用于轉(zhuǎn)基因植物的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用定量或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR或?qū)崟r(shí)PCR)用于定量轉(zhuǎn)基因植物中異源多核苷酸的表達(dá)水平或拷貝數(shù)，其中所述實(shí)時(shí)PCR是使用可操作地連接至所述異源多核苷酸的異源終止子序列特異性的引物組進(jìn)行的。
【專利說(shuō)明】用于轉(zhuǎn)基因植物的高通量篩選方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本專利申請(qǐng)要求提交于2011年8月2日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61 / 514052的權(quán)益，其 全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及植物基因工程。其涉及用于篩選轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于轉(zhuǎn)基因的存在和表達(dá) 的方法和組合物。

【背景技術(shù)】
[0004] 植物基因工程近來(lái)的進(jìn)步已打開(kāi)了工程化植物以具有改善的特性或性狀的新的 大門。這些轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中典型地具有重組DNA體，其具有可操作地連接至多個(gè) 調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)基因，所述調(diào)控區(qū)使所述轉(zhuǎn)基因準(zhǔn)確的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物中幾個(gè)幫助調(diào)控基因 表達(dá)的調(diào)控元件的例子為啟動(dòng)子、內(nèi)含子、終止子、增強(qiáng)子和沉默子。
[0005] 植物基因工程已發(fā)展至將多種性狀引入商業(yè)上重要的植物中，也稱為基因堆積。 這是通過(guò)多基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的，多種基因在其中被轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生可能表達(dá)復(fù)合表型或多種表 型的轉(zhuǎn)基因植物。
[0006] 調(diào)控序列位于包含轉(zhuǎn)錄終止和3' mRNA加工所需信號(hào)的編碼區(qū)的下游，被稱為終 止子序列。所述終止子序列在mRNA加工、定位、穩(wěn)定性和翻譯中起關(guān)鍵作用（Proudfoot， N, (2004)Curr Opin Cell Bioll6 :272-278 ；Gilmartin, G. M. (2005)Genes Dev. 19 ： 2517-2521。包含在終止子序列中的3'調(diào)控序列能夠影響基因的表達(dá)水平（Ingelbrecht 等人（1989)Plant Celll :671-680)。
[0007] 基因工程的挑戰(zhàn)之一是轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定，以檢測(cè)和測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基 因的拷貝數(shù)和表達(dá)。所述轉(zhuǎn)基因 DNA是被隨機(jī)插入植物基因組中，能導(dǎo)致在一個(gè)或多個(gè)染 色體位點(diǎn)整合進(jìn)多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因植物中基因沉默。因此轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的估算是 轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定的重要步驟。已經(jīng)采用技術(shù)諸如southern印記、比較基因組雜交、 熒光原位雜交和使用基因特異性引物的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)以測(cè)量所述轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù) (Yang 等人 Plant Cell Rep(2005)23 :759-763)。采用技術(shù)諸如 Northern 印記和使用基 因特異性引物的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR以對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量。這些技術(shù)可以是乏味的并容易出錯(cuò) (Toplak 等人 2004 ;Plant Molecular Biology Reporter22 :237-250)。
[0008] 使用定量或?qū)崟r(shí)PCR用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)或拷貝數(shù)是有缺點(diǎn)的，因 為當(dāng)對(duì)于每個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因用基因特異性引物和探針時(shí)它可能是昂貴的。此外，每個(gè)引物 組的效率可能不同，這會(huì)妨礙以高通量方式對(duì)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和表達(dá)分析的測(cè)定。如果所述 轉(zhuǎn)基因植物除了被引入的拷貝外有所述基因的內(nèi)源性拷貝，測(cè)量特異性來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因的 表達(dá)可以為困難的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉使用定量或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR或?qū)崟r(shí)PCR)用于量化轉(zhuǎn)基因植物 中異源多核苷酸的表達(dá)水平或量化其拷貝數(shù)的方法，其中使用了對(duì)可操作地連接至異源多 核苷酸的異源終止子序列特異性的引物組進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。本發(fā)明所述方法能用于以高通量 方式測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中異源多核苷酸的表達(dá)水平或拷貝數(shù)。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是量化轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸表達(dá)水平的 方法，所述方法包括以下步驟：(a)從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及（b)使用正向引 物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷酸的表達(dá)水平，其中 所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例 中，使用與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的探針通過(guò)定量或?qū)崟r(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR來(lái) 進(jìn)行所述異源多核苷酸的表達(dá)水平的量化。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸的拷貝數(shù) 的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因 植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及（b)使用正向 引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷酸的拷貝數(shù)，其中所述正向 引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用 與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的探針通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)進(jìn)行所述異源多核 苷酸的拷貝數(shù)的量化。