用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置和實(shí)施這種裝置的引導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置，包括具有用于與細(xì)胞接觸的織紋表面的底層，所述織紋表面具有由突起物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明也涉及用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法，包括使細(xì)胞與具有織紋表面和各向異性三維結(jié)構(gòu)的底層接觸，所述結(jié)構(gòu)由之前描述的傾斜突起物構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的裝置或方法可以特別應(yīng)用于皮膚病學(xué)、移植學(xué)和組織工程領(lǐng)域。
【專利說明】用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置和實(shí)施這種裝置的引導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的主題是用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置，包括具有織紋表面的底層，所述織紋表面具有用于與細(xì)胞接觸的各向異性的三維結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞遷移對許多生理過程例如器官形成和傷口愈合而言是必不可少的。在它們的天然環(huán)境中，細(xì)胞遷移的方向和速度由可以是化學(xué)(趨化因子)或物理(微環(huán)境)的許多信號來引導(dǎo)。
[0003]在體外，這些現(xiàn)象可以被復(fù)制或轉(zhuǎn)移以將遷移方向施加于細(xì)胞，例如使用趨化物或電場或通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的機(jī)械環(huán)境。
[0004]例如，文獻(xiàn)EP-A-1199354描述了通過細(xì)胞遷移的化學(xué)控制在表面上形成細(xì)胞圖案(pattern)。事實(shí)上，在文獻(xiàn)EP-A-1199354中，表面被處理以便顯示出由促進(jìn)細(xì)胞生長的化合物和其他不促進(jìn)細(xì)胞生長的化合物組成的預(yù)圖案。然后在該預(yù)圖案上開始細(xì)胞的培養(yǎng)。然而，通過這種系統(tǒng)類型控制細(xì)胞遷移的效果主要取決于根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì)促進(jìn)或阻止細(xì)胞生長的化合物的選擇。
[0005]文獻(xiàn)US2007/0009572在其部分描述了制備微織紋或納米織紋的可生物降解的薄膜的方法，所述薄膜包含其上淀積肌細(xì)胞的通道，其寬度可以為10-160μπι。所進(jìn)行的測試表明肌細(xì)胞沿著所述通道彼此對準(zhǔn)，以及它們的形態(tài)被修改以具有伸長的形狀。該方法的目的不是使細(xì)胞以優(yōu)選方向遷移，而只是促進(jìn)其彼此對準(zhǔn)以獲得均勻的細(xì)胞堆疊。
[0006]文獻(xiàn)US2009/02481445也描述了使用包含微通道或一系列彼此平行的微通道的表面根據(jù)三維結(jié)構(gòu)引導(dǎo)細(xì)胞定向的方法，所述微通道的寬度大于細(xì)胞的寬度，以使細(xì)胞可以進(jìn)入其中，以及所述微通道的橫截面是任意的。關(guān)于該之前的文獻(xiàn)，該方法的目的不是使細(xì)胞以優(yōu)選方向遷移，而只是促進(jìn)其彼此對準(zhǔn)。
[0007]Mahmud等(Nature Physics2009, 4，606頁)提出了棘齒形式的粘合劑圖案以引導(dǎo)細(xì)胞遷移。所觀察到的效果是基于通道的粘合劑部分和基底的非粘合劑部分之間的粘附性差異，這樣當(dāng)粘合劑和非粘合劑部分之間的差異特性隨著時(shí)間的過去降低時(shí)，不再觀察到引導(dǎo)細(xì)胞遷移。另外，線性通道或棘齒形式的通道上的粘附性使其可以將細(xì)胞僅保持在這些粘合劑圖案上，即一維空間上，以及例如不允許組織在二維表面上的構(gòu)成。最后，Mahmud等描述的圖案總是垂直于由輸送細(xì)胞的表面形成的平面的突起物。
[0008]可以使細(xì)胞遷移的自然現(xiàn)象轉(zhuǎn)向的這些方法也可以在體內(nèi)獲得應(yīng)用。
[0009]文獻(xiàn)US2009/0093879特別提供了一種植入物，其表面上具有微米或納米三維圖案。這些圖案尤其可以控制微生物或成纖維細(xì)胞在植入物表面的粘附(當(dāng)后者植入生物時(shí))，從而改進(jìn)傷口愈合。
[0010]該文獻(xiàn)US2009/0093879提出表面微米結(jié)構(gòu)或納米結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)負(fù)責(zé)愈合的細(xì)胞，因此它們可以變得以有序方式構(gòu)成在植入物表面。
[0011]當(dāng)發(fā)生時(shí)，這種細(xì)胞遷移沿著給定方向的控制也可以在除了圍繞植入物的細(xì)胞的強(qiáng)制構(gòu)成外的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有應(yīng)用，例如細(xì)胞在傷口表面的定向的遷移或通過組織工程產(chǎn)生人造器官。
