-羥基丁酸。
[0086]在一個實施方案中，所述羥基丙酸是2-羥基丙酸或3-羥基丙酸。
[0087]包含一元酸基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸。
[0088]包含二元酸基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、延胡索酸、馬來酸、草酸和己-2-烯雙酸。
[0089]包含酮酸基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:α -酮酸例如2-氧酸如丙酮酸，β -酮酸例如3-氧酸如乙酰乙酸，Y -酮酸例如4-氧酸如4-氧戊酸(亦稱為乙酰丙酸)和5-氧己酸。
[0090]包含醇基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:環(huán)己醇、丙醇(例如1-丙醇、2-丙醇)、丁醇(例如1- 丁醇、2- 丁醇等)、戊醇(例如1-戊醇、2-戊醇等)、己醇(例如1-己醇、2-己醇等)和二醇如1，2-、1，3-和1，4-環(huán)己二醇，各種丁二醇異構(gòu)體和各種戊二醇異構(gòu)體。
[0091]包含過氧化物基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:環(huán)己基氫過氧化物和羥基己酸氫過氧化物。
[0092]包含酯基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:環(huán)己基甲酸酯和環(huán)己基戊酸酯。
[0093]包含酮基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:環(huán)己酮和環(huán)戊酮。
[0094]包含醛酸基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:5-甲酰基戊酸和4-甲?；∷?。
[0095]包含內(nèi)酯基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:Y-丁內(nèi)酯、δ-戊內(nèi)酯、Y-戊內(nèi)酯和ε -己內(nèi)酯。
[0096]包含烯基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗廢物流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:環(huán)己烯-1-酮、戊烯酸和環(huán)己烯-醇。
[0097]包含酯基團且可存在于不揮發(fā)性殘余物和/或水洗流中的產(chǎn)物的例子包括但不限于:6_羥基己酸的酯或寡聚體以及含有6-羥基己酸和二羧酸如1，6_己二酸的交叉酯或寡聚體。
[0098]生物催化劑對寡聚體混合的有機廢物流組分的水解
[0099]NVR中高達(dá)60%的可獲C6碳分子以羥基己酸、己二酸和己酸的酯寡聚體，以及摻有C4-C5羥基酸、一元酸和環(huán)醇的混合聚合酯存在。類似的寡聚體酯存在于COP酸中，盡管具有更低的異質(zhì)性，其主要由羥基-己酸組成。羥基-己酸是這些寡聚體的主要組分，而一元酸和二酸充當(dāng)鏈終止體，產(chǎn)生具有不同鏈長度的寡聚體。對NVR和COP酸的商業(yè)可行利用需要從寡聚體酯釋放出單體以改進產(chǎn)物如多元醇、C4-C6 二元酸或二元酯混合物或α，ω-雙官能C6烷的產(chǎn)率，所述產(chǎn)物可用于源自這些廢物流的聚合物應(yīng)用。NVR中寡聚體的高水平還導(dǎo)致高粘度和燃燒的低效率(當(dāng)NVR作為鍋爐燃料處置時)。
[0100]羧基酯水解酶(EC3.1.1.-)是將酯水解成醇和酸的水解作用酶。脂肪酶(EC3.1.1.3)是這些水解酶的亞類，其水解脂質(zhì)并且能在水相和有機相的界面處作用。酯酶(EC3.1.1.1)、角質(zhì)酶(EC3.1.1.74)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、內(nèi)酯水解酶如1,4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)亦水解酯鍵。
[0101]可基于脂肪酶的結(jié)合位點表面狀況、基因序列、功能或其他特性對其進行分類。脂肪酶工程數(shù)據(jù)庫(Lipase Engineering Database) (LED)整合脂肪酶、酯酶和具有a/β水解酶折疊的相關(guān)蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)和功能信息以生成針對所有脂肪酶的分類系統(tǒng)(Widmann等，BMC Genomics2010, 11:123)。根據(jù)涉及形成氧陰離子孔的氨基酸(其加上催化性三聯(lián)體(Ser-Asp(Glu)-His)形成活性位點)，來自任意生物體的脂肪酶可分成3組:GGGX-、GX-和Y-類。一旦已鑒定出對給定底物具有期望活性的脂肪酶，該數(shù)據(jù)庫即為可用于外推出鑒定具有期望特異性和特性的其他酶的結(jié)果的資源。
[0102]在一個實施方案`中，本發(fā)明提供一種或多種酶如脂肪酶和酯酶的組合的使用。例如，在一個方面，脂肪酶將寡聚體酯水解成更小的寡聚體且酯酶將更小的寡聚體水解成單體。
[0103]本發(fā)明的方法提供改進來自環(huán)己烷氧化工藝的混合的有機廢物流的特性和組成的手段，其通過對廢物流應(yīng)用至少一種生物催化劑。有機廢物流通過有限數(shù)目的來源生成，而廢物流最經(jīng)常燃燒以用于燃料值或產(chǎn)生合成氣。燃燒廢物流或?qū)⑵浣?jīng)由例如蒸汽重形成轉(zhuǎn)化成合成氣的結(jié)果是失去商業(yè)上有價值的流C6組分。另外，廢物流中多達(dá)40-60%的C6組分被“捕獲”為寡聚體，其導(dǎo)致可用化合物從使用廢物流作為輸入材料的進一步化學(xué)或酶促加工的較差回收并降低廢物流用于燃料的燃燒效率，因為寡聚體不像單體那樣有效燃燒。不受理論束縛，認(rèn)為NVR中的寡聚體增加流的粘度，其阻礙在噴燃器尖端(burner tip)的有效霧化(atomisation)。此外，認(rèn)為由于寡聚體在組成和量中不同，因此優(yōu)化燃燒過程非常困難。如此，從NVR和COP酸消除寡聚體可導(dǎo)致流的更低粘度，其導(dǎo)致更均一的易于通過焚燒處置的流。
[0104]這些與混合的有機廢物流例如NVR和COP酸有關(guān)的限制減少廢物流及其C6組分在商業(yè)有價值的操作例如生產(chǎn)二酸或尼龍中間物中的使用。
[0105]本發(fā)明提供用于釋放C6組分為單體的方法，其通過對所述廢物流應(yīng)用至少一種生物催化劑，其中所述生物催化劑將寡聚體水解以形成單體。所述單體能更有效地燃燒用于燃料和/或用于其后化學(xué)和酶促加工以提供改進的產(chǎn)率。
[0106]在一個方面，所述生物催化劑是分離的酶、固定化的酶、天然表達(dá)酶的宿主細(xì)胞、或已經(jīng)過修飾以分泌來自α，β-水解酶折疊家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶的宿主細(xì)胞。
[0107]能夠?qū)⒐丫垠w酯水解成單體的水解酶可以是分離的或固定化的酶?；蛘?，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主細(xì)胞在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶。
[0108]在一個方面，能夠?qū)⒐丫垠w酯水解成單體的水解酶是羧酸酯水解酶(EC3.1.1.-)。在另一個方面，所述水解酶選自脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角質(zhì)酶(EC3.1.1.74)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、內(nèi)酯水解酶或其組合。在一個具體的方面，所述內(nèi)酯水解酶是1，4_內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)或葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)。
[0109]根據(jù)從中生成NVR、COP酸、水洗物或苛性廢物流的特定環(huán)己烷氧化工藝以及意圖的應(yīng)用，寡聚體酯的水解可在不同pH條件進行。例如,來自cyane氧化的NVR、COP酸和水洗物是酸性的，而苛性CHHP工藝導(dǎo)致堿性NVR流和苛性水洗物&C0P廢物流。如此，能夠用可在酸性、中性或堿性條件下使用的不同酶將存在于不同NVR和濃縮水洗物流中的寡聚體水解是有利的。
[0110]所述混合的有機廢物流可用水解酶處理，調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)混合物的pH和水含量。依照水解酶在適宜PH保留其酶活性的能力對其進行選擇，從而使其能在近中性pH、酸性pH或堿性PH將廢物流中存在的寡聚體酯水解成單體。在一個方面，將混合的有機廢物流用在酸性pH，即低于6的pH有活性的水解酶處理。在另一個方面，將混合的有機廢物流用在堿性pH，即大于8的pH有活性的水解酶處理。在又一個方面，將混合的有機廢物流用在生理學(xué)pH,即pH6-8有活性的水解酶處理。
[0111]將混合的有機廢物流用水解酶處理能降低流的粘度并改進流燃燒的效率。另外，對混合的有機廢物流的水解酶處理還能將該流準(zhǔn)備為用于進一步化學(xué)和/或生物學(xué)加工。
[0112]在一個方面，將用水解酶處理的混合的有機廢物流如NVR燃燒用于燃料值或產(chǎn)生合成氣。不受理論束縛，認(rèn)為如果通過水解從寡聚體酯釋放出單體，那么所得混合物在作為鍋爐燃料處置時燃燒得更有效率。在另一個方面，將來自用水解酶處理的混合的有機廢物流如NVR的至少一種組分用于進一步化學(xué)加工。對單體的例示性的進一步化學(xué)加工包括酯化以產(chǎn)生混合的酯或多元醇、氫化為二醇、氧化為二酸、還原性氨基化、磺基化、或用NH4OH或多胺處理。
[0113]當(dāng)用水解酶處理的廢物流意圖用作鍋爐燃料，或當(dāng)將廢物流用水解酶處理以將其準(zhǔn)備為用于進一步化學(xué)加工時，在用水解酶處理之前或期間使得廢物流用水稀釋最小化和對混合物的PH調(diào)節(jié)最小化是有利的。在低pH保留活性的水解酶對于來自Cyane氧化工藝的廢物流的處理最有利，而在堿性PH保留活性的水解酶在來自CHHP工藝的廢物流的情況中最有利。當(dāng)廢物流意圖通過宿主細(xì)胞進行生物學(xué)處理以分解代謝廢物流的組分和/或?qū)U物流中的組分轉(zhuǎn)化成二酸或α，ω-雙官能烷時，采用在近生理學(xué)ρΗ(ρΗ5_8)有活性的水解酶是最有利的。
[0114]例如，發(fā)明人證明，盡管解脂西洋蓍霉具有廣泛的生長pH范圍(pH3.0-9.0)，但宿主細(xì)胞在混合的有機廢物流中存在的碳源上的生長速率在酸性PH和/或堿性pH受到顯著抑制(NVR中在pH>8.0和pH〈5.0的生長抑制)。見實施例2。在一個方面，將混合的有機廢物流用能在PH5.0-8.0利用廢物流中碳源的宿主細(xì)胞生物催化劑處理。
[0115] 對混合的有機廢物流的寡聚體酯組分的水解可與另外的分離、化學(xué)轉(zhuǎn)化或通過宿主細(xì)胞在發(fā)酵期間分泌的酶的酶促轉(zhuǎn)化同時進行?；旌系挠袡C廢物流可通過用游離或固定化的水解酶處理該流在發(fā)酵之前用水解酶進行處理，或通過向發(fā)酵液分批、逐步或與營養(yǎng)給料(nutrient feed) 一起添加生物催化劑在發(fā)酵期間處理?；蛘撸拗骷?xì)胞可在發(fā)酵期間將水解NVR中存在的寡聚體酯的酶分泌到發(fā)酵液中。
[0116]在近生理學(xué)pH(pH5_8)有活性的羧酸酯酶是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知曉這類水解酶的PH最適度、底物特異性和活性可通過采用合理設(shè)計或定向進化技術(shù)的酶工程改變(Dalby, P.A.(2003).0ptimizing enzyme function by directed evolution.CurrentOpinion in Structural Biology, 13，500-505)。在實施例1 中，提供了幾種能在 pH5_8 水解NVR和COP酸中的寡聚體酯的脂肪酶和酯酶。此外，在實施例1中提供了在pH3.5展現(xiàn)出對NVR和COP酸中的寡聚體酯的水解活性的酯酶例子，如來自米黑毛霉(El)和米根霉(El2)的酯酶，和僅在pH>8展現(xiàn)活性的來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(E8)的堿性酯酶。
[0117]在非常低pH(pH〈3.5)有活性的羧酸酯酶未有很好記載。然而，發(fā)明人鑒定出幾種能用于處理NVR和COP酸流以在pH〈5水解寡聚體酯的水解酶，如來自黑曲霉NCIM1207 (GenBank Anl6g01880; SEQ ID NO: 6)、克氏擔(dān)抱酵母屬(Kurtzmanomyces)菌種1-1l (GenBank BAB91331.1; SEQ ID NO: 5)、極度嗜熱古核生物 Pyrobaculum calidifontisVal (GenBank BAC06606;SEQ ID NO:8)的脂肪酶，以及 Picrophilus torridus 酯酶(GenBank AAT43726; SEQ ID NO: 7)。已顯示黑曲霉NCMl207產(chǎn)生高水平的胞外脂肪酶，其在 PH2.5 有活性(Mahadik 等，2002.Process Biochemistry, 38:715-721)。將來自黑曲霉的這種獨特脂肪酶純化并在浸沒發(fā)酵下表征(Mhetras等，2009.BioresourceTechnology, 100:1486-1490)。它是一種 32.2kDa 蛋白，具有 8.5 的 pl，50°C 的最適溫度和在2.5的最適pH。在更低的pH(如pHl.5)，活性降低。
[0118]克氏擔(dān)孢酵母屬菌種1-1l菌株是甘露糖赤蘚糖醇脂質(zhì)的高水平生產(chǎn)者，當(dāng)細(xì)胞在含有大豆油作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生該脂質(zhì)。在培養(yǎng)的起始階段，培養(yǎng)液的pH降至3.2且大豆油在該pH快速水解成脂肪酸和甘油，表明在培養(yǎng)液中產(chǎn)生該嗜酸性脂肪酶?？耸蠐?dān)孢酵母屬菌種1-1l菌株脂肪酶與南極假絲酵母A脂肪酶顯示高序列同一性，后者已由發(fā)明人顯示為以高活性水解NVR和COP酸中的寡聚體酯(實施例1中的L5)。純化并表征由酵母克氏擔(dān)孢酵母屬菌種1-1l產(chǎn)生的胞外脂肪酶(Kakugawa等，2002.BioscienceBiotechnology Biochemistry, 66 (5):978-985)。它是一種 49kda 蛋白，具有在 75°C 的最適溫度，但活性在低于70°C的溫度穩(wěn)定。該酸性脂肪酶具有在酸性區(qū)(pHl.9-7.2)的活性pH范圍，且活性在存在濃度為40%的各種有機溶劑的情況下穩(wěn)定。
