專利名稱：互動(dòng)藥物的篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明采用系統(tǒng)的、高通量的手段旨在發(fā)現(xiàn)互動(dòng)組合的治療藥物。該發(fā)明將有助于進(jìn)一步確定互動(dòng)療法治療疾病的新機(jī)理。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的10年中，雖然藥物研發(fā)經(jīng)費(fèi)不斷增加，但實(shí)質(zhì)上藥物開(kāi)發(fā)的產(chǎn)出卻在實(shí)質(zhì)性下降。我們認(rèn)為其中一個(gè)限制因素是目前生物技術(shù)和制藥工業(yè)上盛行的“單一藥物單一靶點(diǎn)的中心法則”。傳統(tǒng)藥物的設(shè)計(jì)是根據(jù)疾病體系中單一獨(dú)立的靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的，這是制藥工業(yè)中一個(gè)主要限制因素，因?yàn)榧膊〉陌l(fā)生往往是多樣性的，所以基于多位點(diǎn)、多因子的處理方式更易根治疾病。因此，基于多因素系統(tǒng)篩選新的互動(dòng)藥物的方法已迫在眉睫。多種藥品在其他藥物的互動(dòng)配合下，不但劑量可以降低而且會(huì)更加有效。這種互動(dòng)藥物的思想再一次喚起人們關(guān)注天然產(chǎn)物的興趣。許多市場(chǎng)銷售的傳統(tǒng)藥物(包括中藥)在過(guò)去很長(zhǎng)的歷史中證明具有高效和安全的療效，但是大部分的精力花費(fèi)在純化得到單分子，其藥物活性卻因?yàn)檩o助因子分開(kāi)而通常會(huì)喪失。非?？赡艿脑蚴嵌嘟M分在起作用而不是單組分。本專利申請(qǐng)的一個(gè)目的在于開(kāi)發(fā)符合系統(tǒng)生物學(xué)思維模式，與定向靶向藥物互補(bǔ)的藥物發(fā)明的研究方法。這些來(lái)源于天然產(chǎn)物的互動(dòng)藥物將增強(qiáng)現(xiàn)存藥物的療效，且有助于我們更好了解治療疾病的多種途徑。
現(xiàn)今尋找新的疾病相關(guān)的蛋白分子靶點(diǎn)推動(dòng)著生物學(xué)研究和許多新藥開(kāi)發(fā)，而不再是過(guò)去的“盲目亂試僥幸命中”的技術(shù)。運(yùn)用該模式，特定蛋白可以在體外、細(xì)胞和整個(gè)組織器官水平上被研究，用以評(píng)價(jià)是否可作為特定藥靶來(lái)治療某一特定疾病。過(guò)去“單一藥物單一靶點(diǎn)的中心法則”曾經(jīng)鑒定得到了許多針對(duì)特定蛋白的有效化學(xué)分子，這些化合物為生物學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)提供了有價(jià)值的試劑。例如最近FDA批準(zhǔn)的藥物——Avastin，就是根據(jù)結(jié)合和抑制腫瘤血管新生中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)設(shè)計(jì)得到的重組人源化抗體。
但是，在現(xiàn)實(shí)生理狀態(tài)下，疾病是受多基因控制的。因此同時(shí)控制疾病發(fā)生過(guò)程中的多途徑才能達(dá)到有效的治療，從而治愈疾病。系統(tǒng)生物學(xué)研究成果表明人的細(xì)胞和組織是復(fù)雜的、具有豐富的集中和發(fā)散的信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。例如根據(jù)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的多功能性，可以在信號(hào)通路中多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)干涉。
更主要的一點(diǎn)是來(lái)源于天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。20世紀(jì)中正是由于使用微生物和植物次級(jí)代謝產(chǎn)物才使人類壽命延長(zhǎng)1倍，減輕疾病痛苦并且革新藥物。很長(zhǎng)一段時(shí)間，天然產(chǎn)物的比重是占目前市場(chǎng)上藥物的主要部分。這很大程度上歸功于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和臨床治療特異性。不幸的是正當(dāng)新的分析測(cè)試方法已經(jīng)建立和天然產(chǎn)物小分子化合物在檢測(cè)、鑒定和純化方面都有顯著進(jìn)展的時(shí)候，制藥公司紛紛遠(yuǎn)離天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。90年代早期組合化學(xué)公司曾嘗試用大量新的分子填補(bǔ)該空白，不幸的是采用化學(xué)的方法并不能創(chuàng)新出足夠多的變化或者制藥上有活性的分子。很顯然未來(lái)制藥工業(yè)的成功建立在多種技術(shù)互補(bǔ)基礎(chǔ)上如天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、高通量篩選、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、組合生物合成以及組合化學(xué)。
就像生物體系具有豐富的集中和發(fā)散的多信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)一樣，疾病癥狀也是由不同基因和通路的突變和干涉的逐步積累的結(jié)果。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步以及生命體分子機(jī)理的闡明，多組分療法也已經(jīng)提上日程，制藥研發(fā)公司已經(jīng)開(kāi)始轉(zhuǎn)向組合療法。Genentech公司將治療結(jié)腸癌的Avastin和靜脈內(nèi)氟尿嘧啶化學(xué)療法相結(jié)合治療結(jié)腸癌，并于2004年2月27日獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)；輝瑞公司將降膽固醇試劑atorvastatin和抗高血壓藥amlodipine besilate組合而成的復(fù)合物CADUET集中于一個(gè)藥丸，可以同時(shí)治療高血壓和高膽固醇，并于2004年2月2號(hào)獲得FDA批準(zhǔn)，該藥宣稱是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)一個(gè)藥丸能同時(shí)治療兩種不同癥狀，因?yàn)槠渫瑫r(shí)治療兩種不同的病，內(nèi)科醫(yī)生可以幫助病人減少其發(fā)展為心臟血管疾病的危險(xiǎn)。臨床試驗(yàn)的1600個(gè)病人中，大約有57％的病人血液和膽固醇達(dá)到其年齡段的正常值；近來(lái)，禮來(lái)公司也同樣轉(zhuǎn)向互動(dòng)藥物，其產(chǎn)品Symbyax作為第一個(gè)治療抑郁癥的藥物已于2004年1月進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，該藥物由Zyprexa和Prozac組成，其中Prozac幾年以前已經(jīng)失去專利保護(hù)權(quán)；另一個(gè)復(fù)合藥物在墨西哥已經(jīng)上市，即將進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，該復(fù)合藥物不僅是由兩個(gè)藥物組成而且是由兩個(gè)不同的公司共同開(kāi)發(fā)的，即Merck和Schering-Plough聯(lián)合開(kāi)發(fā)新的藥物Vytorin，該藥物由2006年存在專利過(guò)期競(jìng)爭(zhēng)的Merck高價(jià)銷售的降膽固醇藥物statin和Merck的腸胃藥組成。新產(chǎn)品Zetia顯著增強(qiáng)了降低膽固醇的活性。
配伍組合藥物并不是一個(gè)全新概念。來(lái)源于臨床上藥物精細(xì)組合的多組分療法，雖然有時(shí)妙手偶得、或經(jīng)推理設(shè)計(jì)而產(chǎn)生，但是歷史上已經(jīng)在醫(yī)藥許多領(lǐng)域如癌癥、傳染病、中樞神經(jīng)疾病，HIV雞尾酒療法等有成功的先例。根據(jù)Cutting Edge Information最新研究顯示，到2007年醫(yī)藥行業(yè)有800億美元的專利藥物將面臨期滿和無(wú)專利競(jìng)爭(zhēng)壓力狀況，而尋找合適的組合藥物可能會(huì)成為新的武器來(lái)迎接挑戰(zhàn)。自1938年美國(guó)FDA正式實(shí)施功能以來(lái)，大約有5000單一藥物被證實(shí)安全且有效，并已獲得被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)的(除非其是一個(gè)已有藥物的先導(dǎo)化合物)。