[0012]因此，需要可以引導(dǎo)細(xì)胞沿著所選方向遷移的新的裝置，其效果不取決于考慮中的移動細(xì)胞類型，其使用簡單，對組織不是很侵入性的且隨著時(shí)間的過去穩(wěn)固。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]對于本申請的目的，表達(dá)“引導(dǎo)細(xì)胞遷移”用于指使細(xì)胞優(yōu)先以一個(gè)方向而不是所有其他方向遷移。換句話說，遷移的引導(dǎo)破壞根據(jù)考慮中的方向的遷移對稱性。遷移的“引導(dǎo)”不同于其中細(xì)胞優(yōu)先以兩個(gè)相對方向遷移，而沒有這些方向之一比其他方向有利的細(xì)胞遷移的“定向”。
[0014]因此，本申請的目的是提供用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置，所述裝置包括具有用于與細(xì)胞接觸的織紋表面的底層，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
[0015]與描述限制細(xì)胞對準(zhǔn)的通道或微通道的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)相反，本發(fā)明可以根據(jù)各向異性方向引導(dǎo)細(xì)胞，從而在與根據(jù)給定表面的組織構(gòu)成一致的平面中形成網(wǎng)絡(luò)。
[0016]根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明的主題還在于用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法，包括使細(xì)胞與具有織紋表面的底層接觸，所述織紋表面具有各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由之前描述的傾斜的突起物構(gòu)成。
[0017]最后，根據(jù)另 一個(gè)方面，本發(fā)明的主題是用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的試劑盒，包含具有之前描述的織紋表面的底層，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜，以及其上用于輸送細(xì)胞的支持表面。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的裝置或方法，特別是可以應(yīng)用于皮膚病學(xué)、移植學(xué)和組織工程領(lǐng)域。
[0019]對于本申請的目的，術(shù)語“各向異性結(jié)構(gòu)”或“具有各向異性幾何學(xué)的結(jié)構(gòu)”用于指其幾何學(xué)具有根據(jù)給定軸確定的各向異性方向的結(jié)構(gòu)。
[0020]在本發(fā)明上下文中，各向異性結(jié)構(gòu)的各向異性的方向特別地是細(xì)胞遷移的方向。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的裝置使用具有織紋表面的底層，所述織紋表面的三維結(jié)構(gòu)由傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1闡明了包含圓柱形傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)的織紋表面。
[0023]圖2闡明了織紋表面和支持表面之間的細(xì)胞的限制。
[0024]圖3闡明了根據(jù)本發(fā)明裝置的多種用途。
[0025]圖3A):用于在一個(gè)方向引導(dǎo)細(xì)胞的簡單粘合劑結(jié)構(gòu)。
[0026]圖3B):以約5 μ m的間隔限制織紋表面和支持表面之間的細(xì)胞。
[0027]圖3C):在凝膠型軟底層上應(yīng)用織紋表面。
[0028]圖3D):在活組織上應(yīng)用織紋表面。
[0029]圖4闡明了用于制備根據(jù)本發(fā)明的織紋表面的方法的多個(gè)步驟:[0030]圖4A)闡明了其上淀積了涂有光敏樹脂層的鉻層的玻璃板。
[0031]圖4(B)和(C)闡明了經(jīng)由光刻工藝在光敏層上形成圖案以及通過蝕刻將其轉(zhuǎn)移到鉻層。
[0032]圖4(D)闡明了在所形成的圖案上應(yīng)用樹脂層。
[0033]圖4(E)闡明了紫外線照射樹脂層。
[0034]圖4(F)闡明了紫外線照射后形成的傾斜突起物。
[0035]圖4 (G)闡明了 PDMS聚硅氧烷層的連續(xù)淀積。
[0036]圖4⑶闡明了所形成的陰性PDMS模子。
[0037]圖4(1)闡明了在陰性PDMS模子上應(yīng)用構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的織紋表面的一層材料。
[0038]圖4 (J)闡明了所形成的三維表面。 [0039]圖5呈現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的織紋表面的光學(xué)顯微照片。
[0040]圖6表示細(xì)胞遷移24小時(shí)的平均方向的柱狀圖。
[0041]底層
[0042]在本申請上下文中，引導(dǎo)細(xì)胞遷移的技術(shù)效果借助于之前描述的特定織紋表面來獲得，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，當(dāng)所述織紋表面接觸細(xì)胞時(shí)所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
[0043]根據(jù)本發(fā)明裝置的具有織紋表面，特別是微米織紋或納米織紋表面的底層可以是粘合劑的或非粘合劑的。
[0044]粘合劑底層的選擇特別可以進(jìn)一步改進(jìn)已經(jīng)借助于使用根據(jù)本發(fā)明的特定表面的裝置獲得的引導(dǎo)細(xì)胞遷移的技術(shù)效果。