[0119]已報告極端嗜熱古核生物Pyrobaculum calidifontis Val產(chǎn)生高度活性的熱穩(wěn)定性羧酸酯酶。發(fā)現(xiàn)該酯酶為已報告的最熱穩(wěn)定和最嗜熱性的脂肪分解酶之一。它是一種
34.3kDa蛋白，顯示90°C的最適溫度，最適pH在7。該酯酶在與濃度為80%的各種水混雜性有機溶劑溫育后是穩(wěn)定的且在存在有機溶劑的情況下展現(xiàn)活性(Hotta等，2002.Appliedand Environmental Microbiology, 68 (8): 3925-3931)。Picrophilus torridus 代表了石開究負(fù)責(zé)在極端嚴(yán)苛條件下(在PH0.7和60°C最適生長)繁盛能力的遺傳和分子機制的一種獨特的模式生物，和極度穩(wěn)定的酯酶和脂肪酶的有前景的來源。鑒定并表征P.torridus的編碼酯酶的兩種基因。其中一種酯酶(Est B)顯示在存在各種有機溶劑的情況下水解脂肪酸酯的高能力。EstB是~27kDa酯酶，其具有在70°C測量到的最佳活性(Hess等，(2008).Extremophiles, 12:351-364)。
[0120]角質(zhì)酶與脂肪酶的區(qū)別在于它們不需要界面活化，因為它們的催化位點沒有蓋覆蓋且因此仍然是溶液中底物可達(dá)的(Martinez等，1992)。如此，角質(zhì)酶不管是否存在界面均為活性的，且由此能水解可溶性和不可溶性底物。米曲霉(Aspergillusoryzye)分泌能水解含C6羧酸的寡聚體的角質(zhì)酶(AoC),且其在ρΗ>11穩(wěn)定并具有活性(Maeda, H.等,(2005).Purification and characterisation of a biodegradableplastic-degrading enzyme from` Aspergillus oryzae.Applied and EnvironmentalBiotechnology, 67:778-788)。
[0121]其他由于其廣泛底物特異性以及在廣泛pH范圍內(nèi)的活性和穩(wěn)定性可用于水解NVR和COP酸中的寡聚體酯的角質(zhì)酶包括來自甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternaria brassicicola)(AbC)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus) (AfC)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens) (HiC)和爺鐮孢(Fusarium solani) (FsC)的角質(zhì)酶。已發(fā)現(xiàn)來自植物病原體爺鐮孢豌豆?；?F.soIani sp.pisi)的角質(zhì)酶(Egmond等2000)降解廣泛范圍內(nèi)的底物,包括角質(zhì)、羧基酯、三酰甘油(TAG)和磷脂(15)(具有短鏈和長鏈脂肪酸)。該酶在可溶性底物如短鏈P-硝基苯基酯上也具有活性。茄鐮孢角質(zhì)酶在廣泛pH范圍(2-12)內(nèi)操作，在pH8.5具有最適活性且顯示為在40-60°C為中度嗜熱的(Peterson等，2001)。此外，顯示野生型茄鐮孢豌豆?；湍芙到饩奂簝?nèi)酯并將其用作碳源和能量源。角質(zhì)酶活性受到培養(yǎng)基中存在的葡萄糖(0.5%w/w)的抑制，而且由聚己內(nèi)酯降解的酶促產(chǎn)物誘導(dǎo)(Murphy等，1996)。對類似于茄鐮孢角質(zhì)酶I的蛋白質(zhì)的BLAST搜索指示有兩種主要的分泌角質(zhì)酶的生物組。它們是真菌植物病原體或分枝桿菌(Mycobacteria)。在真菌角質(zhì)酶中，HiC由于其高熱穩(wěn)定性展現(xiàn)出在升高溫度和在所有pH值下對聚己內(nèi)酯降解的最高活性。AoC、AfC和HiC在更極端的溫度和PH條件下保留大量的水解活性。相比之下，AbC和FsC是最不熱穩(wěn)定的且在高溫和低PH值保留極小活性。
[0122]本部分中描述的酶可在本文中所述的任一方法中使用或可包含在本文中所述的任一種組合物中。
[0123]增加混合的有機廢物流中二酸的相對量的方法
[0124]本發(fā)明提供用于改進混合的有機廢物流的特性和組成的其他手段，其通過將一元酸和羥基酸組分轉(zhuǎn)化成二酸。這些廢物流的主要組分由C4-C6 —元酸、羥基酸和二酸的混合物組成。然而，具有許多應(yīng)用的二酸不能與廢物流中的一元酸和羥基酸組分容易地分開，由此限制了廢物流對于進一步的化學(xué)或生物學(xué)加工(除了其他潛在應(yīng)用以外)的有用性和產(chǎn)率。
[0125]所述方法采用生物催化劑以將NVR中的直鏈C4、C5和C6 —元酸和羥基酸組分以及環(huán)C6組分酶促轉(zhuǎn)化成C4、C5和C6 二元酸的混合物。所得二酸混合物本身即可使用(即無另外修飾或加工地)?；蛘?，可將二酸混合物分成C4、C5和C6 二酸，或酯化然后分開為C4、C5和C6 二酸，或者可從二酸混合物結(jié)晶出己二酸。生物催化劑可用于增加含有大量寡聚體酯的NVR和COP酸的單體組分，所述寡聚體酯有效捕獲單體使之不能用于其它應(yīng)用，例如燃燒價值和/或轉(zhuǎn)化成己二酸或雙官能烷。
[0126]一元酸和羥基酸到二酸的酶促轉(zhuǎn)化增加廢物流中二酸的相對量，其增加從其他廢物流組分分開的二酸的回收。具體地，這些方法能增加混合的有機廢物流中二酸的相對量，其通過將至少一部分寡聚體酯水解成單體，將至少一部分內(nèi)酯水解成羥基酸，將混合的有機廢物流中存在的至少一部分直鏈C4、C5和C6 —元酸、羥基酸和含氧酸氧化成相應(yīng)的二酸。優(yōu)選地，將水解酶用于將NVR 和COP酸廢物流中存在的寡聚體酯水解成單體。多種其他生物催化劑可用在NVR和COP酸以及水洗廢物流中以將內(nèi)酯水解成羥基酸和/或?qū)⒅辨淐4、C5和C6 —元酸、羥基酸和含氧酸氧化成二酸。
[0127]能夠?qū)⒐丫垠w酯水解成單體的水解酶可以是分離或固定化的酶?；蛘撸鏊饷缚梢允怯商烊淮嬖诘幕蚍翘烊淮嬖诘乃拗骷?xì)胞在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶。
[0128]優(yōu)選地，將一元酸和羥基酸酶促轉(zhuǎn)化成二酸的生物催化劑是天然存在或非天然的宿主細(xì)胞。例如，解脂西洋蓍霉是天然存在的宿主細(xì)胞，其能夠?qū)VR中的碳源用于生長。另外，天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞生物催化劑可用于廢物流組分到二酸的酶促轉(zhuǎn)化，因為轉(zhuǎn)化牽涉細(xì)胞色素P450酶，該酶是跨膜整合蛋白，如此需要包含p450酶途徑的宿主細(xì)胞。
[0129]1.增加來自6-氧己酸的己二酸的相對濃度
[0130]6-氧己酸可進一步轉(zhuǎn)化成在尼龍合成中有用的各種化合物。例如，6-氧己酸可轉(zhuǎn)化成己烷-1，6-雙酸(己二酸)。另外，己二酸或6-氧己酸可轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸、己內(nèi)酰胺、6-氨基己醛或己烷-1，6-二胺(六亞甲基二胺)。本發(fā)明還提供用于生成這些化合物的方法。
[0131]i)水解寡聚體酯和內(nèi)酯以釋放直鏈C6組分
[0132]在一個方面，從混合的有機廢物流產(chǎn)生6-氧己酸牽涉水解廢物流如NVR和/或水洗物中存在的聚合性和寡聚體酯。這些二聚體、三聚體、四聚體或寡聚體酯由在從聚合體和寡聚體釋放后可轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、己酸和可能的1，6_己二酸的直鏈C6分子構(gòu)成。如此，本發(fā)明提供從環(huán)己烷氧化的混合的有機廢物流產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，包括使用來自α，β_水解酶折疊家族的生物催化劑如羧酸酯酶，包括酯酶/脂肪酶和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶。
[0133]在從包含直鏈C6分子的聚合酯產(chǎn)生6-氧己酸中的一個步驟是將6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成6-氧己酸。在本發(fā)明的一個方面，生物催化劑如脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶用于將6-羥基己酸酶促轉(zhuǎn)化成6-氧己酸。
[0134]在從包含直鏈C6分子的聚合酯產(chǎn)生6-氧己酸中的另一個步驟是己酸到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一個方面，生物催化劑如ω-羥化酶用于將己酸酶促轉(zhuǎn)化成6-羥
基己酸。
[0135]可將這些酶促轉(zhuǎn)化組合成單個方法，而非兩個分開的步驟。在這一方面，使用酶如羧酸酯酶、ω -羥化酶和脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶的組合從混合的有機廢物流產(chǎn)生6-氧己酸。
[0136]ii)將直鏈C6組分轉(zhuǎn)化成6-氧己酸
[0137]在從己酸產(chǎn)生6-氧己酸中的一個步驟是將己酸(己酸)轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸(羥基己酸)。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流中存在的組分產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，其使用酶如細(xì)胞色素P450或來自ECl.14.15.3類的ω -羥化酶或ω -加氧酶。盡管特定酶對于具體轉(zhuǎn)化的用途是已知的(例如Coon, Biochemical&Biophysical ResearchCommunications, 2005, 338:378-385),但發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)這些酶可用于酶促轉(zhuǎn)化混合的有機廢物流的組分。
[0138]另外，6-氧己酸可從己酸間接產(chǎn)生或經(jīng)由6-羥基己酸到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化從6-羥基己酸直接產(chǎn)生。在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流中存在的組分即己酸或6-羥基己酸產(chǎn)生6-氧己酸的方法，其使用酶如來自ECl.1.1.-類的脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶(Eurich 等,Applied&Environmental Microbiology, 2004, 70(8):4872 - 4879)。
[0139]可將這些酶步驟組合成單個方法。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從環(huán)己烷氧化的混合的有機廢物流如NVR和/或水洗物產(chǎn)生6-氧己酸的方法，包括使用酶的組合，如(i)細(xì)胞色素P450或ω-羥化酶，和(ii)脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶。
[0140]ii)將環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-氧己酸
[0141]在從環(huán)己醇產(chǎn)生6-氧己酸中的一個步驟是環(huán)己醇到環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從環(huán)己烷氧化的混合的有機廢物流的組分產(chǎn)生環(huán)己酮的方法，其包括使用酶如來自ECl.1.1.-類的醇脫氫酶或環(huán)己醇脫氫酶/ChnA，例如ECl.1.1.90,1.1.1.245等(Donoghue&Trudgi11, Eur J Bochem., 1975, 60:1-7)。
[0142]在將環(huán)己醇轉(zhuǎn)化成環(huán)己酮后，6-氧己酸產(chǎn)生中的后續(xù)步驟是將環(huán)己酮轉(zhuǎn)化成ε-己內(nèi)酯。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流的組分產(chǎn)生ε-己內(nèi)酯的方法，其包括使用酶如Baeyer-Villiger單加氧酶、環(huán)己酮單加氧酶/ChnB,例如1.14.13.22 等(Kim 等,Biotechnol.Bioprocess Eng., 2008, 13:40-47)。
[0143]在從環(huán)己醇產(chǎn)生6-氧己酸中的又一個步驟是ε-己內(nèi)酯到6-羥基己酸的后續(xù)轉(zhuǎn)化。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流的組分產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，其包括使用酶如己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶、來自EC3.1.1.17類的葡糖酸內(nèi)酯酶/ChnC等(Cheng等,Journal of Bacteriology, 2000, 182 (17):4744 - 4751)。
[0144]在ε-己內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸后，從環(huán)己醇產(chǎn)生6-氧己酸中的另一個步驟是6-羥基己酸到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流的組分產(chǎn)生6-氧己酸的方法，其包括使用酶如脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶或ChnD。例如，醇脫氫酶可選自 ECl.1.1.2 類，如 1.1.1.258 等(Cheng 等,Journal of Bacteriology, 2000, 182
(17):4744 - 4751)。