針對(duì)已知的藥物，該專利發(fā)明平臺(tái)加速了對(duì)新藥和新化合物的研發(fā)。制藥公司也可以利用此專利為即將期滿的專利注入新的生命。更重要的是該平臺(tái)允許制藥公司挽救藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中因其毒性、耐藥性、臨床生物利用度等問(wèn)題而被淘汰的藥物。允許制藥公司從現(xiàn)存的、有效的、臨床前開(kāi)發(fā)的藥物中，重新進(jìn)行藥物篩選，進(jìn)行全面開(kāi)發(fā)從而市場(chǎng)化。
系統(tǒng)生物學(xué)的方法可用來(lái)鑒定新的蛋白靶點(diǎn)和治療干涉的新途徑。許多市場(chǎng)化的傳統(tǒng)藥物可受益于該發(fā)明，傳統(tǒng)醫(yī)藥藥方大藥典中，傳統(tǒng)醫(yī)藥中的活性成分可以通過(guò)該發(fā)明中系統(tǒng)生物學(xué)的方法得到鑒定。該技術(shù)將會(huì)證實(shí)傳統(tǒng)醫(yī)藥的藥理，以上平臺(tái)也有助于自然界中藥物開(kāi)發(fā)。20世紀(jì)中正是由于使用微生物和植物次級(jí)代謝產(chǎn)物才使人類壽命延長(zhǎng)1倍，減輕疾病痛苦并且革新藥物。很長(zhǎng)一段時(shí)間，天然產(chǎn)物的比重是占目前市場(chǎng)上藥物的主要部分。這很大程度上歸功于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和臨床治療特異性。不幸的是正當(dāng)新的分析測(cè)試方法已經(jīng)建立和天然產(chǎn)物小分子化合物在檢測(cè)、鑒定和純化方面都有顯著進(jìn)展的時(shí)候，制藥公司紛紛遠(yuǎn)離天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。90年代早期組合化學(xué)公司曾嘗試用大量新的分子填補(bǔ)該空白，不幸的是采用化學(xué)的方法并不能創(chuàng)新出足夠多的變化或者制藥上有活性的分子。很顯然未來(lái)制藥工業(yè)的成功建立在多種技術(shù)互補(bǔ)基礎(chǔ)上如天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、高通量篩選、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、組合生物合成以及組合化學(xué)。
生物學(xué)和制藥上多點(diǎn)治療的潛能被認(rèn)識(shí)已經(jīng)有很久的歷史。早在1928年，Loewe觀察到并定量了化合物組合可達(dá)到超出預(yù)料的效果，該效果不同于單一組分的活性。在互動(dòng)作用、疊加作用、拮抗作用等概念應(yīng)運(yùn)而生，特別是在藥理學(xué)、毒理學(xué)領(lǐng)域中。而且傳染病人和癌癥病人受益于共同用藥的化學(xué)療法。臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在生理上使用配伍藥物具有提高治療效果的作用。雖然臨床上藥物混合已經(jīng)是一個(gè)很清楚的治療策略，而且已經(jīng)知道很多藥物配合能起到增效的作用，但是在臨床上用藥敏感不能擴(kuò)大藥物配比濃度適用范圍，只能在很小的范圍內(nèi)進(jìn)行藥量調(diào)整，很難測(cè)定藥物最佳配比濃度，同時(shí)臨床實(shí)驗(yàn)也限制了藥物范圍，阻止其成藥可能性。因此，基于多因素原則建立藥物篩選的方法迫在眉睫。
CombinatoRx Inc.用2,000多種可獲得的藥物化合物，配伍形成2,000,000種組合形式進(jìn)行藥物篩選。近來(lái)報(bào)道一種安定藥和抗原蟲(chóng)藥的組合藥物可以抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)而它們單獨(dú)作用不表現(xiàn)抗腫瘤活性。這是個(gè)說(shuō)明用單藥作用單靶位的用藥模式很難發(fā)現(xiàn)有這樣顯著療效生動(dòng)的例子來(lái)。
除去這次成功，CombinatoRx Inc.的技術(shù)也有嚴(yán)重的限制。首先，他們的化合物庫(kù)只是來(lái)源于大約2000種藥物，因此他們的化學(xué)物多樣性受到限制，它們的靶位蛋白也有限，目前所有的藥物只作用120個(gè)靶位，而銷量最大的100種藥只作用43個(gè)靶位，而基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為我們揭示了更多的疾病相關(guān)靶位；其次，他們的藥物配伍是盲目的和有缺陷的，他們的目的在于非顯著的組合但是現(xiàn)存藥物的作用機(jī)制優(yōu)勢(shì)卻未得到充分發(fā)揮，因此他們不得不做出許多初始決定并假設(shè)猜測(cè)，這些都會(huì)對(duì)科研方向和最終的結(jié)果產(chǎn)生影響；第三，兩個(gè)藥物的兩個(gè)變化因素很難達(dá)到良好的治療效果并且有很大潛在副作用的危險(xiǎn)；最后，互動(dòng)協(xié)同作用并不是他們最關(guān)注的。
本專利在以上基礎(chǔ)上更進(jìn)一步，充分利用現(xiàn)存藥物濃度，在低劑量上篩選尋找那些互動(dòng)伙伴，用以補(bǔ)償、加強(qiáng)藥物效果。本專利應(yīng)用更加廣泛的藥物庫(kù)，具有無(wú)限的化合物多樣性；本專利充分利用已知藥物的分子作用機(jī)制而不是尋找非明顯的組合藥物；本專利不是采用現(xiàn)有的治療藥物的報(bào)道使用劑量，而是采用獨(dú)特的軟件和算法計(jì)算出亞最適劑量濃度，同時(shí)還應(yīng)用來(lái)指導(dǎo)劑型的調(diào)整；本專利采用了低濃度的藥物劑量，可以降低藥物的副作用，同時(shí)我們只關(guān)注互動(dòng)表型。
發(fā)明總結(jié)本發(fā)明提供了在降低藥物副作用及其他不良特性的同時(shí)，加強(qiáng)已有藥物藥效的方法和藥物配方。本發(fā)明以抗真菌藥物——酮康唑作為一個(gè)例子，提供了能特異提高其藥效的方法和藥物配方，尤其在本發(fā)明中提供了高通量鑒定藥物的方法，并獲得了一個(gè)藥物。
互動(dòng)是由于致敏、增強(qiáng)潛力或相互誘導(dǎo)?；?dòng)的混合藥物還具有其他優(yōu)勢(shì)，當(dāng)僅用以一個(gè)蛋白作為靶位的現(xiàn)有藥物時(shí)，需要較高的劑量才能起作用，還常常產(chǎn)生副作用，同時(shí)耐藥性問(wèn)題也非常棘手；而“多藥多靶位途徑”可以降低每種藥物的劑量。本發(fā)明提供了一個(gè)篩選新的混合藥物的策略，這種混合藥物能增強(qiáng)現(xiàn)有“保命良藥”的藥效。
互動(dòng)藥物的方法在抗癌和抗感染兩個(gè)方面進(jìn)行了嘗試。混和藥物化合物被應(yīng)用于雙組分藥物或多組分的篩選，結(jié)合有效地實(shí)驗(yàn)策略和分析方法確定成分之間是否發(fā)生互動(dòng)作用。確定一個(gè)混合物的所有配對(duì)組分的檢測(cè)系統(tǒng)首先，定義每個(gè)化合物在檢測(cè)體系中單獨(dú)作用時(shí)的活性；然后將這些化合物的所有配對(duì)組成分兩組(活性物質(zhì)和非活性物質(zhì))進(jìn)行測(cè)定。結(jié)合自動(dòng)化篩選和信息系統(tǒng)，分別測(cè)定活性和非活性化合物，能夠有效地和完全地篩選全部配對(duì)組分。首先，對(duì)非活性化合物以單藥的形式進(jìn)行分組檢測(cè)(4個(gè)化合物一組)；然后，根據(jù)感興趣的活性，檢測(cè)活性組的特異配對(duì)組分，由于這些化合物中許多本身無(wú)活性，既然由兩個(gè)非活性物質(zhì)組成的活性組合是很罕見(jiàn)的，那么分組篩選會(huì)效率更高，不會(huì)因?yàn)榛钚灾丿B而造成混淆。本身具有可檢測(cè)活性的化合物(活性化合物)在單個(gè)濃度下，分組評(píng)價(jià)更加困難；最好是檢測(cè)一系列濃度去評(píng)價(jià)其活性轉(zhuǎn)變或其固有活性的增強(qiáng)。檢測(cè)每個(gè)活性化合物與所有其他化合物(包括活性的和非活性的)的相互關(guān)系，在劑量矩陣中每個(gè)化合物選用至少5個(gè)濃度(包括0)。
從天然產(chǎn)物中找到的酮康唑互動(dòng)化合物白僵菌素(Beauvericin)為此概念提供了例證。在包括市售藥物的20,000多種被篩選的化合物中，白僵菌素活性最好，且被分離，詳述如下。這個(gè)采用所述的互動(dòng)混合藥物是從天然產(chǎn)物中得到抗真菌藥物的例子，僅僅證明了從藥物或藥物候選物中篩選和鑒定互動(dòng)混合藥物的方法的強(qiáng)大作用，但此發(fā)明在方向上和形式上不局限于此例。此篩選和鑒定方法可用于鑒定任何人類、植物或動(dòng)物疾病的藥物候選物，鑒定已知藥物的互動(dòng)作用，篩選來(lái)自文庫(kù)和其他來(lái)源的候選物。