[0045]可適于根據(jù)本發(fā)明的底層的粘合劑材料可特別地是親水性或疏水性的，當(dāng)合適時(shí)，其用細(xì)胞粘附促進(jìn)劑處理，以及特別選自:
[0046]-生物相容的塑料(例如通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的聚苯乙烯(PS);聚硅氧烷聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，尤其是用于芯片上實(shí)驗(yàn)室裝置的；嵌段共聚物例如苯乙烯-乙烯/ 丁烯-苯乙烯(SEBS)的凝膠，用于制備敷料；或可生物降解和可用于植入物或用作人造組織支持物的聚乳酸和羥基乙酸(PLGA，PLA:親水性的)。這些塑料中的一些可以有利地通過氧等離子體活化以增加其親水性或促進(jìn)細(xì)胞粘附；
[0047]-陶瓷，通常為親水性陶瓷，例如金屬氧化物，或氮化物，例如玻璃(S12)、氮化硅(Si3N4)、二氧化鈦(T12)或其他。這些材料用于細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室芯片裝置和移植學(xué)。這些材料可以有利地通過氧等離子體活化以增加其親水性或促進(jìn)細(xì)胞粘附；
[0048]-惰性材料例如金、鉬、鈀或其氧化或氮化表面穩(wěn)定的金屬，例如鉻或鈦，其用于植入物。有利地，所述金屬可用硫醇族分子處理以增加或降低其細(xì)胞粘附能力。
[0049]也可以通過化學(xué)處理所述支持材料促進(jìn)細(xì)胞粘附。然后可由:
[0050]-帶電聚合物(聚電解質(zhì))，其通過靜電相互作用強(qiáng)烈吸附在氧化表面上(對于氧化物而言自然吸附，或通過使用氧等離子體活化表面人造吸附)；例如，聚L-賴氨酸(PLL)或聚鳥氨酸(PORN);或
[0051]-細(xì)胞粘附蛋白(整聯(lián)蛋白)或胞外基質(zhì)蛋白(纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白)或模擬這些蛋白的肽，例如RGD (精氨酰甘氨酰天冬氨酸)基序。[0052]在本發(fā)明上下文中，也可以調(diào)節(jié)底層的粘附性以優(yōu)化細(xì)胞的活動性。事實(shí)上，細(xì)胞在底層上的粘附水平可以通過用粘合劑分子和非粘合劑分子的比率計(jì)量混合物處理所述粘合劑底層來調(diào)節(jié)。例如，可以使用PLL-PEG和PLL-PEG-RGD的混合物或PLL-PEG和纖維連接蛋白的混合物。
[0053]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，具有織紋表面的底層是非粘合劑底層，即，細(xì)胞不能附著在其上的底層，這樣它們可以在不破壞細(xì)胞的情況下被移動。這些非粘合劑底層也稱為抗污底層。
[0054]底層的非粘合性對應(yīng)于所述底層的低蛋白吸附能力以及低細(xì)胞粘附能力，這通常使其可以限制炎性反應(yīng)。
[0055]可適于根據(jù)本發(fā)明具有織紋表面的底層的非粘合劑材料可以尤其是超疏水性材料-在這種情況下使用氟聚合物(例如聚四氟乙烯(PTFE))-或凝膠，例如聚丙烯酰胺(PAM)或聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
[0056]或者，非粘合劑底層可由通過化學(xué)處理成為非粘合性的材料組成。
[0057]使得底層成為非粘合性的化學(xué)處理可以尤其是將例如聚乙二醇(PEG)型的單分子凝膠層移植在底層上，例如氧化物上硅烷化的PEG或金屬上硫醇化的PEG或與聚合電解質(zhì)結(jié)合的PEG，以賦予其通過靜電相互作用長久持續(xù)方式吸附在底層上的能力，在這種情況下移植聚賴氨酸-peg(pll-peg)。 [0058]優(yōu)選地，非粘合材料是氟聚合物或通過化學(xué)處理成為非粘合性的材料，例如移植分子例如聚乙二醇(PEG)。
[0059]織紋表面
[0060]根據(jù)本發(fā)明裝置的織紋表面具有由傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)組成的各向異性三維結(jié)構(gòu)。
[0061]對于本申請的目的，術(shù)語傾斜突起物的“網(wǎng)絡(luò)”用于指傾斜突起物周期性地排列在織紋表面上以便產(chǎn)生規(guī)則的重復(fù)圖案。
[0062]突起物的傾斜方向尤其可以施加較低摩擦力的方向，從而確定細(xì)胞移動的優(yōu)先方向。根據(jù)一個(gè)【具體實(shí)施方式】，為了增加摩擦力，突起物的網(wǎng)絡(luò)具有間距，定義為兩個(gè)突起物之間的距離，其尺寸小于細(xì)胞的尺寸，這樣所述細(xì)胞總是與至少兩個(gè)突起物接觸，尺寸優(yōu)選小于20 μ m,以阻止細(xì)胞在突起物之間任意循環(huán)。
[0063]在本發(fā)明上下文中，織紋表面的尺寸大于細(xì)胞的尺寸。
[0064]優(yōu)選地，突起物的網(wǎng)絡(luò)的間距為0.1-15 μ m,更優(yōu)選為5-10 μ m,更優(yōu)選為約5 μ m。
[0065]在本發(fā)明上下文中，構(gòu)成織紋表面的各向異性三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)的突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
[0066]尤其是，優(yōu)選這些突起物相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面的傾斜角小于或等于45°，更優(yōu)選為10° -45°。
[0067]優(yōu)選突起物為納米尺寸，即，從織紋表面的底層測量的其高度為約一納米，尤其是100nm-20 μ m，以限制缺口并且避免在突起物壓力下刺穿細(xì)胞。