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是量化在至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中存在的至少 兩個(gè)異源多核苷酸的表達(dá)水平的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植 物或植物細(xì)胞分離核酸，其中第一轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子 序列的第一異源多核苷酸，并且其中第二轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至所述 異源終止子序列的第二異源多核苷酸；(b)任選地，從附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離 核酸，其中所述附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中的每一個(gè)包含可操作地連接至所述異源終 止子序列的附加的異源多核苷酸；以及（c)使用正向引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚 合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述第一異源多核苷酸、第二多核苷酸和任選的附加異源多核苷酸的表 達(dá)水平，其中所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。在 一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于至少一百附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞進(jìn)行來(lái)自步驟（b)的附加轉(zhuǎn)基 因植物或植物細(xì)胞的核酸的分離和步驟（c)的任選的附加異源多核苷酸的表達(dá)水平的量 化。在一個(gè)實(shí)施例中使用這個(gè)方法來(lái)量化在至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中存在的至少 兩個(gè)異源多核苷酸的拷貝數(shù)，其中每個(gè)異源多核苷酸可操作地連接至所述異源終止子。
[0013] 在任何所述方法的另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列包含SB-GKAF終止子序 列。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列的序列包含SEQ ID N0 :1。在另一個(gè)實(shí)施例 中，所述正向引物、反向引物和探針與SEQ ID N0 :1或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中， 所述異源終止子序列包含所述SB-GKAF終止子序列，所述探針雜交至由所述正向引物和所 述反向引物界定的SB-GKAF終止子序列的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列 包含SEQ ID N0:1，所述正向引物包含SEQ ID N0:2,所述反向引物包含SEQ ID N0:3,并且 所述引物包含SEQ ID NO :4。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列包含SEQ ID NO :1， 所述正向引物包含SEQ ID NO :5,所述反向引物包含SEQ ID NO :6,并且所述引物包含SEQ ID NO :7。
[0014] 在任何所述方法的另一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是玉米植物或植 物細(xì)胞。
[0015] 附圖和序列表簡(jiǎn)沭
[0016] 根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳 細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以 三個(gè)字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 :3021-3030 (1985)和 Biochemical Journal219 (No. 2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式 全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循37C. F. R. § 1. 822所示的 規(guī)定。
[0017] 圖1是顯示所述SBTerm2引物/探針組的效率曲線圖。
[0018] 圖2是顯示所述SBTerm2引物/探針組的擴(kuò)增曲線圖。
[0019] 圖3是顯示使用基因特異性或SB-GKAF終止子特異性引物測(cè)定不同轉(zhuǎn)基因的模式 的示意圖。每個(gè)構(gòu)建體有所關(guān)注的獨(dú)特基因（"G0I")，但使用相同的終止子。每個(gè)構(gòu)建體 有獨(dú)特的G0I內(nèi)部引物組但使用相同的SB-GKAF引物組。
[0020] 圖4是顯示使用⑶S和SB-GKAF終止子引物組用于相同轉(zhuǎn)基因樣品的QPCR CT比 較圖。⑶S CT是在Y軸上而SB-GKAF CT是在X軸上。
[0021] SEQ ID NO : 1是所述SB-GKAF終止子的序列。
[0022] SEQ ID N0 :2是用于QPCR的正向引物、SBTerm2F的序列。SBTerm2F對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的33-50位核苷酸。
[0023] SEQ ID N0 :3是用于QPCR的反向引物、SBTerm2R的序列。SBTerm2R對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的91-110位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
[0024] SEQ ID N0:4是用于QPCR的SBTerm2探針序列。所述SBTerm2探針對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的53-72位核苷酸。
[0025] SEQ ID N0 :5是用于QPCR的正向引物、SBTermlF的序列。SBTermlF對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的67-91位核苷酸。
[0026] SEQ ID N0 :6是用于QPCR的反向引物、SBTermlR的序列。SBTermlR對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的114-135位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
[0027] SEQ ID N0 :7是用于QPCR的SBTerml探針的序列。所述SBTerml探針對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0 :1的94-110位核苷酸。
[0028] SEQ ID N0 :8是用于QPCR的⑶S正向引物、⑶S-1482-F的序列。
[0029] SEQ ID N0 :9是用于QPCR的⑶S反向引物、⑶S-1553-R的序列。
[0030] SEQ ID N0 :10 是用于 QPCR 的⑶S 探針、⑶S-1509-probe 的序列。
[0031] SEQ ID勵(lì)：11是用于0?〇?的6正48正向引物、6正484的序列。
[0032] SEQ ID N0 :12 是用于 QPCR 的 eIF4g 反向引物、eIF4g-R 的序列。
[0033] SEQ ID N0 :13 是用于 QPCR 的 eIF4g 探針、eIF4g_probe 的序列。
[0034] 序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § 1. 821-1. 825所列出的關(guān)于專利申 請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的規(guī)定。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三字 母表示氨基酸，如 Nucleic AcidsRes. 13 :3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(2): 345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式并入本文。用于核苷 酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的規(guī)定。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
[0036] 如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書中的單數(shù)形式"一個(gè)"和"所述"包括復(fù)數(shù)涵 義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，"植物"的涵義包括多株此類植物，"細(xì)胞" 的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物等等。
[0037] 如本文所用：
[0038] 術(shù)語(yǔ)"單子葉植物"和"單子葉的植物"本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括 禾本科植物（Gramineae)。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"雙子葉植物"和"雙子葉的植物"本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括 以下家族：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)互補(bǔ)序列"和"全長(zhǎng)的互補(bǔ)序列"本文互換使用，指給定核苷酸序列的 互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100 %互補(bǔ)的。