圖表詳細(xì)描述

圖1、如圖1所示，此發(fā)明的技術(shù)平臺(tái)試圖為藥物開(kāi)發(fā)渠道提供幫助，從而拯救那些專利將要過(guò)期的藥物或者由于安全問(wèn)題而被廢棄的藥物。對(duì)于藥物A，通過(guò)算法能夠迅速算出一個(gè)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有治療劑量的有效劑量。這種情況結(jié)合強(qiáng)有力的高通量篩選使尋找互動(dòng)混合藥物成為可能，這些混合藥物能夠恢復(fù)或提高已知藥物A的藥效?；旌纤幬锟梢詠?lái)自于已知藥物庫(kù)、被淘汰先導(dǎo)藥物、天然產(chǎn)物和合成化合物庫(kù)。
圖2、F101604與低劑量酮康唑的互動(dòng)效果(X是抑制90％細(xì)胞生長(zhǎng)的治療濃度)。樣品在頂上被標(biāo)記，均有至少三次重復(fù)。上格是在潮濕的培養(yǎng)箱中，35℃過(guò)夜培養(yǎng)的檢測(cè)板。中間格是用新鮮的MHB培養(yǎng)基再生的上格樣品。對(duì)上格樣品進(jìn)行熒光檢測(cè)，Ex為544nm，Em為590nm，并且在底格換算成生長(zhǎng)抑制百分率。N陰性顏色對(duì)照，DMSO。P陽(yáng)性顏色對(duì)照，Amphotericin B。
圖3、為了展示酮康唑/F101604組合對(duì)人類細(xì)胞沒(méi)有毒性，采用HepG2細(xì)胞作為替代系統(tǒng)，模擬其在人體中潛在的治療副作用。在96孔板中，每一個(gè)孔接種同樣數(shù)量的HepG2細(xì)胞。在CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)基于細(xì)胞活力的顏色。
圖4、為了達(dá)到更好去重復(fù)的目的，建立了一個(gè)結(jié)合了微生物遺傳多樣性和代謝多樣性的整合數(shù)據(jù)庫(kù)。
圖5、在與酮康唑互動(dòng)篩選中得到的白僵菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。
發(fā)明的詳細(xì)描述定義“藥物”FDA及其他國(guó)家的同等權(quán)威將“藥物”定義為有商業(yè)用途的藥?！八幬锖蜻x物”是指還沒(méi)有批準(zhǔn)的，但是具有能夠成為藥物的特征或跡象的化合物或蛋白質(zhì)。
“互動(dòng)作用”是指兩個(gè)或更多試劑組合的效果遠(yuǎn)大于這些試劑單獨(dú)作用的總和，也就是1+1＞2。“疊加作用”的意思是1+1＝2?！稗卓棺饔谩钡囊馑际?+1＜2。
“苗頭”意思是互動(dòng)藥物候選物與已知藥物的亞最適劑量共同作用時(shí)，產(chǎn)生的活性為最大活性的70％-100％，當(dāng)其以檢測(cè)濃度單獨(dú)使用時(shí)活性很小。表1是典型的“苗頭”命中率。
“輔助藥物”一個(gè)或幾個(gè)化合物可以與低劑量的已知藥物發(fā)生互動(dòng)作用來(lái)達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
最低抑菌濃度(MIC)是指一個(gè)藥物達(dá)到抑制超過(guò)99％菌體的最低劑量。
表1在同一篩選中互動(dòng)、疊加和拮抗樣品的典型“苗頭”命中率
強(qiáng)有力的系統(tǒng)的篩選和鑒定互動(dòng)藥物的方法此發(fā)明是一個(gè)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)新一代化合物的方法，以及能夠表示與低濃度的已知藥物的互動(dòng)作用的算法(計(jì)算方法)。它起始于一個(gè)已知藥物或是一個(gè)由于毒性、溶解性、藥效或耐藥性等問(wèn)題而被淘汰的先導(dǎo)藥物X。這個(gè)藥物可以是任何治療領(lǐng)域的藥物，例如癌癥、感染疾病、炎癥、糖尿病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等。然后構(gòu)建天然產(chǎn)物庫(kù)或者合成化合物庫(kù)(純化的或混和的)，包括核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。第三，建立功能檢測(cè)，包括生物化學(xué)、細(xì)胞、動(dòng)物模型及臨床治療水平的檢測(cè)，然后確定藥物X亞最適劑量(最高活性的10％-40％)。在此條件下，采用高通量的方法，將庫(kù)中的化合物以濃度梯度進(jìn)行篩選，可得到0.1％-1％的“苗頭”命中率?；?dòng)藥物“苗頭”是指互動(dòng)藥物候選物與已知藥物的亞最適劑量共同作用時(shí)，產(chǎn)生的活性為最高活性的70％-100％，當(dāng)其以檢測(cè)濃度單獨(dú)使用時(shí)活性很小。最后，中標(biāo)的混合藥物被純化和鑒定。混和藥物可能是純的合成分子或來(lái)自混合化合物庫(kù)、天然產(chǎn)物庫(kù)或其他合成化合物庫(kù)。
此發(fā)明提供了一個(gè)篩選能夠促進(jìn)低劑量已知藥物的藥效的化合物的方法，包括(a)提供一個(gè)或者多個(gè)已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物；(b)建立天然產(chǎn)物和合成化合物的化合物庫(kù)；(c)建立功能分析方法，確定已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物的亞最適劑量；(d)用c步驟中的方法在不同的濃度梯度下篩選b步驟中的化合物庫(kù)；(e)對(duì)在化合物庫(kù)中能夠促進(jìn)已知藥物藥效的化合物進(jìn)行鑒定。就是說(shuō)此發(fā)明提供了一個(gè)方法，但是并不局限于對(duì)化合物的近一步純化和鑒定。
此化合物庫(kù)包括但是并不局限于核酸或蛋白質(zhì)類的大分子。此發(fā)明中的方法可以使互動(dòng)藥物先導(dǎo)化合物的中標(biāo)率達(dá)到0.1％-1％；并且能使混合藥物能夠在低濃度下使已知藥物的藥效提高10％-40％。
此發(fā)明的方法是基于生物化學(xué)結(jié)合檢測(cè)或酶活檢測(cè)的，這個(gè)檢測(cè)可以是細(xì)胞或者動(dòng)物模型的生物學(xué)檢測(cè)。此發(fā)明中的方法在篩選步驟(d)中能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化操作；在鑒定步驟(e)中，能夠使用報(bào)告基因分析、cytoblot分析或顯微鏡檢分析等方法。
此發(fā)明步驟(c)的亞最適劑量是通過(guò)軟件和算法得到的，它被用來(lái)指導(dǎo)程序化操作。此發(fā)明中已知藥物的濃度降低到了能夠使用于篩選互動(dòng)伴侶和先導(dǎo)化合物的細(xì)胞致敏的亞最適劑量。
此發(fā)明中篩選出來(lái)的化合物是未知的，并通過(guò)具體方法進(jìn)行鑒定。此發(fā)明得到的組成，包括通過(guò)上述方法鑒定出來(lái)的化合物，已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物和可接受的藥劑載體。此發(fā)明中已知藥物的亞最適劑量是由上述方法確定的。此發(fā)明中組成，包括由上述方法決定的已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物的亞最適劑量和一個(gè)可接受的藥劑載體。
此發(fā)明中的環(huán)六酚縮肽白僵菌素(SZC-101)被鑒定為酮康唑的互動(dòng)藥物。環(huán)六酚縮肽白僵菌素(SZC-101)作為酮康唑的互動(dòng)藥物通過(guò)LC-MS-MS和NMR被鑒定，其結(jié)構(gòu)已確定。
此發(fā)明提供了一個(gè)藥物組成，包括上述組成和可接受的藥劑載體。此方明中的“可接受的藥劑載體”可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的制藥載體。合適的載體包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)制藥載體，例如磷酸緩沖鹽溶液和各種溶解試劑。對(duì)于片劑、顆粒劑和膠囊可以添加其他的載體。經(jīng)典的載體包括輔料淀粉、牛奶、糖；一定形態(tài)的粘塊、凝膠、硬脂酸；硬脂酸鎂或硬脂酸鈣等鹽類，滑石，植物油，橡膠，甘油及其他已知輔料，這些載體可以包括調(diào)味劑和顏色添加劑或其他配料。組成中的這些載體通過(guò)已知的常規(guī)方法來(lái)確定。