[0145]可將這些酶步驟組合成單個方法。如此，在一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流中存在的環(huán)己醇和環(huán)己酮分子產(chǎn)生ε -己內(nèi)酯的方法，包括使用醇脫氫酶和Baeyer-Villiger單加氧酶。在另一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流產(chǎn)生6_羥基己酸的方法，包括使用酶如醇脫氫酶、Baeyer-Villiger單加氧酶和己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶的組合。在又一個方面，本發(fā)明提供從混合的有機廢物流產(chǎn)生6-氧己酸的方法，包括使用醇脫氫酶、Baeyer-Villiger單加氧酶、己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶和脂肪醇氧化酶或醇脫氫酶。在一個別的方面，本發(fā)明提供從存在于環(huán)己烷氧化的不揮發(fā)性殘余物和/或水洗物中的1，2-環(huán)己二醇和環(huán)己烷-1，2- 二酮產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，包括使用環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶和環(huán)己烷-1，2-二酮?；饷浮0146]iv) 6-氧己酸到尼龍中間物的轉(zhuǎn)化
[0147]如本文中論述的，6-氧己酸可通過醛脫氫酶的作用酶促轉(zhuǎn)化成己烷-1，6-雙酸(己二酸)。如此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生己烷-1，6-雙酸(己二酸)的方法，包括使用如上文所列生物催化劑產(chǎn)生6-氧己酸，且還包括6-氧己酸到己烷-1，6-雙酸的酶促轉(zhuǎn)化，其使用生物催化劑如醛脫氫酶，例如來自ECl.2.1.4和ECl.2.1.63等的。生物催化劑可以是分離的酶或者表達(dá)并分泌該酶的天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞。
[0148]如本文中論述的，6-氧己酸可通過氨基轉(zhuǎn)移酶的作用轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸。如此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生6-氨基己酸的方法，包括使用如上文所列生物催化劑產(chǎn)生6-氧己酸，且還包括6-氧己酸到6-氨基己酸的酶促轉(zhuǎn)化，其使用生物催化劑如轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.-)或脫氫酶，如ECl.4.1.-等。生物催化劑可以是分離的酶或者表達(dá)并分泌該酶的天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞。
[0149]如本文中論述的，6-氨基己酸可通過氨基水解酶的作用轉(zhuǎn)化成己內(nèi)酰胺。如此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的方法，包括使用如上文所列生物催化劑產(chǎn)生6-氨基己酸，且還包括6-氨基己酸到己內(nèi)酰胺的酶促轉(zhuǎn)化，其使用生物催化劑如氨基水解酶，例如EC3.5.2.-等。生物催化劑可以是分離的酶或者表達(dá)并分泌該酶的天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞。
[0150]如本文中論述的，6-氨基己酸可通過醛脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛。如此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生6-氨基己醛的方法，包括使用如上文所列生物催化劑產(chǎn)生6-氨基己酸，且還包括6-氨基己酸到6-氨基己醛的酶促轉(zhuǎn)化，其使用生物催化劑如醛脫氫酶。在另一個方面，6-氨基己酸經(jīng)過多個酶步驟轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛，例如通過形成6-乙酰氨基己酸酯(相應(yīng)的乙酰-CoA或磷酸酯)作為中間物。生物催化劑可以是分離的酶或者表達(dá)并分泌該酶的天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞。
[0151]如本文中論述的，6-氨基己醛可通過氨基轉(zhuǎn)移酶或胺氧化酶的作用轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺。如此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生六亞甲基二胺的方法，包括對混合的有機廢物流應(yīng)用如上文所列生物催化劑以產(chǎn)生6-氨基己醛，且還包括6-氨基己醛到六亞甲基二胺的酶促轉(zhuǎn)化，其使用生物催化劑如氨基轉(zhuǎn)移酶或胺氧化酶。生物催化劑可以是分離的酶或者表達(dá)并分泌該酶的天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞。
[0152]增加混合的有機廢物流中己二酸的相對量的方法
[0153]本發(fā)明提供用于改進混合的有機廢物流的特性和組成的其他手段，其通過使用生物催化劑來降低混合的有機廢物流如NVR的復(fù)雜性，和增加所述流中己二酸的相對濃度，這有助于從廢物流回收己二酸。具體地，所述方法增加混合的有機廢物流中己二酸的相對濃度，并降低所述流中一元酸和羥基酸的量。作為低聚反應(yīng)和/或與二酸一元酸和羥基酸不可分地混合的結(jié)果，約10%的己二酸在混合的有機廢物流中失去。然而，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)對有機廢物流應(yīng)用至少一種生物催化劑能改進己二酸的回收。
[0154]具體地，生物催化劑能將至少一部分寡聚體酯水解成單體，將至少一部分e-己內(nèi)酯水解成ε -羥基-己酸，將至少一部分己酸、6-羥基己酸和6-氧己酸氧化成己二酸，和/或?qū)U物流至少一部分的環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成己二酸。
[0155]能夠?qū)⒐丫垠w酯水解成單體的水解酶可以是分離或固定化的酶?；蛘?，所述水解酶可以是由天然存在的或非天然存在的宿主細(xì)胞在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶。
[0156]這些方法能降低NVR的復(fù)雜性，并增加NVR廢物流中己二酸的相對濃度(其有助于從NVR回收己二酸)，其通過將己酸、羥基-己酸和環(huán)C6化合物(例如K和Α)轉(zhuǎn)化成己二酸。將NVR的不那么想要的組分例如C3-C5用于生長的生物催化劑可進一步降低廢物流的復(fù)雜性。例如，優(yōu)選的方法包括將廢物流中存在的寡聚體酯水解成單體；將一元酸和羥基酸轉(zhuǎn)化成二酸；從混合物除去C4和C5組分；分解代謝混合的有機廢物流中存在的至少一部分C3、C4和C5組分；和/或以低于C3、C4和C5組分的速率分解代謝混合的有機廢物流中的C6組分。除了 NVR外，生物催化劑還可應(yīng)用于COP酸和水洗廢物流以實施多種酶轉(zhuǎn)化，例如將內(nèi)酯水解成羥基酸和/或?qū)⒅辨淐4-C6 —元酸和羥基酸氧化成二酸。
[0157]在一個方面，這些方法可用于富集發(fā)酵期間混合的有機廢物流中己二酸的相對濃度。然后，可從發(fā)酵罐移出經(jīng)處理的混合物并返回結(jié)晶過程，其中作為發(fā)酵期間充分富集的結(jié)果，己二酸將從混合物結(jié)晶出來。使用這類方法，可將現(xiàn)有的用于環(huán)烷氧化的設(shè)備修改為允許用生物催化劑對廢物流進行富集己二酸的處理。不需要為這類富集建立完全新的設(shè)備，這節(jié)省了大量時間和金錢。
[0158]優(yōu)選地，用于增加己二酸的相對濃度并降低一元酸和羥基酸的量的方法使用非天然存在的宿主細(xì)胞作為生物催化劑進行，因為這些方法需要認(rèn)為不天然共存于宿主細(xì)胞的兩個酶促途徑。在一個方面，生物催化劑中存在的氧化途徑可能受損因而己二酸未降解。例如，宿主細(xì)胞可以是POX基因敲除即失活的解脂西洋蓍霉，從而使得宿主細(xì)胞β-氧化途徑受損，這導(dǎo)致己二酸的累積。
[0159]將混合的有機廢物流的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω -雙官能C6烷的方法
[0160]本發(fā)明提供用于改進混合的有機廢物流的特性和組成的其他手段，其通過使用生物催化劑來將廢物流中存在的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω -雙官能C6烷。
[0161]6-羥基己酸到1`,6-己二醇、己二酸到6-氧己酸和6-氧己酸到6_氨基己酸的酶促轉(zhuǎn)化由一系列不同酶介導(dǎo)(見圖2)。具體地,6-氧己酸由氨基轉(zhuǎn)移酶EC2.6.1.19轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸(關(guān)于β_丙氨酸的酶研究披露于(Hayaishi等1961J.Biol.Chem.236，p.781-790)，以及氨基轉(zhuǎn)移酶披露于 W02009/113855&W02011/031147，通過提述完整并入本文中)，其顯示使用這類酶分別從5-甲酰基制備6-氨基己酸和從α -酮酸制備包含胺基團的化合物。類似地，可使用這些氨基轉(zhuǎn)移酶將6-氨基己醛轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺。6-氧己酸可通過羧酸還原酶ECl.2.99.6或醛脫氫酶ECl.2.1.3或ECl.2.1.31轉(zhuǎn)化成己二酸。6-氨基己酸相應(yīng)地可轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺或己內(nèi)酰胺。在一個方面，可使用這些羧酸還原酶或醛脫氫將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛。在另一個方面，6-氧己酸可轉(zhuǎn)化成1，6_己二醇，其經(jīng)由通過6-羥基己酸脫氫酶ECl.1.1.258到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化，6-羥基己酸可隨后通過醇/醛脫氫酶ECl.2.1.10轉(zhuǎn)化成1，6_己二醇。另外，6-氨基己酸可通過氨基水解酶(EC3.5.2.-)如EC3.5.2.11轉(zhuǎn)化成己內(nèi)酰胺。
[0162]在一個方面，將混合的有機廢物流用有以下能力的非天然存在的宿主細(xì)胞處理:能夠?qū)⒅辽僖徊糠止丫垠w酯水解成單體；將至少一部分己酸氧化成6-羥基己酸；將至少一部分環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸或6-氧己酸；分解代謝混合的有機廢物流中存在的至少一部分C3、C4和C5組分；和/或以低于C3、C4和C5組分的速率分解代謝混合的有機廢物流中的C6組分。
[0163]能夠?qū)⒐丫垠w酯水解成單體的水解酶可以是分離或固定化的酶?；蛘撸鏊饷缚梢允怯商烊淮嬖诘幕蚍翘烊淮嬖诘乃拗骷?xì)胞在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶。
[0164]另外，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)至少一種生物合成途徑酶以將己二酸、6-羥基己酸或6-氧己酸轉(zhuǎn)化成1，6-己二醇、6-氨基己酸、ε -己內(nèi)酰胺、或六亞甲基二胺。
[0165]在另一個方面， 本發(fā)明提供用于使用微生物作為宿主細(xì)胞生物催化劑來生物合成NVR組分到雙官能烷的酶促轉(zhuǎn)化的方法。先前已顯示微生物對于從混合的有機廢物流以外的來源生物產(chǎn)生己二酸和雙官能烷的用途。參見W02009/151728和W02010/068944，通過提述完整并入本文。本發(fā)明提供應(yīng)用非天然存在的宿主細(xì)胞，例如經(jīng)過修飾以含有將NVR的環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸或6-氧己酸所需的異源酶。
[0166]在另一個方面，所述非天然存在的宿主細(xì)胞還經(jīng)過修飾以產(chǎn)生1，6-己二醇。任選地，這類產(chǎn)生1，6_己二醇的宿主細(xì)胞還可表達(dá)牽涉1，6_己二醇產(chǎn)生的特定酶。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞表達(dá)醛脫氫酶，其催化6-氧己酸到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化，和醇脫氫酶，其催化6-羥基己酸到1，6-己二醇的轉(zhuǎn)化。
[0167]在再一個方面，所述非天然存在的宿主細(xì)胞還經(jīng)過遺傳修飾以產(chǎn)生6-氨基己酸。任選地，這類產(chǎn)生6-氨基己酸的宿主細(xì)胞還可表達(dá)牽涉6-氨基己酸產(chǎn)生的特定酶。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞表達(dá)能將6-氧己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸的氨基轉(zhuǎn)移酶。在一個方面，所述表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞還經(jīng)過遺傳修飾以表達(dá)能將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成ε -己內(nèi)酰胺的氨基水解酶。在另一個方面，所述表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞還經(jīng)過遺傳修飾以產(chǎn)生六亞甲基二胺，其經(jīng)由能將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛的醛脫氫酶和能將6-氨基己醛轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺的1-氨基轉(zhuǎn)移酶。
[0168]C3、C-4和C-5種類的轉(zhuǎn)化和/或降解