[0041] "轉(zhuǎn)基因"指其基因組因異源核酸，諸如重組DNA構(gòu)建體的存在而發(fā)生改變的任何 細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的 轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)有性雜交或無(wú)性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"不涵蓋 通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重 組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組（染色體基因組或染色體外基因組） 改變。
[0042] "轉(zhuǎn)基因植物"包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被 穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作 為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。
[0043] 基因改良種質(zhì)的商業(yè)開(kāi)發(fā)也已經(jīng)進(jìn)展至向作物植物導(dǎo)入多個(gè)性狀的階段，其通常 稱為基因堆疊法（gene stacking approach)。在該方法中，可將產(chǎn)生不同所關(guān)注特性的多 種基因?qū)胫参?。基因堆疊可通過(guò)許多方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化以及具有不 同轉(zhuǎn)基因的品系的雜交。
[0044] "轉(zhuǎn)基因植物"還包括對(duì)在其基因組中包含超過(guò)一種異源多核苷酸的植物的引述。 各異源多核苷酸均可對(duì)所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生不同的性狀。
[0045] "基因組"在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括 存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分（如線粒體、質(zhì)粒）中的細(xì)胞器DNA。
[0046] "植物"包括整個(gè)植物、植物器官、植物組織、植物繁殖體、種子和植物細(xì)胞以及相 同植物的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞：種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū) 域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
[0047] "繁殖體"包括能夠繁殖新的植物的減數(shù)分裂和有絲分裂的全部產(chǎn)物，包括但不限 于種子、孢子以及作為營(yíng)養(yǎng)生殖的途徑的植物的部分，例如球莖、塊莖、側(cè)枝、或纖匐枝。繁 殖體還包括移植物，在其中植物的一部分被枝接至不同的植物（甚至是不同的物種的植 物）的另外的部分以產(chǎn)生活的生物體。繁殖體還包括通過(guò)克隆或集合減數(shù)分裂產(chǎn)物、或允 許減數(shù)分裂產(chǎn)物（天然地或在人工干預(yù)下）集合在一起以形成胚芽或受精卵，而產(chǎn)生的全 部植物和種子。
[0048] "子代"包括植物的任何后續(xù)世代。
[0049] 針對(duì)序列而言的"異源"意指來(lái)自外來(lái)物種的序列，或者如果來(lái)自相同物種，則指 通過(guò)蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
[0050] "多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互換使用，并且指作為 單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸 (通常以它們的5'-單磷酸形式存在）可以用它們的單字母名稱指代如下："A"為腺苷酸 或脫氧腺苷酸（分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示烏苷酸或脫 氧鳥(niǎo)苷酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脫氧胸苷酸，"R"表示嘌呤（A或G)，"Y"表示嘧啶（C 或T)，"K"表示G或T，"H"表示A或C或T，" I "表示肌苷，并且"N"表示任意核苷酸。
[0051] "多肽"、"肽"、"氨基酸序列"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚 合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類 似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"、"氨基酸 序列"和"蛋白質(zhì)"還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的 Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。
[0052] "信使RNA(mRNA) "指無(wú)內(nèi)含子并且可由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。
[0053] "cDNA"指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以 是單鏈的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。
[0054] "編碼區(qū)"是指編碼蛋白質(zhì)或多肽的信使RNA的部分（或另外的核酸分子如DNA分 子的對(duì)應(yīng)的部分）。"非編碼區(qū)"是指信使RNA或其他核酸分子的不是編碼區(qū)的全部部分，包 括但不限于例如，啟動(dòng)子區(qū)域、5'非翻譯區(qū)（"UTR"）、3' UTR、內(nèi)含子和終止子。術(shù)語(yǔ)"編 碼區(qū)"和"編碼序列"本文中可互換使用。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"和"非編碼序列"本文中可互換 使用。
[0055] "表達(dá)序列標(biāo)簽"（"EST"）是得自cDNA文庫(kù)的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄 的序列。EST通常通過(guò)cDNA插入序列單程測(cè)序獲取。將完整的cDNA插入序列稱為"全長(zhǎng) 插入序列"（"FIS"）。"重疊群"序列是由選自，但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個(gè)或更 多個(gè)序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為"完全基因序列"（"CGS"）， 該序列能得自FIS或重疊群。
[0056] "成熟"蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任 何前肽或原肽的多肽。
[0057] "前體"蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級(jí)產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原 肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。
[0058] "分離的"指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境 中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷 酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲 得分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
[0059] "重組體"是指例如通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段 來(lái)實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合。"重組體"也包括指已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸 而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事 件（如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座）對(duì)細(xì)胞或載體的改變，例如沒(méi)有蓄意人為干擾而 發(fā)生的那些。
[0060] "重組DNA構(gòu)建體"指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重 組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來(lái)源但以不同于通 常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。本文可互換使用術(shù)語(yǔ)"重組DNA構(gòu)建體"和 "重組構(gòu)建體"。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"入門克隆"和"入門載體"本文可互換使用。