此發(fā)明采用具體的鑒定蛋白的方法或其他疾病相關(guān)的途經(jīng)確定化合物的使用。這個(gè)方法使我們對(duì)互動(dòng)機(jī)制更加了解(1)用系統(tǒng)的生物方法，包括DNA或蛋白質(zhì)芯片，比對(duì)添加互動(dòng)藥物和不添加互動(dòng)藥物時(shí)的生物遺傳標(biāo)記、基因、蛋白質(zhì)的變化；(2)在存在或不存在低濃度藥物(例如酮康唑)的情況下，用siRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)化一個(gè)真菌致病菌的siRNA文庫(kù)至待測(cè)真菌中。在酮康唑存在的情況下，受影響的基因被沉默。從上述檢測(cè)中得到的互動(dòng)化合物能夠作為工具去研究某種蛋白質(zhì)和途徑，從而有利于對(duì)某種疾病的理解。SiRNA和其他方法可以用于研究互動(dòng)機(jī)制。
運(yùn)算法則充分了解現(xiàn)存藥物的作用原理，并將已知藥物治療劑量顯著降低到最低有效劑量敏化和激化細(xì)胞用于互動(dòng)篩選，這些對(duì)篩選互動(dòng)伴侶試劑是必要的。這個(gè)發(fā)明揭示了一個(gè)運(yùn)算方法和一個(gè)高通量篩選方法?？梢詻Q定新藥研發(fā)篩選方法成功的兩個(gè)關(guān)鍵因素第一個(gè)因素是降低一個(gè)已知藥物用藥量；第二個(gè)因素是一個(gè)或多個(gè)合適的互動(dòng)伴侶，它可以恢復(fù)或提升了已知藥物療效。用于篩選的化合物庫(kù)來(lái)自天然產(chǎn)物庫(kù)或合成化合物庫(kù)(純的或組合的)，包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子化合物。這個(gè)化合物庫(kù)的化學(xué)多樣性事實(shí)上是無(wú)限的。高通量篩選方法是一個(gè)系統(tǒng)的、客觀不帶偏見(jiàn)的方法。
一系列在篩選中量化互動(dòng)效果的運(yùn)算法則已被采用。比如，中值效果和等熱輻射分析有效地確定了一些組合，在這些組合中，一個(gè)藥物加強(qiáng)了另一個(gè)藥物的藥效。但這些模型并不適用于另一些組合，這些組合中一個(gè)藥物僅僅增強(qiáng)了另一個(gè)藥物的內(nèi)在活性。在臨床的和代謝動(dòng)力學(xué)上，有效的組合相互作用可能改變藥效或者提高內(nèi)在活性。
三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參照模型被應(yīng)用于確定互動(dòng)作用。HAS模型(最高單藥模型)是在混合物中，每一個(gè)成分在同樣濃度下能夠產(chǎn)生更大的效果。而B(niǎo)liss互動(dòng)模型，有時(shí)被稱為棋盤定量模型，可以預(yù)測(cè)由兩個(gè)成分的效應(yīng)A和效應(yīng)B產(chǎn)生的組合效應(yīng)CC＝A+B-A*B。在這里，每個(gè)抑制結(jié)果作為部分抑制的效果用0-1之間的數(shù)字表達(dá)。這些基于效果的互動(dòng)模型不需假設(shè)對(duì)于劑量-反應(yīng)曲線的功能模型，所以不需要此篩選體系范圍之外的劑量-反應(yīng)信息。第三個(gè)模型，Loewe疊加模型，是通過(guò)組合指數(shù)來(lái)測(cè)定的，它是一種基于劑量的模型，并且僅僅應(yīng)用于單個(gè)組分的活性水平。我們基于對(duì)上述三種模型的討論，衍生出一個(gè)專有的運(yùn)算法則。它通過(guò)互動(dòng)模型顯示出的較大抑制活性選出單個(gè)組分化合物，然后繼續(xù)研究。這些化合物通過(guò)更高密度的384孔板的重復(fù)性試驗(yàn)以及其他的體內(nèi)和體外的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。
專有的運(yùn)算法則是一種上述3種算法的改良。首先，要找出兩種或更多的能提高藥理學(xué)性質(zhì)的活性組分。疊加藥物中一個(gè)組分對(duì)另一個(gè)組分的互動(dòng)效應(yīng)過(guò)去容易被忽視。疊加藥物是指1+1＝2。而互動(dòng)藥物是指1+1＞＞2。而專有算法可以應(yīng)用于拯救一些具有副作用的潛在藥物候選物，通過(guò)與其他組分結(jié)合，減小副作用，可以使現(xiàn)有藥物公司正在日益縮小的藥物研發(fā)庫(kù)存得到復(fù)蘇。
其次，這個(gè)發(fā)明的方法是為生產(chǎn)符合生產(chǎn)商和消費(fèi)者的共同利益的低成本藥物而設(shè)計(jì)的，購(gòu)買力是重要原則之一。隨著化合物庫(kù)的增長(zhǎng)，對(duì)互動(dòng)藥物知識(shí)的了解也以指數(shù)增加，從而減少新藥研發(fā)的成本和時(shí)間。FDA對(duì)重要的生物技術(shù)藥物的研發(fā)規(guī)定有新進(jìn)展，因此從已被批準(zhǔn)的化合物中產(chǎn)生的新化合物，可以依賴最初研發(fā)這個(gè)化合物的公司的數(shù)據(jù)，從而提供了一個(gè)節(jié)省成本和迅速研發(fā)這類新藥的途徑。
為了證明這個(gè)概念，一個(gè)有效的吡咯類抗真菌藥物酮康唑和一個(gè)來(lái)自天然產(chǎn)物庫(kù)的天然產(chǎn)物粗提物F101604被用來(lái)作為一個(gè)例證。其中一個(gè)主要先導(dǎo)化合物成分已被鑒定。來(lái)自其他天然產(chǎn)物或者合成產(chǎn)物庫(kù)的先導(dǎo)化合物也已被鑒定。我們收集了已知藥物庫(kù)中大約有3,000種被證明安全有效并且獲得FDA市場(chǎng)前認(rèn)證的單分子藥物被用于測(cè)試。因?yàn)閺倪@個(gè)庫(kù)中的命中率也許不夠，所以我們建立了自己的天然產(chǎn)物庫(kù)。我們已經(jīng)建立了的通過(guò)微生物多樣性構(gòu)建天然產(chǎn)物庫(kù)的方法，這種方法從以下三方面最大多樣化微生物天然產(chǎn)物庫(kù)(1)從多樣的生態(tài)系統(tǒng)中選擇和分離樣品，并根據(jù)其形態(tài)學(xué)和16s rRNA特性分離不同種類的微生物；(2)通過(guò)操控微生物的生理特性來(lái)激活微生物天然產(chǎn)物的產(chǎn)生；(3)改變的菌株的遺傳性狀來(lái)產(chǎn)生非自然的微生物天然產(chǎn)物。
通過(guò)運(yùn)用這三種方法，天然產(chǎn)物庫(kù)的多樣性可以最大化。因此，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新化合物的機(jī)會(huì)也隨之增加。一個(gè)結(jié)合了的微生物遺傳多樣性和代謝多樣性的三維數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建立(圖4)。一旦篩選出有效物質(zhì)，可以很容易的追溯其來(lái)源。這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)幫助我們?nèi)コ呀?jīng)報(bào)道的有效藥物，并使我們的研究重點(diǎn)放在天然產(chǎn)物新的結(jié)構(gòu)和新的活性上。
我們以抗真菌藥物作為例證，原因如下真菌已成為第四大醫(yī)療血液傳染疾病，美國(guó)每年大約有90,000例嚴(yán)重感染病例，其中近40％的患者有生命危險(xiǎn)；由于侵入性真菌感染和大量廣譜抗生素的使用導(dǎo)致免疫缺陷病人的數(shù)量逐年增加，所以對(duì)高效抗真菌藥物的需求也逐年增長(zhǎng)。
另外，真菌感染已經(jīng)作為臨床死亡一個(gè)獨(dú)立因素。因?yàn)檎婢鷮?duì)現(xiàn)存藥物抗藥性不斷提高，現(xiàn)存有效抗真菌藥物種類較少，正在研發(fā)的藥物也非常有限，所以現(xiàn)在迫切的需要研究抗真菌藥物的新方法。微生物復(fù)雜的生化調(diào)控體系為發(fā)現(xiàn)嶄新抗感染藥物提供了開(kāi)門匙，嶄新的抗感染藥物能選擇性削弱微生物細(xì)胞，不危害人類細(xì)胞。比較基因組學(xué)恰恰提供了大量只存在于真菌中的必需基因。
許多研究組和公司利用這些基因產(chǎn)生的蛋白作為特殊的靶點(diǎn)來(lái)篩選新型藥物。然而微生物經(jīng)歷38億年的進(jìn)化，已經(jīng)產(chǎn)生了因必需基因被破壞后的備用代謝機(jī)制，并且具有了應(yīng)對(duì)多種因生境變化帶來(lái)危害的能力，不幸的是，它們持續(xù)的進(jìn)化正在超出現(xiàn)存抗感染藥物的能力范圍。
抗真菌試劑市場(chǎng)是增長(zhǎng)最迅速的市場(chǎng)之一，世界每年大約有50億美元的銷售額，其中用于系統(tǒng)治療真菌疾病的費(fèi)用大約30億美元。目前超過(guò)100家的公司正致力于抗真菌藥物的研發(fā)。大部分現(xiàn)存的抗真菌試劑僅能抑制真菌并不能根本地消除真菌，這還導(dǎo)致了真菌產(chǎn)生耐藥性。治療耐藥性真菌費(fèi)用比治療敏感性真菌高且更加困難。那些對(duì)真菌具有致死作用的藥物，往往具有很高的毒性，經(jīng)常導(dǎo)致對(duì)腎、肺的破壞及一系列的其他副作用，這些毒副作用往往影響治療的延續(xù)性。另外，大部分作為治療系統(tǒng)真菌感染的藥物，口服生物利用率低、效果差。因此，我們迫切的需要發(fā)現(xiàn)新的化合物來(lái)解決這些逐步出現(xiàn)的問(wèn)題。