[0169]任選地，存在于來自環(huán)己烷氧化的NVR或水洗物中的C-4和C-5—元酸(丁酸和戊酸)和/或羥基酸(4-羥基丁酸和5-羥基戊酸)經(jīng)由同一途徑轉(zhuǎn)化，所述途徑由針對己酸和羥基己酸描述的ω-羥化酶、醇脫氫酶和醛脫氫酶組成。丁酸和戊酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的二酸，即琥珀酸和戊二酸。此轉(zhuǎn)化將來自環(huán)己烷氧化的NVR或水洗物中化學(xué)物種類混合物的復(fù)雜性降低為主要由C6、C5和C4 二酸組成的混合物。通過減少混合物中化學(xué)物種類的數(shù)目，所得二酸混合物更容易地從發(fā)酵液回收以用于二酸的商業(yè)性應(yīng)用，或任選地通過已知方法酯化成相應(yīng)的二元酯(其作為二元酯混合物具有商業(yè)用途)，或任選地通過已知方法分開為C6、C5和C4 二元酯。來自環(huán)己烷氧化的NVR或水洗物中存在的一些或所有C4和C5種類如丁酸、戊酸、琥珀酸、戊二酸、4-羥基丁酸和5-羥基戊酸經(jīng)由β-氧化分解代謝成乙酰-CoA經(jīng)由TCA循環(huán)，由此降低化學(xué)物種類的復(fù)雜性并促進己二酸、氨基己酸、己內(nèi)酰胺或六亞甲基二胺的更容易的回收，并充當(dāng)用于生物質(zhì)生產(chǎn)的碳源且如此降低生物質(zhì)產(chǎn)生所需的可發(fā)酵碳源的量。如此，本發(fā)明提供一種降低C-4和C-5種類濃度的方法，其通過分解代謝來自環(huán)己烷氧化的NVR或水洗物中的至少一部分C-4和C-5碳種類?？蓪嵤λ拗鞯倪z傳工程化以使得經(jīng)由β -氧化或經(jīng)由TCA循環(huán)分解代謝的己酸和/或己二酸的損失最小化。
[0170]為了減少己酸或己二酸經(jīng)由宿主生物的氧化途徑的降解并如此改進可從發(fā)酵液回收的可用產(chǎn)物的量，可敲除或突變編碼作用于這些底物或其CoA酯的酶的基因以降低其活性或改變由這些基因編碼的酶的底物特異性。為了阻止或降低己酸或己二酸到其相應(yīng)CoA酯的活化，破壞或突變編碼作用于己二酸或己酸(如果存在于宿主菌株)的CoA連接酶或CoA轉(zhuǎn)移酶的宿主菌株基因是可用的，所述CoA連接酶或CoA轉(zhuǎn)移酶屬于EC6.2.1.-類，如作用于具有5至16個碳的鏈長度的二羧酸的EC6.2.1.23等?；蛘撸柚够罨腃oA酯進入β-氧化途徑也是有利的，其通過破壞或突變宿主生物中存在的、編碼作用于己酰-CoA或己二酰-CoA的?；?CoA氧化酶或?；?CoA脫氫酶(如ECl.3.3.6或ECl.3.".-等)的基因。
[0171]非天然存在的酶
[0172]在一些實施方案中，用于實施本文所述方法中的轉(zhuǎn)化的酶是非天然存在的，即編碼該酶的DNA已從野生型序列突變以改進該酶的一種或多種特性。用于誘變基因和蛋白質(zhì)工程的方法是本領(lǐng)域中公知的?；蛘?另外地，隨機和/或組合誘變辦法包括辦法如DNA改組、STEP和易錯PCR、分子進化和`致突變菌株(mutator strain)可用于創(chuàng)建突變庫。誘變變化的非限制性列表包括缺失、插入、取代、重排、點突變和抑制突變。
[0173]然后，應(yīng)對誘變方法的產(chǎn)物篩選期望的活性。如此，在一些實施方案中，用于水解混合的有機廢物流的寡聚體酯組分或其他酶促轉(zhuǎn)化例如氧化的酶源自上文例如I (i) - (iv)部分中所描述的酶。如本文中使用的，術(shù)語“源自”意指該酶相比于野生型酶的氨基酸序列含有一個或多個氨基酸變化，其中一個或多個變化包括缺失、插入、取代、重排、點突變。技術(shù)人員會理解關(guān)于上文所述酶論述的EC分類系統(tǒng)是高度特異性的，且依賴于由酶催化的特定底物。因此，源自如所述酶之一的酶可歸類在與野生型酶不同的EC分類中。
[0174]在一個方面，所述非天然存在的酶源自以下一種或多種:P450細(xì)胞色素氧化酶、來自ECl.14.15.3類的ω-羥化酶、ω -加氧酶或烷-1-單加氧酶；脂肪醇氧化酶；來自ECl.1.1類的醇脫氫酶；Baeyer-Villiger單加氧酶；己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二酮?；饷福粊碜驭?，β -水解酶折疊家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶；或其組合。[0175]在另一個方面，所述非天然存在的酶源自以下一種或多種:來自ECl.1.1.245類的環(huán)己醇脫氫酶/ChnA ;來自ECl.14.13.22類的環(huán)己酮單加氧酶/ChnB ;來自EC3.1.1.17類的葡糖酸內(nèi)酯酶/ChnC ；來自ECl.1.1.2類的ChnD ；來自ECl.1.1.174類的環(huán)己烷-1,2-二醇脫氫酶；環(huán)己烷-1,2-二酮?；饷窫C3.7.1.10或EC3.7.1.11 ;脂肪酶(EC3.1.1.3);酯酶(EC3.1.1.1);角質(zhì)酶(EC3.1.1.74);聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76) ;1，4_ 內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25);葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17);漆酶(EC1.10.3.2);或其組合。
[0176]用于本發(fā)明方法的酶可針對許多參數(shù)進行改進。(Dalby，P.A (2003).0ptimising enzyme function by directed evolution.Current Opinion in StructuralBiology, 13，500-505)。所述酶可針對反應(yīng)速率相對于野生型酶改進，從而使得該酶能夠在限定時段內(nèi)將更多底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。這是有利的，因為它降低了實施本發(fā)明方法所花的時間。在一個備選方案中，所述酶可針對有機溶劑存在下酶的溶劑穩(wěn)定性相對于野生型酶改進。這是有利的，因為在一些實施方案中，本發(fā)明方法可全部或部分地在二相系統(tǒng)或混合的溶劑系統(tǒng)(例如混合的水/環(huán)己醇和環(huán)己酮系統(tǒng))中實施。在一個別的備選方案中，所述酶可針對在升高溫度處的活性相對于野生型酶改進。這是有利的，因為它意味著所述方法可全部或部分地在提高反應(yīng)速率的溫度實施(但其會使野生型酶失活)。 [0177]在一個別的備選方案中，將酶工程化為降低產(chǎn)物抑制和/或底物抑制。這有利地允許反應(yīng)中存在更高濃度的產(chǎn)物和/或底物。在一個別的備選方案中，可改變酶的底物反應(yīng)性。這意指工程化的酶能與野生型酶所不能與之反應(yīng)的底物反應(yīng)。這類酶通常在能夠進行期望反應(yīng)的野生型酶未知或不合適的情況下采用。底物特異性還可通過工程化該酶從而使其能接受并與野生型酶所不能與之反應(yīng)的底物反應(yīng)來改變。在又一個別的備選方案中，將酶工程化為將其PH最適性偏移到更酸性或更堿性的pH。這意指該酶能在適合工藝需要的PH采用。
[0178]在一個別的備選方案中，將編碼用于所要求保護的方法中的酶的基因進行密碼子優(yōu)化。如此，改變編碼該酶的DNA序列從而使得每個氨基酸的密碼子使用其要表達(dá)的宿主細(xì)胞中該氨基酸最普遍的tRNA。
[0179]在另一個備選方案中，可將多肽工程化為包含用于簡單純化的標(biāo)簽(例如His-標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽)。在另一個備選方案中，可將多肽工程化為包含定位序列以靶向多肽至特定的細(xì)胞位置，例如細(xì)胞器、胞外、細(xì)胞膜或周質(zhì)。
[0180]可在單一的工程化的酶中組合多種這些備選方案，例如密碼子優(yōu)化、修飾為包含定位序列和/或純化標(biāo)簽、和修飾為改變在溫度處的活性、底物抑制等。
[0181]酶的組合
[0182]在本文中所述的任一種方法或組合物中，可存在多種類型的酶。例如，可使用本文中論述的酶類型的任意組合，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12的組合。合適的酶包括但不限于:細(xì)胞色素P450或ω-羥化酶(ω-羥化酶)、脂肪酸氧化酶或伯醇脫氫酶、醛脫氫酶或ChnE、醇脫氫酶或ChnA、葡糖酸內(nèi)酯酶或Baeyer Villiger單加氧酶、環(huán)己燒-1, 2- 二酮酰基水解酶、環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶、羧酸酯酶或酯酶或脂肪酶或聚羥基鏈烷酸酯解聚酶、轉(zhuǎn)氨酶或6-氨基己酸脫氫酶、氨基水解酶、醛脫氫酶、和二胺氧化酶或二胺轉(zhuǎn)氨酶。
[0183]宿主細(xì)胞生物催化劑[0184]本發(fā)明涉及使用生物催化劑以將在環(huán)烷氧化如環(huán)己烷氧化的混合的有機廢物流例如不揮發(fā)性殘余物或水洗廢物流中發(fā)現(xiàn)的化合物酶促轉(zhuǎn)化成可用于尼龍合成的化合物。
[0185]用于本發(fā)明方法的生物催化劑可以多種形式引入反應(yīng)。在一個方面，每種酶以相同的形式。在另一個方面，以不同的形式提供酶。
[0186]表達(dá)可用于所要求保護方法中的一種或多種酶的宿主細(xì)胞生物催化劑可用作生物催化劑。使用的宿主細(xì)胞通常具有許多特性:它們可容易地進行遺傳修飾，對本發(fā)明方法中使用的條件耐受，且生長至工業(yè)可用的細(xì)胞密度。任選地，全細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，或可以是細(xì)胞系的細(xì)胞。全細(xì)胞可具有野生基因型。在此情況中，用于催化所要求保護方法中一個或多個步驟的酶是天然存在于全細(xì)胞的且在本發(fā)明方法中以具有工業(yè)用途的水平表達(dá)。在一個備選方案中，宿主生物已經(jīng)過遺傳修飾以在本發(fā)明方法中以具有工業(yè)用途的水平表達(dá)該酶。所述酶可源自其中表達(dá)該酶的細(xì)胞。在一個備選方案中，所述酶源自不同菌株或物種的細(xì)胞。
[0187]在一個方面，所述全細(xì)胞是原核生物的。在另一個備選中，其為真核生物的。通常使用單細(xì)胞微生物。
[0188]術(shù)語原核細(xì)胞包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌?？膳c本發(fā)明方法一起使用的革蘭氏陰性細(xì)菌的例子是大腸桿菌(Escherichia coli)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘脂單胞菌(sphingomonads)、假單胞菌(pseudomonads)、和屬于以下屬的其他細(xì)菌:沙門氏菌屬(Salmonella)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、產(chǎn)喊桿菌屬(Acaligenes)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、不動桿菌屬、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、固氮弓菌屬(Azoarcus)和紅螺菌屬(Rhodospirillum)?？膳c本發(fā)明方法一起使用的革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括:鏈球菌(streptococci)、乳桿菌(Iactobacilli),和屬于以下屬的其他細(xì)菌:諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉`菌屬(Streptomyces)和節(jié)桿菌屬(Arthobacter)。
[0189]真核宿主細(xì)胞包括那些來自酵母和其他真菌的?？膳c本發(fā)明方法一起使用的真核宿主細(xì)胞的例子包括:解脂西洋蓍霉、假絲酵母屬如熱帶假絲酵母(Candidatropicalis) >C.albicans、C.cloacae、C.guiIlermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、屬于紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母,和屬于以下屬的其他真菌:曲霉屬(Aspergillus)、外瓶霉屬(Exophiala)、毛霉屬(Mucor)、木霉屬(Trichoderma)、枝抱屬(Cladosporium)、平革菌屬(Phanerochaete)、Cladophialophora、擬青霉屬(Paecilomyces)、Scedosporium 和 Ophiostoma0
[0190]宿主細(xì)胞生物催化劑天然地或經(jīng)由遺傳修飾含有另外的酶途徑，其實施連同其他改進混合的有機廢物流的特性和組成的所要求保護的酶促轉(zhuǎn)化特別有用的酶促轉(zhuǎn)化。例如，天然存在的宿主細(xì)胞生物催化劑可含有增加混合的有機廢物流中己二酸的相對量所需的兩個酶途徑，所述增加通過將所述流中存在的至少一部分直鏈C4-C6 —元酸、羥基酸和含氧酸氧化成其相應(yīng)的二酸。這類過程需要宿主細(xì)胞細(xì)胞色素P450途徑以及另外的任選酶。宿主細(xì)胞中另外的內(nèi)源性或異源性酶途徑的存在對于增加混合的有機廢物流中二酸的相對量、增加己二酸的相對濃度和降低廢物流中一元酸和羥基酸的量、和/或?qū)U物流中存在的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω雙官能烷特別有用。
[0191]在一個方面，所述進行C4-C6或環(huán)C6 —元酸、羥基酸、或含氧酸到二酸的酶促轉(zhuǎn)化(經(jīng)由酮酸)的天然或非天然存在的宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性或異源性ω氧化途徑，其能夠進行以下一種或多種轉(zhuǎn)化:
[0192]將丁酸、戊酸和/或己二酸轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的二酸(即分別為琥珀酸、戊二酸和/或己二酸)；
[0193]將丁酸、戊酸和/或己二酸轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的羥基酸(即分別為4-羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸)；
[0194]將4-羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的含氧酸(即分別為4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸)；或