[0062] 術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能 受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動(dòng)子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子與該核 酸片段進(jìn)行了可操作地連接。
[0063] "表達(dá)"指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄（如生 成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄）和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。
[0064] "過(guò)表達(dá)"是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中超過(guò)在來(lái)自相同實(shí)驗(yàn)的沉默分離（或非轉(zhuǎn) 基因）生物中的水平的生產(chǎn)。
[0065] "表型"是指細(xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特征。
[0066] "轉(zhuǎn)化細(xì)胞"是將核酸片段（如重組DNA構(gòu)建體）引入其中的任何細(xì)胞。
[0067] 在此所用的"轉(zhuǎn)化"指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化兩者。
[0068] "穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。
[0069] "瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引起基 因表達(dá)而無(wú)基因穩(wěn)定遺傳。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"雜交的"或"雜交"指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合（例如細(xì)胞、種子或植 物）。該術(shù)語(yǔ)包括有性雜交（一株植物被另一株植物授粉）和自交（自花授粉，例如當(dāng)花粉 和胚珠來(lái)自相同植物時(shí)）。術(shù)語(yǔ)"雜交"指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
[0071] "有利等位基因"為位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，所 述表型例如提高的細(xì)胞壁消化性，或作為另外一種選擇，為允許具有降低的細(xì)胞壁消化性 的植物的鑒定的等位基因，其中所述植物可從育種計(jì)劃或種植中被篩除（"反選擇"）。標(biāo) 記的有利等位基因是與有利表型共分離的標(biāo)記等位基因，或者作為另外一種選擇，與不利 植物表型共分離，從而提供鑒定植物的有益效果。
[0072] 術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"指將核酸（例如表達(dá)構(gòu)建體）或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中的手段。導(dǎo)入 包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且 包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時(shí)提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜 交。因此，將核酸片段（例如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體）插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的"導(dǎo) 入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在 該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組（如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變 成自主的復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)（例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0073] 調(diào)控序列：
[0074] 本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體（包括抑制DNA構(gòu)建體）可包含至少一種調(diào)控序列。
[0075] "調(diào)控序列"或"調(diào)控元件"可互換使用，并且指位于編碼序列的上游（5'非編碼 序列）、中間或下游C非編碼序列），并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或 者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸 化識(shí)別序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"和"調(diào)控元件"在本文中可互換使用。
[0076] "啟動(dòng)子"指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
[0077] "在植物中有功能的啟動(dòng)子"指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無(wú)論其是否 來(lái)源于植物細(xì)胞。
[0078] "組織特異性啟動(dòng)子"和"組織優(yōu)選啟動(dòng)子"可以互換使用，并且指主要但非必須專 一地在一種組織或器官中表達(dá)，但是也可以在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0079] "發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子"指其活性由發(fā)育事件決定的啟動(dòng)子。
[0080] 在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為"組成型啟動(dòng) 子"。
[0081] 雖然候選基因當(dāng)通過(guò)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)可預(yù)測(cè)其效應(yīng)，但候選基因在35S 或UBI啟動(dòng)子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用組織特異和/或脅迫特 異啟動(dòng)子可消除不需要的效應(yīng)但保留耐旱性的能力。在擬南芥屬中已經(jīng)觀察到了該效應(yīng) (Kasuga 等人（1999) Nature Biotechnol. 17 :287-91)。
[0082] 適合用于植物宿主細(xì)胞中的組成型啟動(dòng)子包括但不限于：Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟 動(dòng)子以及W099 / 43838美國(guó)專利6, 072, 050中公開(kāi)的其他組成型啟動(dòng)子；CaMV35S核心啟 動(dòng)子（Odell 等人，Nature313 :810-812(1985));稻肌動(dòng)蛋白（McElroy 等人，Plant Cell2: 163-171(1990));泛素 （Christensen 等人，Plant Mol.Biol. 12 :619-632(1989),以及 Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675-689(1992)) ;pEMU(Last 等人，Theor.Appl. Genet. 81 :581-588 (1991)) ;MAS(Velten 等人，ΕΜΒ0 J. 3 :2723-2730 (1984)) ;ALS 啟動(dòng)子 (美國(guó)專利5, 659, 026)等。其他組成型啟動(dòng)子包括但不限于：例如，在美國(guó)專利5, 608, 149 ; 5, 608, 144 ;5, 604, 121 ;5, 569, 597 ;5, 466, 785 ;5, 399, 680 ;5, 268, 463 ;5, 608, 142 ;和 6， 177, 611中的討論的那些（啟動(dòng)子）。
[0083] 組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子是這樣的DNA序列：該序列調(diào)節(jié)DNA序列選 擇性地在對(duì)雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種DNA序列只 在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時(shí)空表達(dá)的可鑒定啟動(dòng)子都可用于 本發(fā)明的方法中。