理想的抗真菌藥物應(yīng)具備如下特征具有口服和靜脈注射兩種用藥方式；具有涵蓋酵母狀和絲狀真菌的廣泛的抗菌譜；在體外具有殺死真菌的活性；表現(xiàn)良好的藥物代謝分布，最小限度的藥物相互作用；對(duì)抗藥性穩(wěn)定；具有很好的組織穿透性(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))；副作用小，成本低。不幸的是，目前為止通用的抗真菌治療方式還沒(méi)有一種能滿足上述大部分特點(diǎn)。例如Amphotericin B(兩性霉素B)兩性霉素B是多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，1956年被發(fā)現(xiàn)，是當(dāng)時(shí)唯一能治療系統(tǒng)真菌感染有效的藥物，所以一度被認(rèn)為抗真菌治療的黃金標(biāo)準(zhǔn)。它作用方式，主要是選擇性的結(jié)合真菌細(xì)胞壁的特有組分麥角固醇，從而改變了細(xì)胞壁的成分，抑制了細(xì)胞壁形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。兩性霉素B具有很廣泛的抗真菌效果，但是不得不注意兩性霉素B還具有很強(qiáng)的毒性，能產(chǎn)生一系列副作用，其中腎毒性是最嚴(yán)重的副作用，必須采取間斷性治療。高燒、胃病、嘔吐、貧血、肌痛等副作用癥兆發(fā)生在50％的采用兩性霉素B進(jìn)行治療的病人身上。現(xiàn)在以脂質(zhì)類物質(zhì)為介質(zhì)的用藥方式能降低兩性霉素B一定的毒副作用，但是這種用藥方式提高了治療成本，限制了應(yīng)用。
Azole(吡咯類)fluconazole(氟康唑)、itraconazole(伊曲康唑)、ketoconazole(酮康唑)吡咯類藥物通過(guò)抑制細(xì)胞色素P450將landosterol轉(zhuǎn)化為麥角固醇，從而抑制了真菌細(xì)胞壁固醇和其他壁脂質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞細(xì)胞死亡。每種吡咯類藥物都有各自不同的抗菌譜。例如，氟康唑?qū)η诡愓婢鸁o(wú)效，對(duì)假絲酵母類真菌有一定效果，對(duì)隱球菌屬具有很好治療效果；伊曲康唑雖然在不同病人和與其他藥物聯(lián)合使用時(shí)藥效變化較大，但是它具有廣泛的抗菌譜，涵蓋了其他吡咯類藥物抗菌范圍，而且副作用最小。酮康唑臨床對(duì)肝毒副作用很大，但是它是最有效的治療慢性的及頑固的地方性真菌感染的藥物。
Allylamines(丙烯胺類藥物)這類藥物的主要成員就是terbinafine(特比萘芬)，這類藥物通過(guò)抑制鯊烯環(huán)氧酶起作用。鯊烯環(huán)氧酶是合成麥角固醇途徑中另一個(gè)重要的酶，所以這類藥物同吡咯類藥物作用具有相關(guān)性。這類化合物具有很好的親脂性，能在皮膚、指甲和脂肪層積累。特比萘芬有口服和霜?jiǎng)﹥煞N用藥方式。特比萘芬口服藥物是在1991年在英國(guó)研制出來(lái)，1996年在美國(guó)進(jìn)行臨床應(yīng)用。
Flucytosine(氟胞嘧啶)氟胞嘧啶是一種嘧啶類似物，影響在真菌中DNA的合成。氟胞嘧啶的活性譜有限，而且單獨(dú)使用容易產(chǎn)生抗藥性，因此它經(jīng)常和兩性霉素B配合使用。這種聯(lián)合用藥對(duì)臨床上其他藥物難以治療的髓膜炎念珠菌具有顯著效果。氟胞嘧啶具有毒性，經(jīng)常會(huì)引起粘膜炎和骨髓抑制，這些病對(duì)于已經(jīng)免疫缺陷的病人來(lái)說(shuō)是非常危險(xiǎn)的，非常容易受到感染。
其他的抗真菌藥物還包括制霉菌素、乙酸卡泊芬凈、伏立康唑，但都有各自的局限性。
多組分治療，源自臨床經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期積累的用藥方式，經(jīng)過(guò)一些隨機(jī)的藥物搭配起到良好的治療效果，在藥物領(lǐng)域也有成功的歷史，比如，在癌癥、傳染性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和HIV雞尾酒療法等。我們致力于尋找下一代具有互動(dòng)效果的由低用量已知藥物組合而成的藥物。低藥物用量不僅解決了藥物溶解的問(wèn)題和一些其他性質(zhì)方面的問(wèn)題，同時(shí)能將藥物安全使用劑量降到安全范圍內(nèi)。研發(fā)步驟包括(a)建立一個(gè)已知藥物或棄用藥物的化合物庫(kù)；(b)建立一個(gè)包括天然產(chǎn)物和合成的純化或混合的化合物庫(kù)，包括大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)核酸；(c)建立一個(gè)方法用于測(cè)定和計(jì)算用于互動(dòng)藥物的亞最佳使用劑量；(d)在此基礎(chǔ)上，篩選上述化合物庫(kù)，按照0.1％-1％的檢出率選出具有互動(dòng)效果的化合物；(e)檢測(cè)或計(jì)算被測(cè)組分的配比(通常藥物聯(lián)合使用能發(fā)揮出70％-100％的最大活性，而單獨(dú)使用時(shí)在該低濃度下只能有非常微弱的活性效果)；(f)純化和確認(rèn)組合藥物的組分。組合藥物可以是超過(guò)兩個(gè)組分。
互動(dòng)藥物替代了傳統(tǒng)的利用提高用藥濃度來(lái)提高藥物活性，它通過(guò)降低藥物使用濃度，篩選能互動(dòng)增效的輔助藥物，提高了藥物的應(yīng)用潛能。而互動(dòng)藥物的每個(gè)組分在低濃度單獨(dú)使用時(shí)可能不表現(xiàn)任何活性。為了證明上述概念，我們從天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選出了能與酮康唑(一種吡咯類抗真菌藥物)互動(dòng)增效的抗真菌的天然產(chǎn)物粗提物F101604，并且其中一個(gè)主要的先導(dǎo)化合物已經(jīng)確認(rèn)并分離純化出來(lái)。
因此，本專利發(fā)展出一種發(fā)現(xiàn)藥物的新方法，這種方法符合系統(tǒng)的生物學(xué)思維模式，彌補(bǔ)了以靶點(diǎn)為基礎(chǔ)的藥物篩選方法。這些具有互動(dòng)效果的聯(lián)合藥物增強(qiáng)現(xiàn)存藥物的療效，且有助于我們更好了解治療疾病的多種途徑。我們已經(jīng)給出了一個(gè)由新的天然產(chǎn)物配合低濃度酮康唑獲得更好的抗真菌效果的發(fā)現(xiàn)實(shí)例。
通過(guò)下面的例子能更好的理解這項(xiàng)發(fā)明。實(shí)例中每項(xiàng)特殊的方法和結(jié)果后面都配有詳細(xì)的說(shuō)明以供理解。
例子1自90年代中期引入高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒療法(HAART)以來(lái)，HIV抗真菌藥物市場(chǎng)發(fā)生了巨大的變化。在高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒療法出現(xiàn)之前，AIDS和HIV相關(guān)疾病的機(jī)會(huì)感染以驚人的速度增長(zhǎng)，頻繁的反復(fù)發(fā)作的真菌感染很常見(jiàn)，這就需要進(jìn)行長(zhǎng)期的預(yù)防性治療，使得醫(yī)生們對(duì)抗真菌藥物的耐藥性有了廣泛的關(guān)注，假絲酵母對(duì)吡咯類藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，引起了HIV專家和研究人員的極大關(guān)注。他們認(rèn)為，這個(gè)問(wèn)題解決的關(guān)鍵是未能滿足對(duì)HIV病人真菌治療的需要。免疫力下降的病人容易重復(fù)感染，需要長(zhǎng)期治療，從而導(dǎo)致對(duì)吡咯類藥物的耐受。由于HAART療法的出現(xiàn)，HIV感染的病人免疫力重建能力得到增強(qiáng)，機(jī)會(huì)感染已經(jīng)下降了60-80％。然而，對(duì)HAART療法的抗性的出現(xiàn)也是不可避免的。目前，那些通過(guò)一次HAART治療無(wú)法治愈的病人，也可以通過(guò)進(jìn)行第二、三和四次治療成功治愈。