[0068]尤其是，優(yōu)選突起物的高寬比(對應(yīng)于突起物的高度與直徑的比例)為0.5-20，優(yōu)選2-10。有利地，所述高寬比可用于調(diào)節(jié)通過細(xì)胞通過使用以下事實(shí)察覺的底層的硬度:支柱的高寬比越高，突起物的硬度越小，且因此它們在通過細(xì)胞施加的力的影響下越容易變形。[0069]例如，在標(biāo)準(zhǔn)PDMS底層中模鑄的硬度為2MPa的微米支柱或納米支柱對于
6.25的高寬比可以獲得61kPa到1.9的高寬比為1.7kPa的硬度(S.Ghassemi的論JC, Columbia University, 2011，38 頁(http: //academiccommons.Columbia, edu/catalog/ac:131397))。
[0070]當(dāng)發(fā)生時(shí)，突起物的硬度可以誘導(dǎo)與底層接觸的細(xì)胞的某種表型、某種分化或增殖，而同時(shí)保留根據(jù)本申請的所需細(xì)胞引導(dǎo)性質(zhì)。事實(shí)上，已經(jīng)表明，當(dāng)某些細(xì)胞在較硬的底層上發(fā)育時(shí)，它們具有分化成骨細(xì)胞的傾向，而當(dāng)這些相同細(xì)胞在更柔性的底層上發(fā)育時(shí)，它們具有分化成神經(jīng)元細(xì)胞的傾向。
[0071]因此，在本申請上下文中，調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明的織紋表面的突起物的高寬比可能是有利的(特別是在該表面上輸送細(xì)胞時(shí))，以改變所述細(xì)胞的表型、分化和增殖。
[0072]傾斜突起物可以是任何幾何形狀，特別為圓柱形、錐形、金字塔形、薄層形或基本上為三角形、半橢圓形或半圓形的薄片形。
[0073]當(dāng)突起物為薄層形時(shí)，它們的橫截面可以是長方形或平行四邊形，所述橫截面定義為正交于所述薄層的軸的平面。
[0074]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述傾斜突起物是圓柱形，其尤其可以具有球形或卵形橫截面，所述橫截面定義為正交于所述圓柱形的軸的平面。
[0075]對于本申請的 目的，不管其形狀如何，突起物的橫截面落入預(yù)定直徑的圓內(nèi)，所述預(yù)定直徑定義為所述突起物的直徑。
[0076]當(dāng)突起物的直徑不恒定(例如當(dāng)突起物是圓錐形)時(shí)，所述直徑測量為位于突起物中間以上的橫截面。
[0077]優(yōu)選傾斜突起物的直徑為1nm-1O μ m,優(yōu)選0.5-3 μ m。
[0078]根據(jù)一個(gè)【具體實(shí)施方式】，由周期性地排列在織紋表面上的傾斜突起物所占據(jù)的面積為織紋表面的5-50%，優(yōu)選為織紋表面的約5%。
[0079]這種由傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)組成的各向異性結(jié)構(gòu)例如可以通過照相平版印刷法或通過納米打印平版印刷法獲得，任選繼之以各向異性干蝕刻例如反應(yīng)性離子蝕刻(RIE)包括等離子炬體系(感應(yīng)耦合等離子體，ICP)或DRIE (深反應(yīng)性離子蝕刻)的步驟，通過在照相平版印刷法期間或在蝕刻期間傾斜樣品以獲得結(jié)構(gòu)的傾斜。
[0080]織紋表面的產(chǎn)牛
[0081]具有由傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)組成的各向異性三維結(jié)構(gòu)的根據(jù)本發(fā)明裝置的織紋表面可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備。
[0082]然而，開發(fā)用于制備這種類型的表面的新方法是 申請人:的榮幸。
[0083]傾斜突起物事實(shí)上可以通過澆鑄聚硅氧烷聚合物(PDMS)或通過在聚硅氧烷(PDMS)模子上模鑄聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)共聚物來生成。
[0084]在本發(fā)明上下文中，當(dāng)傾斜突起物用于通過限制引導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選它們可由聚硅氧烷聚合物(PDMS)制成，其表面成為非粘合性的。
[0085]根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)具體方面，當(dāng)傾斜突起物用于通過不限制而引導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選它們可通過在如圖4所示的聚硅氧烷(PDMS)模子上模鑄聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)共聚物來生成。
[0086]因此，根據(jù)一個(gè)具體方面，本發(fā)明的主題是用于制備織紋表面的方法，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)組成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜，所述方法包括:
[0087]1.尤其通過自對準(zhǔn)光刻制備構(gòu)成所述三維結(jié)構(gòu)的陰性拷貝的聚硅氧烷模子，
[0088]i1.模鑄構(gòu)成所述三維結(jié)構(gòu)的材料，
[0089]ii1.除去所述聚硅氧烷模子。
[0090]特別是，聚硅氧烷(PDMS)模子可以通過自對準(zhǔn)光刻來制備，特別包括以下步驟:
[0091]1.將光敏樹脂層淀積在光掩模上，
[0092]i1.使用具有入射角(對應(yīng)于由入射光線和由掩模形成的平面的正交面形成的角度)的光源照射所述樹脂層穿過所述光掩模，所述入射角影響各向異性三維結(jié)構(gòu)的柱的傾斜角，