[0084] 種子或胚芽特異性并且可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于大豆Kunitz胰蛋 白酶抑制劑啟動(dòng)子（Kti3, Jofuku 和 Goldberg，Plant Celll :1079-1093 (1989))、馬鈴 薯塊莖特異蛋白啟動(dòng)子（patatin啟動(dòng)子）（馬鈴薯塊莖）（Rocha-Sosa，M.等人（1989), ΕΜΒ0 J. 8 :23-29)、convicilin啟動(dòng)子、豌豆球蛋白啟動(dòng)子、和豆球蛋白啟動(dòng)子（豌豆子 葉）（Rerie，W. G.等人，（1991)Mol. Gen. Genet259 :149-157 ;Newbigin，E. J.等人（1990) Plantal80 :461-470 ;Higgins，T. J. V.等人（1988)Plant. Mol. Biol. 11 :683-695)、玉米 蛋白啟動(dòng)子（玉米胚乳）（Schemthaner，J. P.等人，（1988)，ΕΜΒ0 J.7 :1249-1255)、菜 豆蛋白啟動(dòng)子（菜豆子葉）（Segupta_Gopalan，C.等人，（1985)，？1'〇(：.似1:1.八〇&(1.3(3；[· U. S.A. 82 :3320-3324)、植物血凝素啟動(dòng)子（大豆子葉）（Voelker，T.等人（1987)ΕΜΒ0 J. 6 : 3571-3577)、B-大豆伴球蛋白和大豆球蛋白啟動(dòng)子（大豆子葉）（Chen，Z-L等人（1988)EMB0 J.7 :297-302)、谷蛋白啟動(dòng)子（大米胚乳）、大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子（大麥胚乳）（Marris， C.等人，（1988)Plant Mol. Biol. 10:359-366)、麥谷蛋白啟動(dòng)子和麥醇溶蛋白啟動(dòng)子（小 麥胚乳）（Colot，V.等人，（1987)EMB0 J.6:3559-3564)、和甘薯貯藏蛋白啟動(dòng)子（甘薯 塊根）（Hattori，T.等人，（1990)Plant Mol.Biol. 14:595-604)?？刹僮鞯剡B接至嵌合 基因構(gòu)建體中的異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時(shí)空 表達(dá)模式。此類例子包括但不限于在擬南芥屬（Arabidopsis)和甘藍(lán)型油菜（Brassica napus)種子中表達(dá)腦啡肽的擬南芥（Arabidopsis thaliana)2S種子儲(chǔ)藏蛋白基因啟動(dòng)子 (Vanderkerckhove 等人，Bio / Technology7 :L929_932(1989))、表達(dá)突光素酶的菜?凝集 素和菜豆β -菜豆素啟動(dòng)子（Riggs等人，Plant Sci. 63 :47-57(1989))，以及表達(dá)氯霉素乙 酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動(dòng)子（Colot等人，EMB0J6 :3559-3564(1987))。
[0085] 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如通過(guò)化合物（化學(xué)誘導(dǎo)劑）， 或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操縱連接的DNA序列?？烧T導(dǎo) 的或受調(diào)控的啟動(dòng)子包括但不限于：例如，受光、熱、脅迫、水?勞或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸 如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動(dòng)子。
[0086] "增強(qiáng)子序列"是指能夠增加基因表達(dá)的序列。這些序列能夠位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上 游、內(nèi)含子內(nèi)、或下游。轉(zhuǎn)錄區(qū)域由外顯子和居間的內(nèi)含子組成，從啟動(dòng)子直到轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。 基因表達(dá)的增強(qiáng)能夠通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，包括但不限于提高轉(zhuǎn)錄效率、成熟mRNA的穩(wěn)定化 和翻譯的強(qiáng)化。
[0087] 本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、 內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。
[0088] "內(nèi)含子"是基因的居間序列，其被轉(zhuǎn)錄至RNA，然后在產(chǎn)生成熟mRNA的過(guò)程中被 切除。該術(shù)語(yǔ)也用于切除的RNA序列。"外顯子"是被轉(zhuǎn)錄的基因序列的一部分，存在于得 自該基因的成熟信使RNA中，并且不是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的必需部分。
[0089] "增強(qiáng)型內(nèi)含子"是存在于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域中的內(nèi)含子序列，其能夠增強(qiáng)所述基因 與其他方面相同的基因的無(wú)內(nèi)含子版本相比的表達(dá)。增強(qiáng)型內(nèi)含子序列當(dāng)位于基因的轉(zhuǎn)錄 區(qū)外部時(shí)可能也能夠作為增強(qiáng)子起作用，并且能夠作為不依賴于位置或取向的基因表達(dá)調(diào) 節(jié)子起作用（Chan 等人，（l999)Proc. Natl. Acad. Sci. 96 :4627_4632 ;Flodby 等人（2〇〇7) Biochem. Biophys. Res. Commun. 356 :26-31)〇
[0090] 內(nèi)含子序列能夠可操作地連接至啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可整個(gè)源于天然基因，或者由源 于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或者甚至包含合成的DNA片段。
[0091] "轉(zhuǎn)錄終止子"、"終止序列"或"終止子"是指位于基因中編碼序列下游的DNA序 列，包括能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的多腺苷酸化識(shí)別序列和其他編碼調(diào)節(jié)信號(hào)的 序列。通常多腺苷酸化信號(hào)特征在于影響多腺苷酸區(qū)域添加到mRNA前體的3'端。由 Ingelbrecht，I.L.等人，Plant Celll :671-680(1989)示例了不同的非編碼序列的使 用。具有"終止子活性"的多核苷酸序列是指當(dāng)被可操作地連接至待表達(dá)的第二多核苷酸 序列的3'端時(shí)，能夠終止從所述第二多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄的終止是 通過(guò)RNA聚合酶的RNA合成被停止并且RNA和所述酶均從DNA模板上釋放的過(guò)程。
[0092] RNA轉(zhuǎn)錄物的錯(cuò)誤終止能夠影響RNA的穩(wěn)定性，并從而能夠影響蛋白質(zhì)的表 達(dá)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可變性有時(shí)歸因于終止效率的可變性（Bieri等人（2002)M 〇lecular BreedinglO :107-117)。
[0093] 如本文所用，"異源終止子"是源自外來(lái)物種的，或者，如果源自相同物種，則為通 過(guò)蓄意的人為干預(yù)而從其原生形式發(fā)生了在組成方面的充分修飾的終止子序列。"異源終 止子"是表現(xiàn)出"終止子活性"的多核苷酸序列。從其原生形式得到"異源終止子"的此類 修飾的例子包括但不限于通過(guò)對(duì)終止子添加異源序列元件的修飾。如本文所用"異源終止 子"并不相當(dāng)于被置于非原生染色體位點(diǎn)上的內(nèi)源終止子。
[0094] 術(shù)語(yǔ)"SB-GKAF終止子"、"GKAF終止子"和" 高粱醇溶蛋白終止子"本文可 互換使用，每個(gè)是指編碼高粱（Sorghum Bicolor) γ-高粱醇溶蛋白基因的3'非翻譯區(qū) C UTR)和從所述:V UTR下游約300bp的序列。在SEQ ID NO : 1中給出了所述SB-GKAF 終止子的序列。高粱（Sorghum Bicolor) γ-高粱醇溶蛋白基因編碼γ-谷醇溶蛋白，在 NCBI GI NO :671655中給出了該基因的序列。谷醇溶蛋白是許多谷類的主要儲(chǔ)存蛋白。高 粱高粱醇溶蛋白，其為高粱的谷醇溶蛋白，占高粱胚乳中總谷醇溶蛋白的約2-5%， 是由 27kDa 的單條多肽組成的（de Freitas FA 等人（1994)MolGen Genet245 :177-186)。
[0095] 本文可互換使用術(shù)語(yǔ)"實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR)"、"定量聚合酶鏈反 應(yīng)（quantitative PCR)"、"定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR)" 和 "QPCR"，代表用于定量樣品中的DNA或RNA的標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)的變型。使用序 列特異性引物和探針，測(cè)定特定DNA或RNA序列的相對(duì)數(shù)量或拷貝數(shù)。使用術(shù)語(yǔ)相對(duì)是因 為這個(gè)技術(shù)比較了不同基因相對(duì)于特定內(nèi)參基因之間的相對(duì)拷貝數(shù)。通過(guò)測(cè)量在PCR過(guò)程 中的每個(gè)循環(huán)處擴(kuò)增產(chǎn)物的量，量化升高。使用熒光水解探針，測(cè)量對(duì)于每個(gè)后續(xù)PCR循環(huán) 增加的熒光以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量化。Ct (循環(huán)閾值）被定義為對(duì)于熒光信號(hào)超過(guò)閾值（即 超過(guò)背景水平）所需的循環(huán)數(shù)。來(lái)自具有更高拷貝數(shù)基因的DNA / RNA會(huì)在更少的PCR循 環(huán)后出現(xiàn)；因此Ct值越低，在特定樣品中存在的拷貝越多。為了定量RNA，在QPCR或?qū)崟r(shí) PCR之前為反轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA的步驟。本文這被稱為"實(shí)時(shí)RT-PCR"或"定量RT-PCR"或 "qRT-PCR"。