[0195]將4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的二酸(即分別為琥珀酸、戊
二酸和/或己二酸)。
[0196] 具有能夠?qū)⒅咀逯舅峤?jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸的內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑的宿主細(xì)胞可以是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。例示性的利用η-烷的酵母包括解脂西洋蓍霉、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides 或其組合，或紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母或其組合。利用n_烷的例示性細(xì)菌包括熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)、食油假單胞菌(P.0leoverans)、除經(jīng)海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、不動桿菌屬菌種如 A.venetianus、Oleiphilus messinensis、粘節(jié)桿菌(Arthrobacterviscosus) > Cupriavidus metallidurans、紅球菌屬菌種如紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)和紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、Delftia acidovorans、或 Alcanivoraxdiesolei或其組合。
[0197]在另一個方面，所述將混合的有機廢物流中存在的至少一部分環(huán)C6組分酶促轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸、或己二酸的天然或非天然存在的宿主細(xì)胞具有能夠⑴將環(huán)己醇轉(zhuǎn)化成6-氧己酸，(ii)將1，2-環(huán)己二醇轉(zhuǎn)化成6-氧己酸，和/或(iii)將6-氧己酸轉(zhuǎn)化成己二酸的內(nèi)源性或異源性途徑。
[0198]在將環(huán)己醇轉(zhuǎn)化成6-氧己酸中，宿主細(xì)胞催化環(huán)己醇到環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化；環(huán)己酮到ε -己內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化；ε -己內(nèi)酯到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化；和/或6-羥基己酸到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化。
[0199]在將1，2-環(huán)己二醇轉(zhuǎn)化成6-氧己酸中，宿主細(xì)胞催化環(huán)己烷-1，2- 二醇到環(huán)己烷-1，2- 二酮的轉(zhuǎn)化，或環(huán)己烷-1，2- 二酮到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化。
[0200]宿主細(xì)胞生物催化劑的修飾
[0201 ] 本發(fā)明方法中使用的生物催化劑可以是其中天然存在該酶的物種的未經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞。然而，可能需要遺傳修飾宿主細(xì)胞以產(chǎn)生工程化細(xì)胞。如本文中使用的，工程化細(xì)胞意指已經(jīng)過操作從而其基因組從野生型細(xì)胞的基因組變化的細(xì)胞?；蚪M的變化包括質(zhì)粒的導(dǎo)入和缺失。在一個方面，所述遺傳修飾是將核酸導(dǎo)入細(xì)胞基因組中。見圖3。導(dǎo)入細(xì)胞的核酸可以包含來自另一物種或生物的核酸序列，例如不存在于全細(xì)胞野生型基因組中的DNA序列。在其他情況中，導(dǎo)入的DNA序列可以是全細(xì)胞基因組中的DNA序列的額外拷貝。在一些備選方案中，所述遺傳修飾是從全細(xì)胞的基因組缺失DNA序列。在另一個方面，遺傳修飾是細(xì)胞基因組的修飾。
[0202]在一個備選方案中，工程化的細(xì)胞是原核生物的。在另一個備選中，其為真核生物的。通常使用單細(xì)胞微生物。
[0203]術(shù)語原核細(xì)胞包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。適合用作本發(fā)明工程化細(xì)胞的革蘭氏陰性細(xì)菌的例子是大腸桿菌(Escherichia coli)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘脂單胞菌(sphingomonads)、假單胞菌(pseudomonads)、和屬于以下屬的其他細(xì)菌:沙門氏菌屬(Salmonella)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、產(chǎn)喊桿菌屬(Acaligenes)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、不動桿菌屬、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、固氮弓菌屬(Azoarcus)和紅螺菌屬(Rhodospirillum)。適合用作本發(fā)明工程化細(xì)胞的革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括:鏈球菌(streptococci)、乳桿菌(Iactobacilli),和屬于以下屬的其他細(xì)菌:諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和節(jié)桿菌屬(Arthobacter)。
[0204]真核工程化細(xì)胞通常為酵母和其他真菌。真核工程化細(xì)胞的非限制性例子包括:解脂西洋蓍霉、假絲酵母屬如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、屬于紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲抱酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母，和屬于以下屬的其他真菌:曲霉屬(Aspergillus)、外瓶霉屬(Exophiala)、毛霉屬(Mucor)、木霉屬(Trichoderma)、枝抱屬(Cladosporium)、 平革菌屬(Phanerochaete)、Cladophialophora、擬青霉屬(Paecilomyces)、Scedosporium和Ophiostoma。在一個備選方案中，所述宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉。
[0205]i)導(dǎo)入的核酸序列
[0206]導(dǎo)入細(xì)胞的核酸可包含許多元件的一種或多種。通常地，元件之一將是編碼用在本發(fā)明方法中的酶的基因，所述酶例如細(xì)胞色素P450、ω-羥化酶(omega-羥化酶)、脂肪酸氧化酶、伯醇脫氫酶、酮還原酶、Baeyer-Villiger單加氧酶、己內(nèi)酯輕化酶、二酮水解酶、酯酶/脂肪酶、醛脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基水解酶或這些酶類型中任一種的工程化型。在一些備選方案中，所述核酸編碼不是在本發(fā)明方法中起作用的酶的蛋白質(zhì)，如伴侶蛋白或作為基因激活劑或阻遏物的蛋白質(zhì)。
[0207]通常地，核酸將設(shè)計為使得多肽可操作地連接于啟動子。如本文中使用的，術(shù)語“可操作連接”意指元件位于某位置從而使得其能夠指導(dǎo)多核苷酸或多肽的表達(dá)。這可通過將啟動子元件可操作連接至一種或多種在導(dǎo)入的核酸序列上表達(dá)的多肽，從而在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞之前建立可操作連接來安排。為了確保啟動子對一種或多種酶的可操作連接，啟動子應(yīng)置于酶的5’且啟動子和酶之間的序列中不應(yīng)存在符合閱讀框的終止密碼子?；蛘?，核酸可設(shè)計為使得當(dāng)其被導(dǎo)入時，核酸中的基因序列以某種方式置于宿主細(xì)胞的基因組中從而使其可操作連接于已存在于宿主細(xì)胞的基因組中的啟動子，因此可從該啟動子表達(dá)該酶。
[0208]ii)全細(xì)胞中多種酶的表達(dá)
[0209]在一些實施方案中，將全細(xì)胞的單一菌株用于表達(dá)超過一種用在本發(fā)明方法中的酶。在此情況中，多種酶可由相同的導(dǎo)入的核酸編碼。在一個備選方案中，所述酶可編碼在分開的導(dǎo)入的核酸片段上。所述酶可均從單個啟動子表達(dá)(例如通過將酶以操縱子的形式安排)。在一個備選方案中，所述酶可從多個分開的啟動子表達(dá)。在一些情況中，所述多個分開的啟動子可由相同的化學(xué)物誘導(dǎo)(例如，多種酶中的每一種可從酵母GAL啟動子表達(dá)，如此意味著每個基因可用半乳糖誘導(dǎo))。其他合適的啟動子是本領(lǐng)域中已知的。在一個備選方案中，編碼用在本發(fā)明方法中的酶的每個基因在不同啟動子的控制之下。如此，可經(jīng)由使用不同的誘導(dǎo)化合物來分別引入不同的酶。在另一個備選方案中，使用一種折中的辦法，其中許多酶在相同啟動子的控制之下，而許多酶在不同啟動子的控制之下。這一備選在全細(xì)胞中已生成大量酶途徑，且期望協(xié)同其他途徑成員來控制一種途徑的每個成員但分開控制每個途徑時特別有利。
[0210]iii)伴侶蛋白系統(tǒng)
[0211]當(dāng)細(xì)胞已工程化為在非自然條件下(例如，當(dāng)某物種天然的蛋白質(zhì)以高于自然水平的水平表達(dá)或者在一個備選方案中，當(dāng)來自不同物種的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時)表達(dá)蛋白質(zhì)時，在一些情況下該蛋白將不會以活性形式表達(dá)。相反它會不正確地折疊并累積為非功能性“包含體”聚集物。在此情況下，用于表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞可進行遺傳修飾以進一步表達(dá)伴侶蛋白，其能夠阻止該蛋白質(zhì)的錯誤折疊，或者能夠?qū)⑵鋸木奂癄顟B(tài)重折疊。
[0212]納入這類伴侶蛋白是有利的，因為它增加每細(xì)胞的活性蛋白質(zhì)的量，且因此增加本發(fā)明方法的總體效率。所表達(dá)的伴侶蛋白可以是宿主細(xì)胞的伴侶蛋白。在一個備選方案中，伴侶蛋白可來自與該蛋白質(zhì)相同的物種/菌株。典型的用于表達(dá)的伴侶蛋白包括GroEL/GroES家族的成員和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成員。原型大腸桿菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋白的同系物已在其他原核物種中鑒定出來，且真核同系物也是已知的(GroEL和GroES分別對應(yīng)于真核蛋白Hsp6`0和HsplO，而DnaJ、DnaK和Grp分別E對應(yīng)于真核蛋白Hsp70、Hsp40和Hsp24)。這些蛋白質(zhì)已在許多酵母物種(例如釀酒酵母)中鑒定出來。用于與用在本發(fā)明方法中的酶共表達(dá)的適宜伴侶蛋白的選擇對于遵循本文中教導(dǎo)的技術(shù)人員來說將是明顯的。
[0213]全細(xì)胞的代謝工程化
[0214]代謝工程化是優(yōu)化全細(xì)胞中參數(shù)以增加細(xì)胞產(chǎn)生一種化合物能力的過程。任選地，本發(fā)明方法中使用的全細(xì)胞已經(jīng)過工程化以優(yōu)化二酸，或己二酸或6-氧己酸、
I,6-hexanedoil、6_氨基己酸、己內(nèi)酰胺和六亞甲基二胺的輸出。
[0215]增加細(xì)胞產(chǎn)生一種化合物能力的代謝工程化主要經(jīng)由兩種途徑進行。第一種是優(yōu)化途徑中從起始材料產(chǎn)生期望產(chǎn)物的酶?？梢允褂眉夹g(shù)人員已知的技術(shù)(例如，二維電泳、使用同位素標(biāo)記的前體、和核磁共振(NMR)光譜學(xué))來測定途徑中每種中間物的濃度，并因此確定哪個酶轉(zhuǎn)化是限速步驟，即反應(yīng)方案中的哪個步驟最慢。這可以通過觀察中間物的積累來確定，中間物的積累指示作用于此中間物的酶在限制轉(zhuǎn)化的總體速率。在此情況中，因而應(yīng)增加該中間物反應(yīng)的速率。
[0216]作為一個例子，在本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)化可以是從己酸產(chǎn)生己烷-1，6-雙酸。該轉(zhuǎn)化(如圖2中顯示的)需要使用3種酶:將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸的細(xì)胞色素P450，將
6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成6-氧己酸的醇脫氫酶和將6-氧己酸轉(zhuǎn)化成己烷-1，6-雙酸的醛脫氫酶。
[0217]如果通過細(xì)胞色素P450從己酸產(chǎn)生6-羥基己酸的速率低于途徑中后續(xù)轉(zhuǎn)化進行(即通過醇脫氫酶和醛脫氫酶)的速率，那么應(yīng)提高產(chǎn)生6-羥基己酸的速率。這可通過許多手段來進行。首先，可以增加細(xì)胞色素P450的表達(dá)水平。任選地，這可以通過將編碼該酶的基因置于強啟動子例如T7啟動子(如果該酶在大腸桿菌中表達(dá))或TEF啟動子(如果該酶在酵母中表達(dá))的控制之下來實現(xiàn)。
[0218]第二個選項是增加細(xì)胞中存在的編碼該酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過將該基因置于多拷貝質(zhì)粒上，或通過將該基因的多個拷貝摻入宿主細(xì)胞的染色體中(這些拷貝可以摻入到染色體中的同一位置或染色體中的不同位置)。
[0219]第三，可對細(xì)胞色素P450酶進行誘變以將該酶進化為以更快的速率反應(yīng)或?qū)⒃撁高M行密碼子優(yōu)化以提高其表達(dá)。此描述是完全例示性的，而且可實施相同的過程來優(yōu)化用在本發(fā)明方法中的其他酶的表達(dá)，所述酶即ω-羥化酶(ω-羥化酶)、脂肪酸氧化酶、伯醇脫氫酶、酮還原酶、Baeyer-Villiger單加氧酶、己內(nèi)酯輕化酶、二酮水解酶、酯酶/脂肪酶、醛脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基水解酶或這些酶類型中任一種的工程化型。