[0093]ii1.任選地，用抗污材料覆蓋所述樹脂的三維表面，
[0094]iv.在所述樹脂的三維表面上澆鑄PDMS層，以獲得所述聚硅氧烷(PDMS)模子，
[0095]V.聚合后，除去所形成的PDMS模子(圖4 (H))。
[0096]用于步驟1.的光掩模可以是通常用于光掩模的透明基板，例如玻璃板，在其上形成構(gòu)成由吸收光的金屬材料例如鉻制成的掩模的圖案。這些掩模通常用于光刻且是可商購或可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。
[0097]例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過將吸收光的金屬層(特別是鉻)淀積在透明基板，例如玻璃板上并通過在所述金屬層上形成圖案(例如孔的基質(zhì))，例如通過用鉻蝕刻溶液如由MicroChem銷售的ChromeEtch蝕刻來制備光學(xué)掩模。
[0098]為此，通過掃描聚焦在淀積于透明基板(玻璃板)上的光敏樹脂層上的激光束來產(chǎn)生圖案，所述透明基板預(yù)先用鉻層覆蓋。使樹脂顯影后，通過將玻璃基板浸在Ch1meEtch浴中將這些圖案轉(zhuǎn)移到鉻層。最后，使用適當(dāng)?shù)娜軇┮瞥米餮谀５臉渲膱D案。
[0099]由MicroChem銷售的未使用的PR_AZ1518Cr型掩模(用鉻薄層和樹脂層覆蓋的玻璃板)例如可以用于生產(chǎn)光掩模。
[0100]在步驟i中，所涂覆的樹脂層的厚度尤其根據(jù)所需的柱高度來選擇。例如，所述樹脂是MicroChem公司銷售的SU-83000環(huán)氧樹脂。
[0101]一旦樹脂在步驟ii中交聯(lián)，優(yōu)選可以使用適當(dāng)?shù)娜軇┤コ龢渲奈幢徽丈洳糠帧?br> [0102]步驟ii中照射所選的角度限定了突起物相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面的傾斜角(圖4(E))。由于光在所使用的透明基板中折射，柱的角度并不精確地總是光的角度；這取決于構(gòu)成基板的材料的性質(zhì)。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)所使用的基板調(diào)節(jié)入射角以獲得所需的柱的傾斜角。
[0103]步驟ii中照射所選的角度尤其可以小于90°，優(yōu)選小于45°，更優(yōu)選為
10。-45。。
[0104]任選添加于步驟iii中的抗污材料例如可以是三甲基氯硅烷(TMCS)。
[0105]最后，基于所形成的PDMS模子，本發(fā)明所要求保護(hù)的各向異性三維表面通過模鑄構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明所述三維結(jié)構(gòu)的材料(PDMS或PLGA)，例如通過將聚硅氧烷聚合物澆鑄在預(yù)先置于真空下的聚硅氧烷模子上，或在聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)共聚物的情況下通過熱模鑄來制備。
[0106]構(gòu)成三維表面的材料固化后，將PDMS模子與三維表面樣品分離，由此其具有所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜的突起物的網(wǎng)絡(luò)(圖 4(J))。
[0107]當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的各向異性三維表面通過熱模鑄PLGA共聚物來制備時(shí)，所述模鑄在80-100°C (優(yōu)選60-90°C，更優(yōu)選約90°C )的溫度和60_120bar (優(yōu)選100_120bar，更優(yōu)選約120bar)的壓力下進(jìn)行大約10分鐘(圖4(1))。冷卻并將所述壓力降低至大氣壓力后，將PDMS模子與三維表面樣品分離。
[0108]因此，突起物的高度、直徑和傾斜角可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)所述工藝的各種參數(shù)來調(diào)節(jié)。
[0109]支持表面
[0110]在根據(jù)本發(fā)明裝置的上下文中，將其中遷移被控制的細(xì)胞在稱為“支持表面”的底層上輸送。
[0111]放置細(xì)胞的支持表面可以是之前描述的織紋表面，或人造表面例如細(xì)胞培養(yǎng)表面(例如凝膠)、蓋玻片、微流動通道內(nèi)、或所述細(xì)胞的天然環(huán)境的表面，例如活組織表面或傷口表面。
[0112]根據(jù)本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】，所述細(xì)胞可以通過將它們限制于其支持表面和所述織紋表面之間來被引導(dǎo)。
[0113]事實(shí)上，所述細(xì)胞的限制可以增強(qiáng)細(xì)胞的引導(dǎo)，特別是當(dāng)在其上輸送細(xì)胞的底層是非粘合劑時(shí)。 [0114]在該實(shí)施方式中，所述支持表面和所述織紋表面之間的距離為0-10 μ m，優(yōu)選3-6 μ m,這樣限制后的細(xì)胞厚度為至少3_6 μ m,以允許其遷移。
[0115]當(dāng)其上輸送細(xì)胞的支持物是“軟的”，即硬度小于約20kPa，尤其是100Pa_20kPa，優(yōu)選500Pa_10kPa時(shí)，其不需要具有額外的隆起物，因?yàn)樗霰砻孀銐颉败洝币栽试S細(xì)胞不被納米織紋底層壓碎，所述細(xì)胞通過使支持表面變形來限定其限制空間。