[0096] PCR產(chǎn)物定量的Taqman方法使用熒光報(bào)告基因探針。由于探針被設(shè)計(jì)成序列特 異性的并且僅結(jié)合至特異性PCR產(chǎn)物上，這是更精確的。即使在非特異性DNA擴(kuò)增的存在 下，探針特異性使得量化成為可能。這允許多重（定量），其通過(guò)使用具有不同發(fā)射光譜的 探針定量同一試管中的多個(gè)基因。通過(guò)Taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性降解探針， 除去淬滅劑，使得PCR產(chǎn)物被檢測(cè)到。
[0097] 當(dāng)被繪制在一個(gè)線性標(biāo)度時(shí)，所述熒光射線隨著PCR循環(huán)數(shù)增加而增加呈S型，具 有指數(shù)期和平臺(tái)期。平臺(tái)期是由混合物中的引物量而非核苷酸模板量確定的。通常垂直標(biāo) 度是以對(duì)數(shù)形式繪制的，使得曲線圖與閾值的交集呈線性，更易于可視化。理論上，在指數(shù) 期每個(gè)循環(huán)DNA的量加倍，但這受到所用引物效率的影響。正對(duì)照使用內(nèi)參基因，例如，在 所有細(xì)胞類型中相對(duì)豐富的持家基因，它的使用也允許在樣品間進(jìn)行比較。通過(guò)將結(jié)果與 通過(guò)已知濃度的DNA / RNA連續(xù)稀釋制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定DNA / RNA的量。
[0098] 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的：任何所關(guān)注的異源多核苷酸可操作地連接至 本發(fā)明所述的異源終止子序列，并且本發(fā)明所述的方法能用于測(cè)定任何所關(guān)注的異源多核 苷酸的表達(dá)和拷貝數(shù)。能被可操作地連接至所述異源終止子序列并用于使用本發(fā)明中所 述方法測(cè)定拷貝數(shù)的受關(guān)注的異源多核苷酸的例子，包括但不限于包含調(diào)控元件諸如內(nèi)含 子、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、蛋白編碼區(qū)或能用于控制基因表達(dá)的多核苷酸的異源 多核苷酸。能被可操作地連接至所述異源終止子序列并用于使用本發(fā)明中所述方法測(cè)定基 因表達(dá)的受關(guān)注的異源多核苷酸的例子，包括但不限于調(diào)控元件諸如內(nèi)含子、編碼蛋白的 多核苷酸序列或控制基因表達(dá)的多核苷酸序列。編碼蛋白的多核苷酸序列的例子包括但 不限于：病害和昆蟲抗性基因、賦予營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基因、賦予產(chǎn)量和雜交優(yōu)勢(shì)增加的基因、賦 予雄性和/或雌性不育的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因等。能夠被用于控制基因表達(dá)的 異源多核苷酸的例子包括但不限于反義寡核苷酸、抑制性DNA構(gòu)建體或編碼轉(zhuǎn)錄因子的核 酸。
[0099] 使用基因特異性引物組量化轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因 DNA / RNA有缺點(diǎn)，因?yàn)閷?duì)于每 個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因有基因特異性引物以高通量方式進(jìn)行（量化）時(shí)它可能是昂貴的，每個(gè)引 物組的效率可能是不同的，這會(huì)妨礙以高通量方式對(duì)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和表達(dá)的測(cè)定。此外基 因特異性引物組不可直接比較，兩個(gè)引物組的QPCR分?jǐn)?shù)可能不相等。此外，使用基因特異 性引物組的表達(dá)測(cè)定可能不是轉(zhuǎn)基因特異性的；例如，如果被測(cè)試的轉(zhuǎn)基因?qū)τ谄渲萌氲?生物體是內(nèi)源的，基因特異性引物組將同時(shí)獲得轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性的表達(dá)。
[0100] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是使用本文所公開(kāi)的方法用于在一種以上轉(zhuǎn)基因植物中量 化異源多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)，其中每個(gè)轉(zhuǎn)基因植物包含重組構(gòu)建體，所述重組構(gòu)建體 包含可操作地連接至包含相同多核苷酸序列的異源終止子的不同異源多核苷酸。在一個(gè)實(shí) 施例中，本文所公開(kāi)的方法用于以高通量方式量化多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中的異源多核苷酸的表 達(dá)或拷貝數(shù)，其中每個(gè)轉(zhuǎn)基因植物包含重組構(gòu)建體，所述重組構(gòu)建體包含可操作地連接至 包含相同多核苷酸序列的異源終止子的不同異源多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中所述異源終止 子是SB-KAF終止子。在一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米植物。
[0101] 序列比對(duì)和百分比同一性可用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源序列的多種比較方法來(lái)測(cè)定， 這些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息計(jì)算包（DNASTAR? Inc.，Madison， WI)的Megalignx程序。除非另外說(shuō)明，本丈提供的序列的多重比對(duì)用Clustal V比對(duì)方 法（Higgins 和 Sharp，CABIOS. :5 :151-153(1989))采用默認(rèn)參數(shù)（GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)執(zhí)行。使用Clustal V方法進(jìn)行逐對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的百分比同 一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為 KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WIND0W=5、以及 DIAGONALS SAVED=5。 對(duì)于核酸，這些參數(shù)為 KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WIND0W=4、以及 DIAG0NAISSAVED=4。用 Clustal V程序比對(duì)序列后，可以通過(guò)查看同一程序中的"序列距離"表來(lái)獲得"百分比同 一性"和"趨異度"值。除非另外說(shuō)明，本文提供的和申明的百分比同一性和趨異度是以該 方式計(jì)算的。
[0102] 作為另外一種選擇，可以使用Clustal ff比對(duì)方法。Clustal ff比對(duì)方法 (描述于 Higgins 和 Sharp，CABIOS. 5 :151-153(1989) ;Higgins，D.G.等人，Comput. Appl. Biosci. 8 :189-191 (1992))可見(jiàn)于LASERGENf.生物信息學(xué)計(jì)算軟件包 (DNASTAR? Inc.，Madison，Wis.)的MegAlign? ν6· 1程序。用于多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù) 對(duì)應(yīng)于GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergent Sequences=30%、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet 系列、DNA Weight Matrix=IUB〇 用于成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)是Alignment=緩慢-準(zhǔn)確（Slow-Accurate)、Gap Penalty=10. 0、 Gap Length=0.10、Protein Weight Matrix=Gonnet250、以及 DNA Weight Matrix=IUB。用 Clustal ff程序比對(duì)序列后，可以通過(guò)查看同一程序中的"序列距離"表來(lái)獲得"百分比同 一性"和"趨異度"值。