[0220]己烷-1，6-雙酸的產(chǎn)生還可通過失活或降低能使底物、任意中間物或產(chǎn) 物轉(zhuǎn)向到并非本發(fā)明目標(biāo)的代謝途徑中的任意酶的活性來增加。在上文論述的例示性途徑中，己酸和己烷-1，6-雙酸均可受?；?CoA連接酶和/或CoA轉(zhuǎn)移酶作用。一旦連接于CoA，該化合物即可補料到細(xì)胞的氧化(beta-氧化)途徑中，從而導(dǎo)致該化合物的分解。如此，在一些實施方案中，用在本發(fā)明方法中的全細(xì)胞已經(jīng)過工程化以缺失一種或多種能夠?qū)oA連接至己酸、6-羥基己酸、6-氧己酸或己烷-1，6-雙酸的?；?Cok連接酶和/或CoA轉(zhuǎn)移酶。
[0221]在一個備選方案中，酰基-CoA連接酶和/或CoA轉(zhuǎn)移酶未缺失，而是經(jīng)過工程化從而使其不再作用于底物、中間物或產(chǎn)物(即它不再接受直鏈C6分子作為底物)，但保留將CoA連接至其他分子(通常為C3-C5鏈)的任何能力。
[0222]在一個方面，通過降低宿主細(xì)胞中C6組分分解代謝的速率來實現(xiàn)C6組分的高產(chǎn)率。這類辦法對于涉及以下的方法尤其有用:(i)增加混合的有機廢物流中己二酸的相對濃度以及降低一元酸和羥基酸的量，和/或(ii)將混合的有機廢物流中存在的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω-雙官能烷。具體地，混合物中存在的宿主細(xì)胞生物催化劑對己酸、羥基己酸和己二酸的分解代謝可通過降低經(jīng)由β -氧化到乙酰-CoA的降解來降低。
[0223]對混合的有機廢物流中存在的C6化合物的宿主細(xì)胞分解代謝的速率的降低可通過缺失或抑制宿主細(xì)胞生物催化劑中將己酸、羥基己酸和己二酸活化成其相應(yīng)CoA酯的酶來實現(xiàn)。例如，宿主細(xì)胞酶如CoA連接酶和轉(zhuǎn)移酶的缺失或抑制可降低分解代謝這些化合物的速率。再舉一個例子，宿主細(xì)胞酶如?；?Cok氧化酶和?；?Cok脫氫酶的缺失或抑制可降低己酸、羥基己酸和己二酸經(jīng)由宿主細(xì)胞的β -氧化途徑到其相應(yīng)CoA酯的速率。
[0224]在一個方面，通過代謝工程化來優(yōu)化NVR或COP酸中的種類進出細(xì)胞的運輸以改進底物的攝取和產(chǎn)物的分泌。這通過表達(dá)另外的一元酸運輸物，或通過將運輸物工程化以改進一元酸的攝取速率來實現(xiàn)?；蛘撸饔糜谝辉嵘系牡谝幻溉鏑ytP450可展現(xiàn)在細(xì)胞表面上以將一元酸轉(zhuǎn)化成以比一元酸更高的速率攝入細(xì)胞中的羥基酸。
[0225]通過生長全細(xì)胞生物催化劑將C3-C5分子用作碳源
[0226]在本發(fā)明方法中用作起始材料的環(huán)己烷氧化的混合的有機廢物流包含氧化的烴分子的混合物。所要求保護的方法改進混合的有機廢物流的特性和組成，其通過對所述流應(yīng)用至少一種生物催化劑，其將廢物流中存在的不想要組分酶促轉(zhuǎn)化成更期望的產(chǎn)物，從而經(jīng)處理的廢物流可用在后續(xù)化學(xué)和/或酶促加工中以提供期望產(chǎn)物的高產(chǎn)率，以盡可能高的純度。如上文描述的，環(huán)己烷氧化的所得產(chǎn)物包括原始C6分子的分解產(chǎn)物，包括戊酸、5-羥基戊酸、丁酸、4-羥基丁酸和丙酸，其見于NVR和/或水洗物中。為了改進NVR和/或水洗物的特性，將全細(xì)胞生物催化劑應(yīng)用于廢物流以利用起始材料中存在的不想要的化合物。
[0227]在一個方面，可通過減少廢物流中C3-C6組分的存在來降低混合的有機廢物流例如NVR的復(fù)雜性。一種實現(xiàn)降低的復(fù)雜性的方法是選擇能利用混合的有機廢物流的C3-C5組分作為用于生長的碳源的宿主細(xì)胞生物催化劑。這類混合的有機廢物流的復(fù)雜性中的降低對于直接提高己二酸的相對濃度以及間接提高己二酸的相對濃度可能有用，其通過促進己二酸從己酸、羥基-己酸和環(huán)C6化合物例如K和A的回收。
[0228]戊酸、丁酸和丙酸可被細(xì)胞用作碳源，其通過將CoA(輔酶A)連接至該分子以及CoA-連接的分子到細(xì)胞beta氧化途徑中的代謝。如此，在一些實施方案中，用在本發(fā)明方法中的全細(xì)胞生物催化劑包含?；?CoA連接酶和/或CoA轉(zhuǎn)移酶，其能將CoA連接至戊酸、丁酸和/或丙酸。另外，亦經(jīng)常存在于環(huán)己烷氧化的不揮發(fā)性殘余物和/或水洗物中的、用作本發(fā)明方法中的起始材料的5-羥基戊酸和4-羥基丁酸也可由全細(xì)胞代謝以進一步改進本發(fā)明方法的產(chǎn)物的純度。5-羥基戊酸可通過醇脫氫酶氧化成5-氧戊酸，而4-氧戊酸可通過醛脫氫酶相應(yīng)地氧化成戊烷-1，5-雙酸(戊二酸)。通過合適的?；?CoA連接酶和/或CoA轉(zhuǎn)移酶將CoA連接至戊烷-1，5-雙酸導(dǎo)致化合物經(jīng)由細(xì)胞的beta氧化途徑代謝。4-羥基丁酸可通過醇脫氫酶氧化成4-氧丁酸，其相應(yīng)地可通過醛脫氫酶氧化成丁烷-1，4-雙酸(琥珀酸)。琥珀 酸是三羧酸循環(huán)(也稱為檸檬酸循環(huán)或Krebs循環(huán))中的中心組分。丙酸亦可分解代謝成丙酮酸和丙氨酸。
[0229]預(yù)處理混合的有機廢物流以除去抑制性化合物
[0230]發(fā)明人已鑒定出作為主要抑制性化合物存在于混合的有機廢物流中的戊內(nèi)酯，并確認(rèn)戊內(nèi)酯負(fù)責(zé)阻止NVR耐受性宿主細(xì)胞的生長。基于鑒定出戊內(nèi)酯為NVR的關(guān)鍵抑制性組分，廢物流可進行適宜處理以從廢物流除去戊內(nèi)酯或減少廢物流中存在的戊內(nèi)酯量，從而允許在NVR存在下的適宜宿主細(xì)胞生長。
[0231]在一個方面，將混合的有機廢物流用游離或固定化的水解抑制性化合物，或者有效從所述流除去抑制性化合物的酶預(yù)處理。這類抑制性化合物的除去減輕混合的有機廢物流中對宿主細(xì)胞生長的抑制。
[0232]所述不揮發(fā)性殘余物、COP酸或水洗流在水解聚合酯之前和/或在其用作底物之前可經(jīng)歷預(yù)處理以除去抑制性化合物。例如，存在于水洗物中的烴基氫過氧化物可通過用合適的生物催化劑處理來除去，所述生物催化劑如過氧化物酶/過氧化氫酶，例如KatA、KatG和ECl.11.1_類中的其他酶，包括烴基氫過氧化物還原酶(例如酵母中的Ahpl或細(xì)菌中的AhpC)、ECl.11.1.15和其他烴基氫過氧化物還原酶(例如ECl.8.1.-和ECl.6.99.3)，有或者無電子供體地，如AhpD或AhpF。羧酸酯酶(水解混合物中的聚合酯)和作用于烴基氫過氧化物的酶的組合可用作酶制備物，其在添加到生物反應(yīng)器之前添加到所述流中，或通過將未經(jīng)處理的流給料到含微生物培養(yǎng)物(能通過分泌脂肪酶/酯酶水解聚合酯并同時將有機氫過氧化物還原)的‘預(yù)發(fā)酵罐’中，接著將上清液給料到第二生物反應(yīng)器中以用于產(chǎn)生有價值的化合物。
[0233]另外，可將混合的有機廢物流用內(nèi)酯水解酶或能從所述流除去抑制性內(nèi)酯組分的其他酶(宿主細(xì)胞生物催化劑或從宿主細(xì)胞分離的酶)處理，由此改進使用所述流作為碳源的宿主細(xì)胞的生長。微生物在混合的有機廢物流中的生長可能受到這類抑制性化合物存在的損害。具體地，在含NVR的培養(yǎng)物中生長的各種解脂西洋蓍霉的菌株不能達(dá)到穩(wěn)定態(tài)，這是戊內(nèi)酯累積的結(jié)果。見實施例4。然而，表達(dá)并分泌內(nèi)酯水解酶(將戊內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成羥基戊酸)的宿主細(xì)胞可在NVR中成功生長，因為已從培養(yǎng)基中除去了抑制性化合物。見實施例5。
[0234]選擇對混合的有機廢物流耐受的宿主細(xì)胞
[0235]或者，為了改進生物催化劑在含有混合的有機廢物流的培養(yǎng)物中的生長，可選擇對混合的有機廢物流耐受，例如能在含NVR、COP酸或水洗廢物流的培養(yǎng)物中生長的宿主細(xì)胞。
[0236]此外，可在包含按體積計特定百分比的經(jīng)處理混合的有機廢物流的培養(yǎng)物中生長耐受性宿主細(xì)胞。耐受性宿主細(xì)胞連同經(jīng)預(yù)處理的混合的有機廢物流(例如應(yīng)用水解酶以除去內(nèi)酯化合物如戊內(nèi)酯)的使用可顯著改進宿主細(xì)胞在含有廢物流材料的培養(yǎng)基中的生長。
[0237]在一個方面，所述生物催化劑是天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞，其對混合的有機廢物流如NVR耐受。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的混合的有機廢物流耐受。例如，所述宿主細(xì)胞生物催化劑能在含至少1%NVR的培養(yǎng)物中實現(xiàn)穩(wěn)定態(tài)生長。
[0238]在另一個方面，通過降低混合的有機廢物流中存在的抑制性化合物的量來改進宿主細(xì)胞對混合的有機廢物流的耐受性。如上文論述的，將廢物流用酶的1，4_內(nèi)酯酶類(EC3.1.1.25)預(yù)處理以將培養(yǎng)基中的戊內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成羥基戊酸(caleric acid)可促進在剩余廢物流組分存在下的細(xì)胞生長。另外，酶的葡糖酸內(nèi)酯酶類(EC3.1.1.17)也可用于將內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的酸形式，羥基羧酸。見實施例5。
[0239]在一個方面，混合的有機廢物流中存在的抑制性化合物是內(nèi)酯，且混合的有機廢物流中的內(nèi)酯量通過在用天然存在或非天然宿主細(xì)胞處理混合的有機廢物流之前或期間用一種或多種能將內(nèi)酯水解成相應(yīng)羥基酸的酶來處理所述流得到降低，所述宿主細(xì)胞能介導(dǎo)增加二酸的相對量、增加己二酸的相對濃度和降低一元酸和羥基酸的量、和/或?qū)6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω雙官能烷所需要的轉(zhuǎn)化。
[0240]產(chǎn)物的分離和回收
[0241]本發(fā)明還提供本文中所述單體組分(例如二酸、己二酸)的分離和/或回收。例如，本發(fā)明提供在將混合的有機廢物流的6碳組分例如6-氧己酸轉(zhuǎn)化成己二酸之后從反應(yīng)混合物分離己二酸或己二酸衍生物的方法。這些分離的產(chǎn)物可通過除去能在初始步驟中除去的C4和C5 二酸和/或衍生物來進一步純化。
[0242]在一個方面，`從其他組分分離己二酸，其通過將己二酸從濃縮的反應(yīng)混合物結(jié)晶或通過酯化和蒸餾來自反應(yīng)混合物的己二酸二酯。
[0243]如上文論述的，可使用生物催化劑來將直鏈C4-C6 —元酸和羥基酸組分以及環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成C4-C6 二酸的混合物，所述混合物能隨后分開為C4、C5和C6 二酸。在一個方面，所述二酸混合物在分離成C4、C5和C6 二酸之前酯化。
[0244]混合的有機廢物流和生物催化劑的組合物
[0245]本發(fā)明還提供包含環(huán)己烷氧化工藝的混合的有機廢物流和生物催化劑的組合物。在一個方面，所述混合的有機廢物流是NVR、水洗物/COP酸、或苛性水流。
[0246]在一個方面，所述生物催化劑是分離的酶或由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶。所述組合物可包含一種或多種選自前文部分中詳述的酶的酶或其非天然存在的變體。
[0247]在一個方面，所述組合物包含對混合的有機廢物流耐受的宿主細(xì)胞生物催化劑。換言之，生物催化劑能在含有混合的有機廢物流的培養(yǎng)物中生長至工業(yè)可用的密度。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞對NVR耐受。在另一個方面，所述宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的混合的有機廢物流耐受。因此，所述宿主細(xì)胞能在含有按體積計1%的混合的有機廢物流的培養(yǎng)物中生長至工業(yè)可用的密度。
[0248]Omega氧化(ω -氧化)是脂肪酸代謝的相對于beta氧化(β氧化)的備選途徑。ω_氧化途徑牽涉ω碳，即離脂肪酸羧基基團最遠(yuǎn)的碳的氧化，其不同于牽涉β碳的β氧化途徑。ω-氧化過 程正常為中等鏈脂肪酸即C10-12的次要分解代謝途徑，但該途徑在
氧化有缺陷時變得更為重要。ω-氧化過程牽涉ω碳的羥基化和繼續(xù)氧化，其得到己二酸和其他產(chǎn)物例如琥珀酸。
[0249]在一個方面，所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞生物催化劑包含內(nèi)源性或異源性ω_氧化途徑，其能將脂肪族脂肪酸經(jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸。優(yōu)選地，所述具有ω -氧化途徑的宿主細(xì)胞生物催化劑是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。
[0250]熟練技術(shù)人員知曉適合用在所要求保護方法中的大量利用η-烷的酵母或細(xì)菌。在一個方面，例示性利用η-烷的酵母包括解脂西洋蓍霉、熱帶假絲酵母、白色假絲酵母、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其組合，紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)的酵母或其組合。在另一個方面，例示性的利用η-烷的細(xì)菌包括熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)、食油假單胞菌(P.0leoverans)、除烴海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、不動桿菌屬菌種如 A.venetianus、Oleiphilusmessinensis、粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosus) > Cupriavidus metallidurans、紅球菌屬菌種如紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)和紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia) > Delftia acidovorans、Alcanivorax diesolei 或其組合。