然而，對(duì)于HAART治療的抗性是常見(jiàn)的。臨床醫(yī)師估計(jì)，到一定時(shí)候，10-30％的病人會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒治療的抗性現(xiàn)象，這樣病人就需要改變療法或使用其他藥物。如果抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物的新藥開(kāi)發(fā)不能持續(xù)補(bǔ)償HAART療法缺陷的話，機(jī)會(huì)感染很有可能再次卷土重來(lái)。而預(yù)知何時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況是非常困難的，但是在未來(lái)的幾十年中，這個(gè)問(wèn)題將是影響HIV市場(chǎng)最重要的因素，進(jìn)而影響到抗真菌藥物市場(chǎng)的需求。而且，如果新的抗真菌藥物有特殊療效而取得更廣泛的應(yīng)用，那將會(huì)影響到未來(lái)抗真菌藥物市場(chǎng)的份額。另外，真菌感染對(duì)于一些非HIV病人也有很高的危險(xiǎn)性，例如癌癥病人，器官移植的病人等，假絲酵母的耐藥性是個(gè)主要的問(wèn)題。
這就需要尋找更安全更有效的抗真菌藥物。因?yàn)檎婢?xì)胞的藥物靶位與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相似，所以一些高效抗真菌藥物，如兩性霉素B和吡咯類藥物(如氟康唑，伊曲康唑和酮康唑)就存在著毒性問(wèn)題氮唑類藥物抑制14-去甲基羊毛甾醇的合成；在真菌和哺乳動(dòng)物中細(xì)胞色素P450酶對(duì)于膽固醇合成是至關(guān)重要的，氮唑類藥物也是許多細(xì)胞色素P450反應(yīng)的有效抑制劑，因此這些抑制劑是研究哺乳動(dòng)物的細(xì)胞生物學(xué)有用的工具；兩性霉素B攻擊血漿薄膜中的固醇，對(duì)腎臟有害處。另外，近幾年，白色念珠菌對(duì)于氮唑類藥物的耐藥性也逐漸增強(qiáng)。白色念珠菌是最重要的人類真菌病原菌。尤其是，白色念珠菌引起免疫缺陷病人的口腔念珠菌病和全身念珠菌病，以及引起婦女的外陰陰道念珠菌病(VVC)。念珠菌病在HIV感染病人中是非常重要的問(wèn)題，其中84％的病人表現(xiàn)出由假絲酵母菌引起的口咽感染；外陰陰道念珠菌病傳播廣泛，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，據(jù)聯(lián)邦疾病控制中心統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)，大約75％的婦女在她們的一生中至少患過(guò)一次外陰陰道念珠菌病，40％患過(guò)兩次，約5％的婦女會(huì)反復(fù)感染。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示了白色念珠菌感染在醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)的重要性。
酮康唑普遍被用來(lái)治療假絲酵母感染。然而，在臨床用藥的劑量上，它與包括肝炎在內(nèi)的毒副作用有關(guān)。除此之外，耐藥菌伴隨長(zhǎng)期治療或預(yù)防性治療出現(xiàn)，導(dǎo)致需要使用高濃度的藥物。
所用的被測(cè)試真菌菌株是近平滑假絲酵母ATCC 22019，它是引起免疫缺陷性個(gè)體嚴(yán)重機(jī)會(huì)感染的人類致病菌。所用的天然樣品是微生物發(fā)酵的粗提物。我們分離到很多來(lái)自世界各地多種生態(tài)環(huán)境下的微生物，在不同的生理培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，從而產(chǎn)生多樣化的天然產(chǎn)物庫(kù)。
液體和固體兩種獲得粗提物的方法被采用。對(duì)于液體發(fā)酵的樣品，首先離心將菌體與發(fā)酵液分離，大約40毫升/瓶，將上清液倒入另一個(gè)50毫升離心管中；然后在沉淀的菌體中加入20毫升的甲醇，而在上清中加入約2毫升HP20樹(shù)脂處理，兩管均置于振蕩器上振蕩1個(gè)小時(shí)；將處理后的HP20樹(shù)脂和菌體表面的甲醇上清液混合，然后過(guò)夜?jié)饪s干燥；其后用雙蒸水沖洗HP20樹(shù)脂，除去高極性的化合物，再用9∶1丙酮/水洗脫；樣品充分干燥后，用100％DMSO溶解；樣品稀釋20倍后，進(jìn)行篩選。對(duì)于固體樣品，首先加40毫升的甲醇浸泡過(guò)夜；然后，在上清中加入2毫升HP20樹(shù)脂混合，其他步驟與液體樣品的處理一樣。
準(zhǔn)備用于篩選的母板，使用的天然產(chǎn)物是100倍稀釋；測(cè)試菌近平滑假絲酵母(ATCC22019)在Mueller-Hinton(MH)肉湯基上進(jìn)行培養(yǎng)；菌液(104/毫升)加入到MH肉湯和Alamar的藍(lán)色染料(生物目錄數(shù)字號(hào)DAL1100)的混合液內(nèi)以及伴隨0.01X倍酮康唑(X是抑制90％的真菌細(xì)胞生長(zhǎng)的生理學(xué)濃度)的加入和缺失；在96孔測(cè)試板中每孔加入0.08毫升。
用96孔進(jìn)樣復(fù)制器取2微升稀釋了20倍的天然提取物到培養(yǎng)好細(xì)胞的96孔板中。按照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)(NCCLCS)對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)。試驗(yàn)板在一定濕度下，35℃過(guò)夜培養(yǎng)；熒光檢測(cè)Ex 544nm和Em 590nm。當(dāng)天然產(chǎn)物樣品本身沒(méi)有抗菌活性的時(shí)候，篩選其與酮康唑的互動(dòng)活性。
天然產(chǎn)物粗提物F101604被確定為有互動(dòng)效果的活性物質(zhì)。圖1A上面的圖顯示測(cè)試板在潮濕的培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過(guò)夜，將等量的近平滑假絲酵母、培養(yǎng)基和Alamar藍(lán)色染料加到每個(gè)孔中。上面顯示的是樣品重復(fù)的治療效果。陽(yáng)性對(duì)照(P)含有抗生素兩性霉素B，殺死了所有的細(xì)胞，顏色呈藍(lán)色，其熒光讀數(shù)定義為100％的生長(zhǎng)抑制。為了測(cè)試真菌病原菌是被殺死還是生長(zhǎng)被抑制，取上述測(cè)試板中呈陽(yáng)性結(jié)果的培養(yǎng)液2微升加入到含有Alamar藍(lán)色染料的新鮮MH肉湯培養(yǎng)基中，再一次置于潮濕的培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過(guò)夜。結(jié)果顯示，如圖1上面所示。如果顏色變紅，說(shuō)明病原菌仍然生存，其模式是抑制；如果顏色變藍(lán)，說(shuō)明病原菌被殺死，其模式是致死。陰性對(duì)照(N)僅加了DMSO，定義為0％的生長(zhǎng)抑制。
酮康唑的單獨(dú)作用濃度在0.01X只抑制了20％的生長(zhǎng)，作用模式是抑制。單獨(dú)用F101604粗提物檢測(cè)，沒(méi)檢測(cè)到其對(duì)酵母病原菌有抑制作用。當(dāng)酮康唑在1X濃度檢測(cè)時(shí)，抑制了90％的菌生長(zhǎng)。然而，酮康唑在0.01X濃度和F101604的混合作用時(shí)獲得了95％抑制效果(比酮康唑1X的濃度效果要好)，作用的模式是致死，顯示兩個(gè)組份具有互動(dòng)效果而非疊加效果。
因此，本發(fā)明在于開(kāi)發(fā)符合系統(tǒng)生物學(xué)的思維模式，與定向靶向藥物互補(bǔ)的研究。這種互動(dòng)藥物提高了現(xiàn)成藥物的療效，使我們能更好的理解多途徑治療疾病，給出的例子是用新的天然產(chǎn)物配合低濃度的酮康唑獲得更好的抗真菌療效。互動(dòng)治療提高了酮康唑的藥效同時(shí)降低了其副作用以及藥物抗性問(wèn)題，這個(gè)互動(dòng)藥物概念的證實(shí)，給予許多治療領(lǐng)域藥物研發(fā)技術(shù)平臺(tái)以希望和潛力。
例子2藥物組合鑒定本專利將現(xiàn)有已知的藥物與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上適當(dāng)?shù)妮d體相結(jié)合，為獸用和人類醫(yī)學(xué)上用藥提供藥物配伍或組合的方法。更重要的是，這種藥物的配伍可以在更低的劑量時(shí)發(fā)揮更好的療效，同時(shí)減少副作用。載體介質(zhì)必須是藥學(xué)上可用的，而且與配方中的其他組分互不反應(yīng)，對(duì)服用者無(wú)害。
經(jīng)16s rDNA測(cè)序分析，活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌株被鑒定為鐮刀霉菌(Fusarium proliferatum)。通過(guò)以下的純化步驟，我們從培養(yǎng)液中分離純化了這種天然活性產(chǎn)物1.每個(gè)發(fā)酵瓶中加入100毫升丙酮，共有36個(gè)發(fā)酵瓶。
2.振蕩以打碎塊狀物并持續(xù)作用至少4小時(shí)。
3.從丙酮溶液中過(guò)濾除去生物基。