[0103] 本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn) 中有更全面的描述：Sambrook，J·，F(xiàn)ritsch，E.F.和 Maniatis，T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ;CoId Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor, 1989 (下文稱為 "Sambrook"）。
[0104] 本發(fā)明的實(shí)施例包括：
[0105] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是量化轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸的表達(dá)水平 的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因 植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及（b)使用正向 引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷酸的表達(dá)水平，其 中所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施 例中，使用與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的探針通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)時(shí)PCR來(lái) 進(jìn)行所述異源多核苷酸的表達(dá)水平的量化。
[0106] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸的拷貝數(shù) 的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因 植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及（b)使用正向 引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷酸的拷貝數(shù)，其中所述正向 引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用 與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的探針通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)進(jìn)行所述異源多核 苷酸的拷貝數(shù)的量化。
[0107] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是量化在至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中存在的至少 兩個(gè)異源多核苷酸的表達(dá)水平的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植 物或植物細(xì)胞分離核酸，其中第一轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至異源終止子 序列的第一異源多核苷酸，其中第二轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地連接至所述異源 終止子序列的第二異源多核苷酸；(b)任選地，從附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸， 其中所述附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中的每一個(gè)包含可操作地連接至所述異源終止子 序列的附加的異源多核苷酸；以及（c)使用正向引物和反向引物，通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合 酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述第一異源多核苷酸、第二異源多核苷酸和任選的附加的異源多核苷酸 的表達(dá)水平，其中所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜 交。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少 700、至少800、至少900、或至少1000個(gè)附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞進(jìn)行步驟（b)的從附 加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，以及步驟（c)的量化任選的附加異源多核苷酸的表 達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施例中，使用這個(gè)方法量化了在至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中存在 的至少兩個(gè)異源多核苷酸的拷貝數(shù)，其中每個(gè)異源多核苷酸可操作地連接至所述異源終止 子。
[0108] 在任何本文所述方法的另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列包含SB-GKAF終止 子序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列的序列包含SEQ ID N0 :1。在另一個(gè)實(shí) 施例中，所述正向引物、反向引物和探針與SEQ ID N0 :1或其互補(bǔ)序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施 例中，所述異源終止子序列包含所述SB-GKAF終止子序列，所述探針雜交至由所述正向引 物和所述反向引物界定的SB-GKAF終止子序列的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止 子序列包含SEQ ID N0:1，所述正向引物包含SEQ ID N0:2,所述反向引物包含SEQ ID NO: 3,并且所述引物包含SEQ ID NO :4。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列包含SEQ ID NO :1，所述正向引物包含SEQ ID NO :5,所述反向引物包含SEQ ID NO :6,并且所述引物包含 SEQ ID NO :7。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述異源終止子序列包含SEQ ID NO :1，所述正向引物 包含SEQ ID N0:2,所述反向引物包含SEQ ID N0:6,并且所述探針包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :7的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，任何本文所述方法，其中所述植物或 植物細(xì)胞是單子葉或雙子葉植物或植物細(xì)胞，例如，玉米或大豆植物或植物細(xì)胞。所述植物 或植物細(xì)胞還可以來(lái)自向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉、稻、大麥、小米、甘蔗、或柳枝 稷。本發(fā)明包括包含使用上文所述方法生成的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物、從其 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、T1和后續(xù)的世代。
[0109] 實(shí)Μ
[0110] 本發(fā)明將在下面的實(shí)例中進(jìn)一步說(shuō)明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù)是 攝氏度，除非另外說(shuō)明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施例，但僅是以例證的 方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征， 并且在不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各 種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種 修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利 要求書的范圍內(nèi)。
[0111] 實(shí)例 1
[0112] 俥用來(lái)自SB-GKAF終子的序列來(lái)測(cè)定玉米中轉(zhuǎn)某閔表汰