[0251]發(fā)酵工藝
[0252]本發(fā)明的發(fā)酵工藝可以分批、補料分批或連續(xù)模式進行。在補料分批模式中，該工藝可用部分滴液(partial drops)進行?；蛘?，可以采用恒化器發(fā)酵，有或無細(xì)胞截留地。見實施例3。此外，可將廢物流中的組分作為唯一碳源和能量源補料，或者可將甘油或糖或其他合適的可發(fā)酵碳源或能量源共補料用作另外的能量源和碳源以獲得更高的生物質(zhì)?？擅子锰荚聪拗菩耘囵B(yǎng)來降低NVR和COP酸中種類的毒性。在一個優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)在5-8的pH范圍內(nèi)，更優(yōu)選在pH6至pH7.5進行以克服未解離的有機酸的生長抑制。
[0253]以下實施例不意圖以任何方式限制本發(fā)明。
實施例
[0254]實施例1 - NVR、COP酸和水洗物中寡聚體酯的水解
[0255]篩選來自基于其結(jié)合位點表面狀況的不同類別的商業(yè)性脂肪酶(游離和固定化的)和酯酶對NVR和COP酸中寡聚體酯的水解(表1和表2)?；诖撕Y選的結(jié)果，使用脂肪酶工程化數(shù)據(jù)庫(Lipase Engineering database) (LED) (ffidmann 等,BMCGenomics2010, 11:123)和其他生物信息學(xué)資源來鑒定另外的候選酶以篩選對寡聚體酯的水解，且尤其是在低PH熱穩(wěn)定或有活性的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解還可以改變具有期望活性的酶的pH最適度和穩(wěn)定性,或者改變具有期望pH和穩(wěn)定性特性或兩者的酶的底物特異性，其通過使用合理設(shè)計或定向進化技術(shù)的酶工程。
[0256]驗證用商品化脂肪酶和酯酶水解NVR和COP酸中寡聚體酯的篩選方法,其使用具有一定分子量范圍的商品化己內(nèi)酯二醇(CPL)聚合物。使用瓊脂板測定法和生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)來鑒定候選的酶，其中在瓊脂板測定法中如果瓊脂中的寡聚體水解則徑向酶擴散產(chǎn)生清空區(qū)(clearance zone),而生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)通過HPLC與UV檢測或LC-MS測定以量化單體的濃度。兩種篩選方法提供互補的信息:用板測定法觀察到的清空區(qū)的大小指示將寡聚體水解成更小可溶酯的總體水解活性(內(nèi)切和外切)，而液相層析提供關(guān)于單體濃度增加的數(shù)據(jù)，如此鑒定出水解寡聚體的末端單體的酶。
[0257]對于板測定法， 用50mM檸檬酸鹽、Tris/HCl或磷酸鹽緩沖液制備含1_4%聚己內(nèi)酯(PCL)、NVR或COP酸(v/v)的瓊脂板(1.5%瓊脂糖)以測定酶在pH3, 5 (3.5)，5，7&8的水解活性。PCL的分子量是530g/mol。在板中制有約3mm直徑的孔，并添加酶(1U/孔)。在24小時后測量清空區(qū)。見表1和2，其顯示分別比較商業(yè)性脂肪酶和酯酶水解NVR、COP酸中寡聚體和己內(nèi)酯聚合物的活性的結(jié)果。
[0258]使用與板測定法相同的緩沖液和底物濃度實施與未結(jié)合的商業(yè)性酯酶和脂肪酶的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)通過添加商業(yè)性酶制備物(lU/ml)開始。在固定化脂肪酶的情況中，使用ChiralVision ImmozymeTM脂肪酶試劑盒(酶共價結(jié)合于聚丙烯酸珠)來水解NVR中的寡聚體酯。將固定化的酶(IOOmg)與Iml磷酸鹽緩沖液pH7.0中2%NVR(v/v)溫育。在16小時后，通過在100°C將酶失活I(lǐng)Omin停止生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，離心、過濾并通過HPLC或LC-LC-MS分析。見圖4，其顯示瓊脂板上的典型清空區(qū)，和圖5，其比較通過在不同pH的酯酶清空區(qū)直徑測量的相對活性。
[0259]HPLC分析在Shimadzu HPLC2100系統(tǒng)上進行，DAD檢測器在2IOnm處監(jiān)測。分離在Synergi Fusion RP柱(250mmx4.6mm)上以0.9ml/min的流速進行，并使用磷酸和乙腈
洗脫樣品。
[0260]LC-MS 分析在與 Agilent6530Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 偶聯(lián)的Agilentl290Infinity UHPLC 系統(tǒng)上進行。
[0261]酸和內(nèi)酯的LC條件:[0262]柱:100x2mm Synergi Fusion RP 柱(Phenomenex)
[0263]柱烤箱溫度:40°C
[0264]注射體積:2 μ L
[0265]洗脫液:A:含0.1%乙酸的5mM醋酸銨
[0266]B:含5%水的乙腈
[0267]梯度:
時間(m_%流動相A %窺__8流速
0.0099 IOJOOmIiniia
[0268]1.00—
6.00__8020
7.5060 I 40I_
8.006040
[0269]&2099I
10.00I 99 II_I
[0270]MS Q-TOF條件:離子源:`ESI (Electro Spray 1nization)。極性模式:陰性(酸)和陽性(內(nèi)酯)。
[0271]圖6、7、8和9顯示由于通過商業(yè)性脂肪酶和酯酶的作用NVR和COP酸中寡聚體酯的水解所導(dǎo)致的單體(己酸、羥基己酸、己二酸和總酸)濃度的增加，如通過LC和LC/MS測定的。如通過LC/MS測量的從NVR中寡聚體酯釋放單體顯示于圖10。
[0272]表1.針對NVR和COP酸中寡聚體水解評估的商業(yè)性酯酶和脂肪酶
[0273]
【權(quán)利要求】
1.一種用于富集環(huán)烷氧化工藝混合的有機廢物流中的單體含量的方法，包括: (a)將生物催化劑與來自環(huán)烷氧化工藝的混合的有機廢物流組合；并 (b)將所述廢物流的二聚體和/或寡聚體組分酶促轉(zhuǎn)化成單體組分。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其包括用所述生物催化劑處理所述混合的有機廢物流，其中所述生物催化劑包含至少一種水解酶、天然存在的宿主細(xì)胞或非天然存在的宿主細(xì)胞； 將所述廢物流中的寡聚體酯水解成單體，并 增加所述混合的有機廢物流中的單體組分量。
3.依照權(quán)利要求1的方法，包括: 用天然或非天然存在的宿主細(xì)胞處理所述混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地: a.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分寡聚體酯酶促水解成單體； b.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分內(nèi)酯酶促水解成羥基酸；或 c.將所述混合的有機酸廢物流中的至少一部分直鏈C4-C6—元酸、羥基酸和含氧酸酶促氧化成相應(yīng)的二酸，和 增加所述流中二酸的相對量。
4.依照權(quán)利要求1的方法，包括: 用非天然存在的宿主細(xì)胞處理`所述混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地: a.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分寡聚體酯酶促水解成單體； b.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分ε-己內(nèi)酯酶促水解成6-羥基-己酸； c.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分己酸、6-羥基己酸和6-氧己酸酶促氧化成己二酸； d.將所述混合的有機廢物流中的至少一部分環(huán)C6組分酶促轉(zhuǎn)化成己二酸； e.對所述混合的有機廢物流中存在的至少一部分C3、C4和C5組分進行酶促分解代謝；或 f.以低于C3、C4和C5組分的速率對所述混合的有機廢物流中的C6組分進行酶促分解代謝，和 增加所述廢物流中己二酸的相對濃度和降低所述流中一元酸和羥基酸的量。
5.依照權(quán)利要求1的方法，包括: 用非天然存在的宿主細(xì)胞處理所述混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞單獨或組合地: 1.將所述混合的有機物中的至少一部分寡聚體酯酶促水解成單體； ?.將所述混合的有機物中的至少一部分己酸酶促氧化成6-羥基己酸； ii1.將所述混合的有機物中的至少一部分環(huán)C6組分酶促轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸或6-氧己酸； iv.對所述混合的有機廢物流中的至少一部分C3、C4和C5組分進行酶促分解代謝；或 V.以低于C3、C4和C5組分的速率對所述混合的有機廢物流中的C6組分進行酶促分解代謝；并表達(dá)至少一種生物合成途徑酶以將己二酸、6-羥基己酸或6-氧己酸轉(zhuǎn)化成1,6-己二醇、6-氨基己酸、ε -己內(nèi)酰胺或六亞甲基二胺，和 將所述流中存在的C6組分和前體轉(zhuǎn)化成α，ω-雙官能C6烷。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述混合的有機廢物流包含NVR、水洗物、COP酸、苛性洗流(caustic wash stream)或其組合。
7.權(quán)利要求2-5中任一項的方法，其還包括通過分離的或固定化的水解酶，或由天然或非天然存在的宿主細(xì)胞在發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化期間分泌的內(nèi)源性或異源性水解酶將寡聚體酯水解成單體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述水解酶(EC3.1.1.-)是脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角質(zhì)酶(EC3.1.1.74)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76),內(nèi)酯水解酶；葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)、漆酶(EC1.10.3.2)、或其組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)酯水解酶是1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)。
10.權(quán)利要求2-5中任一項的方法，其還包括通過在酸性pH、生理學(xué)pH或堿性pH有活性的水解酶催化寡聚體酯水解成單體。
11.權(quán)利要求2的方法，其中用所述水解酶處理降低所述混合的有機廢物流的粘度以改進燃燒所述流的效率和/或準(zhǔn)備所述流用于進一步化學(xué)或生物處理。
12.權(quán)利要求11的方法，其還包括燃燒所述經(jīng)處理的混合的有機廢物流用于燃料值或產(chǎn)生合成氣。
13.權(quán)利要求11的方法，其還包括將所述經(jīng)處理的混合的有機廢物流的一種或多種組分用于酯化以產(chǎn)生混合的酯或多元醇、氫化成二醇、氧化成二酸、還原性氨基化、磺化、或用NH4OH或多胺處理。
14.權(quán)利要求2的方法，包括用另外的分離、化學(xué)轉(zhuǎn)化或通過生物催化劑的酶促轉(zhuǎn)化同時將寡聚體酯水解成單體。
15.權(quán)利要求3-5中任一項的方法,其中可將C4-C6或C6—兀酸、羥基酸和含氧酸經(jīng)由含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸的所述天然或非天`然存在的宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑，其催化一種或多種以下轉(zhuǎn)化: a.將丁酸、戊酸和/或己二酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸、戊二酸和/或己二酸； b.將丁酸、戊酸和/或己二酸轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸； c.將4-羥基丁酸、5-羥基戊酸和/或6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸；或 d.將4-氧丁酸、5-氧戊酸和/或6-氧己酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸、戊二酸和/或己二酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中具有內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑的所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞將脂肪族脂肪酸經(jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸，且所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述利用η-烷的酵母是解脂西洋蓍霉(YairowiaIipolytica)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、白色假絲酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis、C.zeylenoides 或其組合，或紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和油脂酵母屬(Lipomyces)的酵母或其組合；且其中所述利用n_燒的細(xì)菌是突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)、食油假單胞菌(P.0leoverans)、除經(jīng)海桿菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、Acinetobactervenetianus>OleiphiIus messinensis、粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosus) >Cupriavidusmetallidurans、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、Delftia acidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其組合。