[0116]這些“軟”支持物為低硬度凝膠或細(xì)胞層型。所使用的凝膠可以是人造來源的凝膠，例如聚丙烯酰胺(PAM)或聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，或天然來源的凝膠，例如膠原蛋白、基質(zhì)凝膠或透明質(zhì)酸(HA)。這些凝膠的硬度可以通過其組成和通過用于交聯(lián)它們的條件來調(diào)節(jié)。
[0117]相反，當(dāng)其上輸送細(xì)胞的支持物的硬度大于約20kPa時(shí)，在本發(fā)明上下文中，對于所述支持物需要具有額外的隆起物以不損害所述細(xì)胞。
[0118]所述支持表面和/或所述織紋表面可以包含一個(gè)或多個(gè)額外的隆起物，其可以控制所述兩個(gè)表面之間的距離。測量相對于放置這些隆起物的表面這些隆起物的高度。
[0119]所述額外的隆起物特別可以是直徑為100-500μπι，且高度為l-lOym，優(yōu)選3-6 μ m的柱形式，且在任何情況下具有這樣一種高度，以使當(dāng)支持物的硬度大于約20kPa時(shí)，限制后細(xì)胞的厚度為至少3-6 μ m。
[0120]引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法
[0121]本發(fā)明的主題還在于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法，包括使所述細(xì)胞與具有織紋表面的底層接觸，所述織紋表面具有各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由突起物組成，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
[0122]在這種方法中，織紋表面如之前所描述。[0123]也將所述細(xì)胞如之前描述的在支持表面上輸送，這樣可以將所述細(xì)胞限制于所述織紋表面和所述支持表面之間。
[0124]本發(fā)明的主題還在于一種裝置，例如，用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法，其包括具有用于與細(xì)胞接觸的織紋表面的底層，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)組成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
[0125]應(yīng)思
[0126]根據(jù)本發(fā)明的裝置可以特別地在體內(nèi)或體外引導(dǎo)細(xì)胞遷移中具有許多應(yīng)用。
[0127]術(shù)語“體外引導(dǎo)”用于指在完全人造的培養(yǎng)基中引導(dǎo)細(xì)胞遷移。
[0128]例如，所述細(xì)胞可以在人造支持表面例如細(xì)胞培養(yǎng)表面(例如凝膠)上培養(yǎng)，然后將織紋表面施加在支持表面上以限制所述細(xì)胞。
[0129]在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以將所述織紋表面集成在微流控通道的一個(gè)表面上，以引導(dǎo)所述微流控通道中細(xì)胞的遷移。
[0130]根據(jù)本發(fā)明的裝置的織紋表面可用于研究培養(yǎng)細(xì)胞的遷移和增殖的生物和物理機(jī)制，或用于通過根據(jù)其遷移特征分離細(xì)胞來進(jìn)行細(xì)胞分選。
[0131]或者，根據(jù) 本發(fā)明的裝置可以在至少部分地用織紋引導(dǎo)表面覆蓋的二維或三維支持物上引導(dǎo)細(xì)胞，以產(chǎn)生人造器官(組織工程)。
[0132]根據(jù)本發(fā)明的裝置可以應(yīng)用于需要人工和獨(dú)立于其趨化性能地引導(dǎo)細(xì)胞的任何領(lǐng)域。
[0133]術(shù)語“體內(nèi)引導(dǎo)”用于指在生物例如人類中引導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移。
[0134]在這種情況下，所述支持表面由其上施加有織紋表面的細(xì)胞的天然生理學(xué)支持物組成。
[0135]根據(jù)體內(nèi)引導(dǎo)的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述織紋表面可用于引導(dǎo)存在于傷口表面的細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞在傷口上的分布。然后所述裝置是其表面具有微米結(jié)構(gòu)或納米結(jié)構(gòu)的敷料。
[0136]根據(jù)體內(nèi)引導(dǎo)的另一個(gè)實(shí)施方式，所述織紋表面可用于引導(dǎo)圍繞假體的細(xì)胞，以促進(jìn)假體周圍細(xì)胞的分布。根據(jù)體內(nèi)引導(dǎo)的又一個(gè)實(shí)施方式，所述織紋表面可用于引導(dǎo)圍繞置于生物機(jī)體內(nèi)部的內(nèi)膜或敷料的細(xì)胞，以促進(jìn)器官中或器官周圍細(xì)胞的分布。
[0137]根據(jù)本發(fā)明的裝置尤其可以是敷料、植入物、假體、人造組織支持物、微流控通道或集成通道的芯片上實(shí)驗(yàn)室裝置的形式，優(yōu)選所述裝置是敷料。
【具體實(shí)施方式】
[0138]根據(jù)本發(fā)明裝置的細(xì)胞遷移引導(dǎo)效果建立在實(shí)驗(yàn)室中正常人皮膚成纖維細(xì)胞(NHDF)的細(xì)胞培養(yǎng)物上。
[0139]用覆蓋有傾斜圓柱體的矩形網(wǎng)絡(luò)的聚硅氧烷(聚二甲基硅氧烷PDMS)表面覆蓋NHDF細(xì)胞培養(yǎng)物。傾斜圓柱體的網(wǎng)絡(luò)具有以下性質(zhì):間距4 μ m、直徑1.5 μ m、高度5 μ m，并具有相對于由所述表面形成的平面的正交面40°的傾斜角(參見圖2)。