4.用適當(dāng)大小的容器收集所有的生物基并加入2升丙酮提取2小時(shí)。
5.過(guò)濾并合并二次的丙酮提取物。
6.在真空條件下蒸發(fā)去除丙酮(剩余大約500毫升)7.加入500毫升的蒸餾水8.用MEK(1∶1)溶液萃取上述的1升分離物，重復(fù)萃取一次9.分別將MEK萃取物濃縮至干燥狀態(tài)。
10.儲(chǔ)存于冰箱中。
經(jīng)對(duì)鐮刀霉菌培養(yǎng)液混合物的LC-MS-MS和NMR研究分析，活性物質(zhì)被確認(rèn)為一種六元環(huán)狀α肽類物質(zhì)白僵菌素(白僵菌素(Beauvericin(SZC-101))
白僵菌素(Beauvericin)是一種微生物毒素，該類物質(zhì)被定義為“真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，若通過(guò)異常途徑攝入，在低濃度時(shí)即對(duì)脊椎和其他動(dòng)物存在有毒害作用”。這些化合物通常是非揮發(fā)性的，并且可能儲(chǔ)存于孢子和生長(zhǎng)菌絲中或分泌到生長(zhǎng)環(huán)境中。許多微生物毒素的毒性作用機(jī)制包括從不同角度干擾細(xì)胞代謝過(guò)程，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，致癌或致畸作用。其他有毒的真菌代謝物如環(huán)胞霉素，可以對(duì)細(xì)胞免疫系統(tǒng)表現(xiàn)較強(qiáng)而獨(dú)特的毒性作用，故被用于免疫抑制劑。
為了表明酮康唑/F101604結(jié)合使用對(duì)人類細(xì)胞無(wú)毒害作用，我們采用HepG2細(xì)胞作為替代系統(tǒng)來(lái)模擬在人體內(nèi)潛在的治療副作用。正如臨床報(bào)道的那樣，我們發(fā)現(xiàn)酮康唑在100和50ug/ml濃度下存在毒性，然而F101604和25ug/ml酮康唑都不會(huì)對(duì)人的肝臟細(xì)胞造成傷害(Fig2)。
我們從遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)方面對(duì)真菌菌株F101604進(jìn)行了鑒定，通過(guò)活性追蹤的分離純化，從F101604的粗提物中分離得到兩個(gè)不同的化合物。在抑制近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)的生長(zhǎng)方面，這兩個(gè)化合物都與0.01X酮康唑表現(xiàn)出極大的互動(dòng)作用。從Sigma。公司定購(gòu)了商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品白僵菌素也證實(shí)了這種活性作用。這種協(xié)同用藥的抗真菌活性在文獻(xiàn)中還未見(jiàn)報(bào)道。
該活性物質(zhì)的協(xié)同作用是普遍存在還是某一類抗真菌藥物的特例呢？弄清楚這一點(diǎn)非常重要。所以我們將研究分析推廣到其他的常用的抗真菌藥物中，如氟康唑(Fluconazole)，依曲康唑(Itraconazole)，兩性霉素B(Amphotericin B)，氟胞嘧啶(Flucytosine)，科賽斯(Cancidas)，伏立康唑(Voriconazole)和特比萘芬(Terbinafin)。測(cè)試結(jié)果顯示似乎白僵菌素對(duì)于吡咯類藥物具有特殊的協(xié)同作用。
除了已報(bào)道的前期數(shù)據(jù)結(jié)果中用到的近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis ATCC22019)我們還采用了其他病原真菌，包括白色念珠菌(Candida albicans ATCC 90028)，光滑假絲酵母(Candida glabrata ATCC 90030)，克柔假絲酵母(Candida Krusei(Issatchenkiaorientalis)ATCC 6258)，曲霉菌(Aspergillus fumigatus ATCC 46645)，啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae ATCC 2601)，新生隱球菌(Cryptococcus neoformans ATCC14116)。將Beauvericin與酮康唑配伍擴(kuò)大了酮康唑?qū)Ω鞣N病原真菌抗菌譜。
另一個(gè)重要方面是測(cè)試互動(dòng)藥物對(duì)耐藥性病原真菌的抑制效果。我們使用了臨床耐藥性分離的菌株包括從ATCC和其他生物醫(yī)藥研究所得到的各種野生型和突變型菌株。這些菌株的亮點(diǎn)在于對(duì)其耐藥作用機(jī)制人們已經(jīng)有了較為清楚的認(rèn)識(shí)，包括細(xì)胞膜上外排機(jī)能泵的基因過(guò)量表達(dá)，如多藥耐藥蛋白基因MDR1和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(CDR1 and CDR2)以及目的酶ERG11基因的過(guò)表達(dá)或發(fā)生了突變。從前期的數(shù)據(jù)中我們發(fā)現(xiàn)，針對(duì)那些已經(jīng)對(duì)氟康唑產(chǎn)生了耐藥性的臨床分離菌，采用具有互動(dòng)作用的藥物配伍能夠極大的改善酮康唑的作用效果。
免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中日益表現(xiàn)出的問(wèn)題是病原性的酵母菌——白色念珠菌(Candida albicans)對(duì)唑類藥物的耐藥性。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明從AIDS患者體內(nèi)分離到的超過(guò)33％的分離菌株，其氟康唑的最低抑制濃度至少是標(biāo)準(zhǔn)易感菌的3倍以上。我們從華盛頓大學(xué)的Theodore C.White博士實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買了一株臨床分離的氟康唑耐藥株#17(SZP-17)。我們從F101604的天然產(chǎn)物混合物中分離純化了生物活性物質(zhì)SZC-101，該物質(zhì)與酮康唑在病原真菌抑制方面具有互動(dòng)作用。通過(guò)培養(yǎng)液微量稀釋，酮康唑在有或沒(méi)有SZC-101配伍時(shí)的抗真菌活性進(jìn)行分析可以確定酮康唑的最低抑制濃度。
表II顯示了添加SZC-101到酮康唑中所表現(xiàn)出的極大的互動(dòng)作用。正與前人所報(bào)道的那樣，SZP-17對(duì)酮康唑和氟康唑表現(xiàn)出交叉耐藥性而不耐兩性霉素B(數(shù)據(jù)未給出)。酮康唑與具有互動(dòng)效應(yīng)的SZC-101一起作用，可對(duì)產(chǎn)生臨床耐藥菌SZP-17具有較好的抑制效果。添加2微克/毫升的SZC-101可使酮康唑的活性可增強(qiáng)200倍。表II SZC-101的添加量對(duì)酮康唑抑制臨床耐藥菌SZP-17的最低抑制濃度(MIC)的影響(單位微克/毫升)
其他二期測(cè)試分析包括檢測(cè)藥物的血清結(jié)合活性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性分析等，分析活性物質(zhì)的各種性質(zhì)對(duì)于今后的深入研究非常重要。
我們也測(cè)試了動(dòng)物模型上互動(dòng)用藥方法與單獨(dú)用藥的臨床對(duì)比。我們從中分離得到的新化合物可作為一種與DNA(RNA)芯片或蛋白芯片相結(jié)合的分析手段，可用于確認(rèn)新基因和途徑，解碼復(fù)雜遺傳通路控制的疾病過(guò)程。繪制微生物細(xì)胞通路圖譜將為更好的治療提供有效的細(xì)胞模型。以下幾個(gè)方面給出了互動(dòng)作用的可能作用模式1)耐藥酶的抑制因子微生物產(chǎn)生的酶可以通過(guò)破壞抗生素分子的結(jié)構(gòu)從而使其失活，這是抗性的主要作用機(jī)制。這些酶能被分泌到周圍環(huán)境中，例如，葡萄球菌分泌青霉素酶，這種酶能使青霉素失活；或者被分泌到外周胞質(zhì)間隙，例如，綠膿桿菌分泌頭孢菌素酶，該酶可以降解頭孢他啶。這種耐藥性可以通過(guò)抑制降解性酶與特定抗生素結(jié)合而得到克服。這樣，抗生素就能被保護(hù)起來(lái)，例如，Augmentin(阿莫西林和克拉維酸)。
2)膜屏障增強(qiáng)因子抗生素不能到達(dá)靶點(diǎn)目標(biāo)原因通常是抗生素難以穿越細(xì)胞壁，不能進(jìn)入周質(zhì)間隙或者細(xì)胞質(zhì)中。因此，能夠提高這些膜屏障滲透性的復(fù)合物就能增強(qiáng)藥物的活性，例如，慶大霉素能提高腸球菌對(duì)β內(nèi)酰胺制劑的滲透性。