18.權(quán)利要求4或5的方法，其中將所述廢物流的至少一部分環(huán)C6組分轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸或己二酸的所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性或異源性途徑，其催化一種或多種以下轉(zhuǎn)化: 1.環(huán)己醇到6-氧己酸，其中催化一種或多種以下轉(zhuǎn)化: a.環(huán)己醇到環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化； b.環(huán)己酮到己內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化； c.ε-己內(nèi)酯到6-羥基己酸的轉(zhuǎn)化；或 d.6-羥基己酸到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化； I1.1，2-環(huán)己二醇到6-氧己酸，其中催化一種或多種以下轉(zhuǎn)化: a.環(huán)己烷-1，2-二醇到環(huán)己烷-1，2- 二酮的轉(zhuǎn)化；或 b.環(huán)己烷-1，2-二酮到6-氧己酸的轉(zhuǎn)化；和 II1.6-氧己酸到己二酸的轉(zhuǎn)化。
19.權(quán)利要求2-18中任一項的方法，其中所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞對NVR耐受。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的所述混合的有機廢物流耐受。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其包括通過降低所述流中抑制性化合物的量而改進所述宿主細(xì)胞對所述混合的有機廢物流的耐受性。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述抑制性化合物包括內(nèi)酯，且其中所述方法進一步包括降低所述混合的有機廢物流中內(nèi)酯的量，其通過在用所述天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞處理所述混合的有機廢物流之前或期間，用一種或多種將內(nèi)酯水解成相應(yīng)羥基酸的生物催化劑處理所述流進行。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述生物催化劑是由所述宿主細(xì)胞表達(dá)并在發(fā)酵期間分泌的酶。
24.權(quán)利要求4或5的方法，其包括降低所述宿主細(xì)胞對C6化合物的分解代謝速率以提供來自所述廢物流的更高C6組分產(chǎn)率。
25.權(quán)利要求24的方法，其包括降低己酸、羥基己酸和己二酸經(jīng)由宿主細(xì)胞的β-氧化到乙酰-CoA的降解。
26.權(quán)利要求25的方法，其中通過缺失或抑制使用己酸、羥基己酸和己二酸來生成CoA酯的酶而降低經(jīng)由氧化對己酸、羥基己酸和己二酸的降解。
27.權(quán)利要求26的方法，其包括通過缺失或抑制氧化CoA酯的酶而降低經(jīng)由β-氧化對己酸、羥基己酸和己二酸的降解。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中所述CoA酯包含CoA連接酶、轉(zhuǎn)移酶、?；?CoA氧化酶或?；?Cok脫氫酶。
29.權(quán)利要求3的方法，其包括在分離成C4、C5或C6二酸之前將所述二酸混合物酯化。
30.權(quán)利要求3-5中任一項的方法，其包括從所述混合物結(jié)晶出己二酸。
31.權(quán)利要求5的方法，其中將寡聚體酯、己酸和環(huán)C6化合物轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸和己二酸的所述非天然存在的宿主細(xì)胞還產(chǎn)生1，6-己二醇。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述產(chǎn)生1，6_己二醇的宿主細(xì)胞表達(dá)催化6-氧己酸到6-羥基己酸轉(zhuǎn)化的醛脫氫酶，和催化6-羥基己酸到1，6-己二醇轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶。
33.權(quán)利要求5的方法，其中將寡聚體酯、己酸和環(huán)C6化合物轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸、6-氧己酸或己二酸的所述非天然存在的宿主細(xì)胞還產(chǎn)生6-氨基己酸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述產(chǎn)生6-氨基己酸的非天然存在的宿主細(xì)胞表達(dá)將6-氧己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸的氨基轉(zhuǎn)移酶。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述產(chǎn)生6-氨基己酸的非天然存在的宿主細(xì)胞還表達(dá)將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成ε-己內(nèi)酰胺的氨基水解酶。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述產(chǎn)生6-氨基己酸的非天然宿主細(xì)胞產(chǎn)生六亞甲基二胺，其經(jīng)由將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛的醛脫氫酶和將6-氨基己醛轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺的1-氨基轉(zhuǎn)移酶。
37.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其中所述生物催化劑包含分離的酶或由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶，且所述酶是Ρ450細(xì)胞色素氧化酶、來自ECl.14.15.3類的ω-羥化酶、ω-加氧酶或烷-1-單加氧酶；脂肪醇氧化酶；來自ECl.1.1類的醇脫氫酶；Baeyer_Villiger單加氧酶；己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二酮?；饷福换騺碜驭?，β -水解酶折疊家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶。`
38.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其中所述生物催化劑是分離的酶或由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶，且所述酶是來自ECl.1.1.245類的環(huán)己醇脫氫酶/ChnA;來自ECl.14.13.22類的環(huán)己酮單加氧酶/ChnB ;來自EC3.1.1.17類的葡糖酸內(nèi)酯酶/ChnC ；來自ECl.1.1.2類的ChnD ；來自ECl.1.1.174的環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶；來自EC3.7.1.10或EC3.7.1.11的環(huán)己烷_1，2-二酮?；饷福恢久?EC3.1.1.3);酯酶(EC3.1.1.1);角質(zhì)酶(EC3.1.1.74);聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76) ;1，4_ 內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25);葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17);漆酶(EC1.10.3.2);或其組合。
39.權(quán)利要求3-5中任一項的方法，其包括用宿主細(xì)胞生物催化劑處理所述混合的有機廢物流，所述宿主細(xì)胞生物催化劑在ΡΗ5.0-8.0利用所述廢物流中的碳源。
40.一種組合物，其包含環(huán)烷氧化工藝的混合的有機廢物流和生物催化劑。
41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述混合的有機廢物流是NVR、水洗物、COP酸、苛性洗流或其組合。
42.權(quán)利要求39或40的組合物，其中所述生物催化劑是分離的酶或由天然存在或非天然存在的宿主細(xì)胞分泌的酶。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述宿主細(xì)胞對NVR耐受。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述宿主細(xì)胞對按體積計至少1%的所述混合的有機廢物流耐受。
45.權(quán)利要求42-44中任一項的組合物，其中所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞包含內(nèi)源性或異源性ω-氧化途徑，其將脂肪族脂肪酸經(jīng)由羥基酸和含氧酸轉(zhuǎn)化成二酸，且其中所述天然或非天然存在的宿主細(xì)胞是利用η-烷的酵母或細(xì)菌。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述利用η-烷的酵母是解脂西洋蓍霉、熱帶假絲酵母、白色假絲酵母、C.cloacae、C.guillermondi1、C.1ntermedia、麥芽糖假絲酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides或其組合，或紅酵母屬、根霉屬、絲孢酵母屬、德巴利氏酵母屬和油脂酵母屬的酵母或其組合；且其中所述利用η-烷的細(xì)菌是熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、食油假單胞菌、除烴海桿菌、Acinetobacter venetianus、Oleiphilus messinensis、粘節(jié)桿菌、Cupriavidus metallidurans、紅串紅球菌、Sphingomona spaucimobilis、洋蔥伯克霍爾德氏菌、Delftia acidovorans、Alcanivoraxdiesolei或其組合。
47.權(quán)利要求42的組合物，其中所述酶是水解酶。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述水解酶是脂肪酶(EC3.1.1.3)、酯酶(EC3.1.1.1)、角質(zhì)酶(EC3.1.1.74)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)解聚酶(EC3.1.1.75&EC3.1.1.76)、內(nèi)酯水解酶；葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)、漆酶(EC1.10.3.2)、或其組合。
49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述內(nèi)酯水解酶是1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.25)。
50.權(quán)利要求42的組合物，其中所述酶是P450細(xì)胞色素氧化酶、來自ECl.14.15.3類的ω羥化酶、ω-加氧酶或烷-1-單加氧酶；脂肪醇氧化酶；來自ECl.1.1類的醇脫氫酶；Baeyer Villiger單加氧酶；己內(nèi)酯內(nèi)酯水解酶；脂肪醇氧化酶；醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二醇脫氫酶；環(huán)己烷-1，2- 二酮?；饷福粊碜驭?，β -水解酶折疊家族(EC3.1.1.-)的羧酸酯酶；或其組合。
51.權(quán)利要求50的組合物，其中所述酶是來自ECl.1.1.245類的環(huán)己醇脫氫酶/ChnA ；來自ECl.14.13.22類的環(huán)己酮單加氧酶/ChnB ;來自EC3.1.1.17類的葡糖酸內(nèi)酯酶/ChnC;來自ECl.1.1.2類的ChnD;來自ECl.1.1.174的環(huán)己烷_1，2-二醇脫氫酶；來自EC3.7.1.10或EC3.7.1.11的環(huán)`己烷-1, 2- 二酮?；饷福换蚱浣M合。
52.權(quán)利要求1-39中任一項的方法，其進一步包括從所述廢物流回收或分離所述單體組分、二酸、己二酸或其他α，ω-雙官能C6烷。
53.一種用于補料分批或連續(xù)培養(yǎng)微生物的方法，其包括: 在存在NVR、COP酸或水洗物的情況下培養(yǎng)微生物，且其中所述NVR、COP酸或水洗物供應(yīng)所述微生物生長所需的至少一些碳，和 富集所述NVR、COP酸或水洗物中的單體含量，其中所述微生物將所述廢物流的二聚體和/或寡聚體組分酶促轉(zhuǎn)化成單體組分。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述培養(yǎng)物的pH控制為6.0至7.5。
55.權(quán)利要求53或54的方法，其進一步包括為所述營養(yǎng)給料或所述廢物流供應(yīng)另外的可發(fā)酵碳源如甘油或葡萄糖。
56.權(quán)利要求53-55中任一項的方法,其進一步包括在補料分批發(fā)酵情況中或在恒化器培養(yǎng)期間使用部分滴液(partial drops)的細(xì)胞截留。
57.權(quán)利要求53-56中任一項的方法，其中所述微生物是解脂西洋蓍霉。
58.權(quán)利要求53-57中任一項的方法，其中所述單體組分包含二酸、己二酸、α，ω-雙官能烷或其組合。
【文檔編號】C12P1/02GK103732569SQ201280040157
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月17日
【發(fā)明者】P.S.珀爾曼, 陳昌林, A.L.波特斯 申請人:英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司