[0140]傾斜圓柱體的網(wǎng)絡(luò)通過將PDMS聚硅氧烷聚合物澆鑄在聚硅氧烷(PDMS)模子上來制備，如圖4所示。[0141]所述聚硅氧烷(PDMS)模子使用通過自對準(zhǔn)光刻產(chǎn)生的模子來制備。
[0142]為此，由覆蓋有鉻薄層和AZ1518樹脂層的玻璃板(由MicroChem銷售，稱為PR-AZ1518Cr)組成的光掩模用作基礎(chǔ)基板。
[0143]在這種孔基質(zhì)的情況下，通過掃描聚焦在所述光敏層上的激光束(圖4(B))繼之以樹脂顯影步驟在所述光敏樹脂層上制備圖案。
[0144]然后將這些圖案通過濕法蝕刻(Ch1meEtch)轉(zhuǎn)移到吸收光的鉻層上，并用異丙醇移除樹脂圖案(圖4(C))。
[0145]然后將由MicroChem公司銷售的約5 μ m厚的SU-83005環(huán)氧樹脂的厚層淀積在包含之前定義的圖案的玻璃板上(圖4(D))。
[0146]然后翻轉(zhuǎn)包含所述樹脂層的玻璃板，以使紫外線以大約70°的入射角照射在玻璃板側(cè)，這樣所述圓柱體相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面的傾斜角是40° (圖4(E))。
[0147]將傾斜圓柱體顯影在樹脂表面上之后，用抗污材料(三甲基氯硅烷或TMCS)覆蓋由此形成的所述樹脂的三維表面。
[0148]然后所形成的三維表面用于制備聚硅氧烷(PDMS) “反?！币援a(chǎn)生所述模子的陰性拷貝。為此，將PDMS/交聯(lián)劑(RTV615A，General Electric在70°下交聯(lián)Ih)的混合物傾倒在抗污處理的樹脂表面上(圖4 (G))。一旦交聯(lián)，將PDMS層與三維表面分離，從而形成所述表面的陰模(圖4(H) )。
[0149]最后，根據(jù)本發(fā)明的傾斜圓柱體的網(wǎng)絡(luò)通過將PDMS/交聯(lián)劑(RTV615A，GeneralElectric在70°下交聯(lián)Ih)的混合物澆鑄在置于真空下I小時(shí)后的模子上來獲得(圖5)。
[0150]此外，聚硅氧烷表面通過寬的柱(高5 μ m和直徑400 μ m)來支持，每毫米放置并在PDMS中模鑄。
[0151]因此將培養(yǎng)中的細(xì)胞與傾斜圓柱體接觸，不完全被它們壓碎，在兩個(gè)表面之間的間距為5 μ m，從而以受限制的方式遷移(圖2)。
[0152]覆蓋有傾斜圓柱體的網(wǎng)絡(luò)的聚硅氧烷表面通過移植聚(L-賴氨酸)和聚乙二醇(PLL-g-PEG)的化學(xué)處理而成為非粘合性的。
[0153]細(xì)胞(NHDF)培養(yǎng)底層的部分也由用纖維連接蛋白(50 μ g/ml)處理的PDMS組成。
[0154]意外地,觀察到在覆蓋有傾斜圓柱體的表面下，NHDF優(yōu)先以圓柱體的傾斜方向遷移。圖6代表細(xì)胞遷移24小時(shí)的平均方向的柱狀圖。所表示的設(shè)置的各要素表明在限制后的24小時(shí)期間內(nèi)細(xì)胞的平均方向。這里描繪了 75個(gè)細(xì)胞。
[0155]在具有直徑1.5μπι和以下高度h、突起物之間的距離d和相對于正交面的傾斜角度α的多種突起物網(wǎng)絡(luò)中也觀察到這種效果:
[0156](h, d, a) = (7 μ m, 4 μ m, 80° ),
[0157](h，d，a) = (7.5 μ m，7 μ m，60° ),
[0158](h, d, a) = (5 μ m, 5 μ m, 45° ),
[0159](h, d, a) = (7 μ m, 4 μ m, 80° ),
[0160](h，d，a) = (4 μ m，4 μ m，60° ),
[0161](h, d, a) = (4 μ m, 6.5 μ m, 60° ),
[0162](h, d, a) = (4 μ m, 9 μ m, 60° )和[0163](h，d，a) = (4 μ m，11.5 μ m，60° )，
[0164]所述突起物由多 種材料(PDMS，聚(乳酸-共-羥基乙酸)PLGA)制成。
【權(quán)利要求】
1.用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的裝置，包括具有用于與細(xì)胞接觸的織紋表面的底層，所述織紋表面具有由突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
2.權(quán)利要求1所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于突起物的所述網(wǎng)絡(luò)的間距小于細(xì)胞尺寸，優(yōu)選小于20 μ m,更優(yōu)選為0.1-15 μ m,更優(yōu)選為5-10 μ m,和甚至更優(yōu)選為約5 μ m。
3.權(quán)利要求1或2所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述傾斜的突起物相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面的傾斜角小于或等于45°，更優(yōu)選為10° -45°。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于對應(yīng)于所述突起物的高度與直徑的比例的所述傾斜的突起物的高寬比為0.5-20，優(yōu)選2-10。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述傾斜的突起物為圓柱形，尤其具有球形或卵形橫截面、錐形、金字塔形、薄層形，尤其具有長方形或平行四邊形橫截面、或薄片形，基本上為三角形、半橢圓形或半圓形。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述傾斜的突起物是直徑為1nm-1O μ m,優(yōu)選0.5-3 μ m的圓柱形。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述具有織紋表面的底層是粘合劑的。