[0113] SEQ ID N0 :1 中給出了所述 SB-GKAF 終止子（來(lái)自高粱（Sorghum bicolor)的 高粱醇溶蛋白終止子）的序列。與所有基因終止子的大多數(shù)類似，已知所述SB-GKAF終 止子受到轉(zhuǎn)錄后mRNA加工的影響。為了生成可靠的SB-GKAF終止子特異性QPCR(定量聚 合酶鏈反應(yīng)或"實(shí)時(shí)PCR"）引物組，需要確定加工所述終止子和通過(guò)轉(zhuǎn)錄后加工添加多聚 腺苷酸（P〇ly-A)尾的位置。缺乏這個(gè)位置的知識(shí)，將會(huì)有風(fēng)險(xiǎn)：建立基于QPCR的測(cè)定是對(duì) 轉(zhuǎn)錄前加工的mRNA特異性的，丟失所有轉(zhuǎn)錄后mRNA。通過(guò)尋找和比較在SEQ ID N0 :1中 給出的SB-GKAF終止子序列和Pioneer的內(nèi)部數(shù)據(jù)組中的其他非常類似的SB-GKAF表達(dá)序 列標(biāo)簽（EST)克隆的序列，可以對(duì)剪切所述SB-GKAF終止子的位置進(jìn)行預(yù)測(cè)。然后通過(guò)鑒 定polyA識(shí)別序列進(jìn)一步確認(rèn)這個(gè)剪切位點(diǎn)。使用所述"安全區(qū)"序列，預(yù)測(cè)的終止子剪切 位點(diǎn)的上游（序列），設(shè)計(jì)TaqMan引物/探針組。這個(gè)引物/探針組被命名為SBTerm2。
[0114] 下面顯示的是所述SB-GKAF終止子（SEQ ID NO :1)的序列。所述SBTerm2正向和 反向引物（分別為SEQ ID N0 :2和SEQ ID NO :3)的結(jié)合位點(diǎn)在下面的序列中被描繪成粗體 大寫字母。所述SBTerm2探針（SEQ ID N0:4)結(jié)合位點(diǎn)以斜體粗體字顯示。所述poly(A) 識(shí)別序列以小寫粗體字顯示。在mRNA加工過(guò)程中預(yù)測(cè)被剪切的序列以斜體字顯示。
[0115] SB-GKAF 終丨 h子（SEQ ID NO :1)：
[0116] actaactatctatactgtaataatgttgtataGCCGCCGGATAGCTAGCTagtttagtcattcagcgg cgatgggtaataataaagtgtcATCCATCCATCACCATGGGTggcaacgtgagcaatgacctgattgaacaaattg aaatgaaaagaagaaatatgttatatgtcaacgagatttcctcataatgccactgacgacgtgtgtccaagaaat gtatcagtgatacgtatattcacaatttttttatgacttatactcacaatttgtttttttactacttatactcac aatttgttgtgggtaccataacaatttcgatcgaatatatataagaaagttgacgaaagtaagctcactcaaaaa gttaaatgggctgcggaagctgcgtcaggcccaagttttggctattctatccggtatccacgattttgatggctg agggacatatgttcgctt
[0117] 引物設(shè)計(jì)和駘證:
[0118] 所述SBTerm2引物/探針組是基于Taqman的。對(duì)于檢測(cè)，所述探針用VIC染料標(biāo) 記，但也能使用其它染料。SBTerm2引物/探針的序列顯示如下（表1)。
[0119] 復(fù)1
[0120] SBTerm2引物和探針名稱，序列和染料信息
[0121]

【權(quán)利要求】
1. 量化轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸的表達(dá)水平的方法，所述方法包括以下 步驟： a. 從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地 連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及 b. 使用正向引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷 酸的表達(dá)水平，其中所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜 交。
2. 測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中異源多核苷酸的拷貝數(shù)的方法，所述方法包括以下步 驟： a. 從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含可操作地 連接至異源終止子序列的異源多核苷酸；以及 b. 使用正向引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述異源多核苷酸的拷貝 數(shù)，其中所述正向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述異源終止子序列是SB-GKAF終止子序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述異源終止子序列包含SEQ ID NO :1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :2,并且所述反向引 物包含 SEQ ID NO :3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :5,并且所述反向引 物包含 SEQ ID NO :6。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是玉米 植物或植物細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的 探針通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR來(lái)進(jìn)行步驟（b)的異源多核苷酸的表達(dá)水平的量化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中使用與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交的 探針通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)進(jìn)行步驟（b)的異源多核苷酸的表達(dá)水平的量化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述異源終止子包含SB-GKAF終止子序列， 并且所述探針雜交至由所述正向引物和所述反向引物界定的SB-GKAF終止子序列的區(qū)域。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :2,所述反向引物 包含SEQ ID NO :3,并且所述探針包含SEQ ID NO :4。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :5,所述反向引物 包含SEQ ID NO :6,并且所述探針包含SEQ ID NO :7。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是玉 米植物或植物細(xì)胞。
14. 量化在至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中存在的至少兩個(gè)異源多核苷酸的表達(dá)水 平的方法，所述方法包括以下步驟： a. 從至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中第一轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含 可操作地連接至異源終止子序列的第一異源多核苷酸，并且其中第二轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì) 胞包含可操作地連接至所述異源終止子序列的第二異源多核苷酸； b. 任選地，從附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞分離核酸，其中所述附加的轉(zhuǎn)基因植物或 植物細(xì)胞中的每一個(gè)包含可操作地連接至所述異源終止子序列的附加的異源多核苷酸；以 及 C.使用正向引物和反向引物通過(guò)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)量化所述第一異源多 核苷酸、所述第二異源多核苷酸和所述任選的附加異源多核苷酸的表達(dá)水平，其中所述正 向引物和所述反向引物與所述異源終止子序列或其互補(bǔ)序列雜交。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中對(duì)于至少一百個(gè)附加的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞 進(jìn)行核酸的分離和量化來(lái)自附加的轉(zhuǎn)基因植物的異源多核苷酸的表達(dá)水平的步驟。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述異源終止子包含SB-GKAF終止子序 列，并且所述量化步驟使用雜交至由所述正向引物和所述反向引物界定的SB-GKAF終止子 序列的區(qū)域的探針。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :2,所述反向引物 包含SEQ ID N0:3,并且所述探針包含SEQ ID N0:4。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO :5,所述反向引物 包含SEQ ID NO :6,并且所述探針包含SEQ ID NO :7。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是玉 米植物或植物細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104126016SQ201280048585
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月2日
【發(fā)明者】A.斯拉特里, I.C.奧里維拉, D.奧內(nèi)爾, J.鄒 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司, 先鋒國(guó)際良種公司