8.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述具有織紋表面的底層是非粘合劑的。
9.權(quán)利要求8所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述非粘合劑底層由非粘合劑材料例如氟聚合物或通過化學(xué)處理例如移植聚乙二醇(PEG)分子成為非粘合性的材料組成。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)裝置，其特征在于所述裝置是敷料、植入物、假體、人造組織支持物、微流控通道或集成通道的芯片上實(shí)驗(yàn)室裝置的形式，優(yōu)選所述裝置是敷料。
11.用于引導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法，包括使細(xì)胞與具有織紋表面的底層接觸，所述織紋表面具有各向異性的三維結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由權(quán)利要求1至9定義的傾斜突起物構(gòu)成。
12.權(quán)利要求11所述的引導(dǎo)方法，其特征在于將所述細(xì)胞在支持表面上輸送。
13.權(quán)利要求12所述的引導(dǎo)方法，其特征在于所述支持表面是人造表面，例如細(xì)胞培養(yǎng)表面(例如凝膠)、玻璃蓋玻片、微流控通道內(nèi)、或所述細(xì)胞的天然環(huán)境的表面，例如活組織表面或傷口表面。
14.權(quán)利要求12或13所述的引導(dǎo)方法，其特征在于將所述細(xì)胞限制于所述支持表面和所述織紋表面之間。
15.權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)方法，其特征在于所述支持表面和所述織紋表面之間的距離為0-10 μ m,優(yōu)選3-6 μ m。
16.權(quán)利要求12至15任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)方法，其特征在于所述支持表面和/或所述織紋表面包含一個(gè)或多個(gè)額外的隆起物，其可以控制所述兩個(gè)表面之間的距離。
17.權(quán)利要求16所述的引導(dǎo)方法，其特征在于所述額外的隆起物是直徑為100-500 μ m,且高度小于10 μ m,優(yōu)選3-6 μ m的柱形式。
18.用于制備織紋表面的方法，所述織紋表面具有由權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的傾斜突起物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的各向異性三維結(jié)構(gòu)，所述方法包括:. i.制備構(gòu)成所述三維結(jié)構(gòu)的陰性拷貝的聚硅氧烷模子，特別是通過自對準(zhǔn)光刻， i1.模鑄構(gòu)成所述三維結(jié)構(gòu)的材料， ii1.除去所述聚硅氧烷模子。
19.前述權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于制備聚硅氧烷(PDMS)模子的步驟i通過自對準(zhǔn)光刻來進(jìn)行，其特別是包括以下步驟: .1.使光敏樹脂層淀積在光掩模上， ?.使用具有入射角(對應(yīng)于由入射光線和由掩模形成的平面的正交面形成的角度)的光源經(jīng)過所述光掩模照射所述樹脂層，所述入射角調(diào)節(jié)各向異性三維結(jié)構(gòu)的柱的傾斜角， ii1.任選地，用抗污材料覆蓋所述樹脂的三維表面， IV.在所述樹脂的三維表面上澆鑄PDMS層，以獲得所述聚硅氧烷(PDMS)模子， V.聚合后，除去所形成的PDMS模子(圖4(H))。
20.前述權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于樹脂在步驟ii中交聯(lián)后，使用適當(dāng)?shù)娜軇┤コ龢渲奈凑丈洳糠帧?br> 21.權(quán)利要求19 或20所述的制備方法，其特征在于任選添加于步驟iii中的抗污材料是三甲基氯硅烷(TMCS)。
22.權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于所述各向異性三維表面通過模鑄構(gòu)成本發(fā)明的三維結(jié)構(gòu)的材料(PDMS或PLGA)，例如通過使聚硅氧烷聚合物在預(yù)先置于真空下的聚硅氧烷模子上澆鑄，或在聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)共聚物的情況下通過熱模鑄來制備。
23.前述權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于所述各向異性三維表面通過熱模鑄PLGA共聚物來制備，所述模鑄在80-10(TC (優(yōu)選60-90°C，更優(yōu)選約90°C )的溫度和60-120bar (優(yōu)選100_120bar，更優(yōu)選約120bar)的壓力下進(jìn)行大約10分鐘。
24.前述權(quán)利要求 所述的制備方法，其特征在于冷卻并將所述壓力降低至大氣壓力后，使所述PDMS模子與三維表面樣品分離，所述三維表面因此具有突起物的網(wǎng)絡(luò)，所述突起物的由所述各向異性結(jié)構(gòu)賦予的方向相對于由所述織紋表面形成的平面的正交面傾斜。
【文檔編號】C12N5/00GK104039951SQ201280045314
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月19日
【發(fā)明者】M·勒貝爾, M·皮埃爾, 陳勇, 劉妍君 申請人:居里研究所, 國家科學(xué)研究中心, 發(fā)展與工業(yè)研究公司