3)多藥耐藥泵的抑制因子微生物膜上的泵能夠轉(zhuǎn)移或者泵出細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗生素。通過(guò)抑制這些泵的作用也可以協(xié)同性的增強(qiáng)藥物的活性。許多這種抑制因子已被發(fā)現(xiàn)，但市場(chǎng)上還沒(méi)有進(jìn)行銷售。酮康唑與SZC-101配合使用抑制了染料流出體外——這是協(xié)同效應(yīng)的一種作用模式。為了測(cè)試SZC-101和酮康唑在SZP-17菌株上的多藥耐藥泵的抑制作用，我們做了染料流逝實(shí)驗(yàn)。首先單獨(dú)或配伍使用2微克/毫升SZC-101和0.04微克/毫升酮康唑?qū)ZP-17培養(yǎng)物進(jìn)行32℃ 30分鐘預(yù)處理，然后用熒光染料若丹明G在32℃處理1小時(shí)。沖洗培養(yǎng)物，在沒(méi)有藥物存在下讓細(xì)胞恢復(fù)。通過(guò)測(cè)定真菌細(xì)胞中殘留的熒光性復(fù)合物可知化合物是否可以阻止染料流逝。在染料消逝實(shí)驗(yàn)中，SZC-101和酮康唑單獨(dú)使用時(shí)只有很小的作用，而復(fù)合使用時(shí)，在染料消逝作用上卻具有極強(qiáng)的作用(數(shù)據(jù)未列出)。這個(gè)結(jié)果證明了兩種藥物配伍使用時(shí)能有效的作用于膜上的泵，而單獨(dú)使用時(shí)則沒(méi)有這種效應(yīng)。
4)其他互動(dòng)作用途徑互動(dòng)篩選是一種新的用于確定天然產(chǎn)物或合成藥物庫(kù)中可以配伍的藥品的方法，它們可能由上面提到的或者是完全新穎的機(jī)制運(yùn)作。
互動(dòng)篩選提供了幾種化合物的最佳配伍比率。通過(guò)以下途徑可更好的測(cè)試和理解互動(dòng)效應(yīng)的機(jī)制1)利用系統(tǒng)生物學(xué)方法，包括DNA或蛋白質(zhì)微芯片的方法，來(lái)比較在互動(dòng)藥物存在與否時(shí)遺傳生物標(biāo)記、基因或蛋白質(zhì)發(fā)生了哪些顯著的改變。2)使用小分子RNA干擾技術(shù)，在某個(gè)藥(例如酮康唑)低濃度存在與否時(shí)，將一個(gè)病原真菌的siRNA庫(kù)轉(zhuǎn)移到待測(cè)真菌中。在低濃度酮康唑存在情況下，效應(yīng)基因遇到特異性的siRNA表達(dá)將會(huì)死亡。
現(xiàn)在常用的藥物通過(guò)降低其劑量以及與其他化合物配伍可改進(jìn)其療效。由于常用藥有明確的藥物性質(zhì)備案，對(duì)其作用模式也有較好的認(rèn)識(shí)。所以使FDA更易于評(píng)估藥物組合的療效。本專利中具有互動(dòng)作用的藥物可讓我們更好的了解真菌作用機(jī)制。這能使現(xiàn)有藥物更有效，也有利于我們更好的多途徑治療疾病。
除了在抗感染疾病中的實(shí)例驗(yàn)證了概念，我們還測(cè)試了一些與抗癌，心血管病，抗炎癥，和其他紊亂失調(diào)方面有關(guān)的藥物。本專利提供了一種新的方法去確定天然產(chǎn)物或者合成藥物庫(kù)中的輔助成分藥物，它們可以由上面提到的或是全新的機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用。
通過(guò)上述的互動(dòng)藥物篩選來(lái)確定某種天然產(chǎn)物是一種殺真菌劑，而這僅僅只是證明了互動(dòng)藥物篩選的方法在篩選和確定藥物及其互動(dòng)組分時(shí)是非常強(qiáng)大有效的一個(gè)例子，但并沒(méi)有限制任何別的方法或形式的發(fā)明。在確診任何人類，植物和動(dòng)物疾病或在其他經(jīng)適當(dāng)分析的情況下，以及確定對(duì)于治療某種疾病的藥物互動(dòng)作用從庫(kù)或其他資源里篩選互動(dòng)組分，這種篩選和確定藥物的方法都是非常有用的。
抗真菌互動(dòng)藥物的臨床前試驗(yàn)部分是用免疫缺陷型老鼠和經(jīng)系統(tǒng)傳播的念球菌感染模型。
盡管歷來(lái)采用死亡作為研究這種類型試驗(yàn)的終點(diǎn)，但這個(gè)終點(diǎn)判定已不再適合現(xiàn)在的動(dòng)物研究時(shí)代。為了嘗試修改研究方案使之與當(dāng)今時(shí)代標(biāo)準(zhǔn)一致，我們采用了由T.E.Hamm所建議使用的方法。(被提議制度上關(guān)心動(dòng)物，對(duì)于嚙齒類動(dòng)物研究采用規(guī)定指示的致死方法作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物協(xié)會(huì)今日議題.1995；3469-71)盡管這些實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致死亡，但通過(guò)利用以下這些途徑，我們會(huì)盡最大努力減少動(dòng)物疼痛和痛苦的持續(xù)時(shí)間1)我們派實(shí)驗(yàn)組中訓(xùn)練有素并在識(shí)別動(dòng)物生病的征兆和反常行為方面有豐富經(jīng)驗(yàn)的成員，每天(包括周末和假期)監(jiān)控動(dòng)物3次，時(shí)間分別在上午9點(diǎn)，中午12點(diǎn)以及下午5點(diǎn)。這種監(jiān)控時(shí)間表超過(guò)了最初Hamm博士所建議的一日兩次的方法。此外，如果發(fā)現(xiàn)老鼠有疼痛，抑郁或者死亡的跡象，這種監(jiān)控會(huì)更加的頻繁。
2)看起來(lái)似乎有明顯變化的動(dòng)物，它們的姿態(tài)(例如，非正常的姿態(tài)或者將頭埋進(jìn)腹部)，皮毛，眼睛和/或者鼻子的分泌物，呼吸或運(yùn)動(dòng)將與群居下情況大不相同。我們不會(huì)給與這些動(dòng)物止痛劑，因?yàn)檫@可能會(huì)出現(xiàn)藥-藥交互作用，并且它對(duì)研究結(jié)果的影響也是未知的。取而代之的是，我們會(huì)在離動(dòng)物居住處很遠(yuǎn)的地方對(duì)其進(jìn)行頸部脫臼，使它暴露在CO2環(huán)境下，無(wú)痛苦的死去。
死亡率這個(gè)術(shù)語(yǔ)將用于作為這個(gè)研究的終點(diǎn)；然而，需要明確理解的一點(diǎn)是，我們將盡最大努力減小動(dòng)物的疼痛和痛苦，而且，如果觀察到動(dòng)物將自然地屈服于感染時(shí)，我們會(huì)在這之前對(duì)其實(shí)行安樂(lè)死以達(dá)到減少它們痛苦的目的。
a.動(dòng)物從單個(gè)合法賣主獲得的無(wú)特定病原，雌性ICR級(jí)小鼠，重量大約在23-27克之間，在實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中使用。在做活體實(shí)驗(yàn)前的一個(gè)星期，這些動(dòng)物將會(huì)用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)需要。
b.抗真菌類藥藥劑將從SynerZ醫(yī)藥品公司在數(shù)量上得到充分的補(bǔ)給，以完成實(shí)驗(yàn)大綱的需要。此外，SynerZ公司會(huì)在貫穿研究過(guò)程中，在解決維持研究的連貫性所做準(zhǔn)備之前，提供穩(wěn)定的，分散的及公式化的數(shù)據(jù)。我們將直接從廠商處獲得抗真菌類藥物的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照——fluconazole?？拐婢悘?fù)合物將以腹膜內(nèi)注射形式來(lái)給藥。
c.菌種研究所用菌種為單一的白色假絲酵母(ATCC 36082)或者由SynerZ公司提供的臨床藥抗菌種。
d.易感性測(cè)試測(cè)試有機(jī)體所用的所有復(fù)合物的最小抑制濃度將參照SynerZ公司所提供的固定標(biāo)準(zhǔn)NCCLS微稀釋技術(shù)。
e.急毒實(shí)驗(yàn)給藥和藥物評(píng)估我們用合適手段準(zhǔn)備一連串測(cè)試復(fù)合物的兩部稀釋，這樣，在0.2毫升體積稀釋下，將產(chǎn)生跨越廣泛范圍濃度的劑量。每個(gè)測(cè)試復(fù)合物將用5種劑量來(lái)進(jìn)行評(píng)估。這5個(gè)測(cè)試用的劑量的選擇將通過(guò)與SynerZ公司的進(jìn)一步協(xié)商所決定。
i.每個(gè)測(cè)試復(fù)合物(與低劑量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照f(shuō)luconazole復(fù)合)用5種劑量，每個(gè)劑量用5只小鼠，5個(gè)復(fù)合物(共125只小鼠)。
ii.測(cè)試復(fù)合物用腹膜內(nèi)注射給藥。
iii.對(duì)照組(5只小鼠)接受與積極治療組相同給藥途徑的手段，0.2毫升治療劑和fluconazole的非最佳理想劑量。
iv.臨床觀察直到研究終點(diǎn)96小時(shí)后，動(dòng)物會(huì)被每天觀察3次，看是否有藥物相關(guān)的發(fā)病的信號(hào)或者充血現(xiàn)象出現(xiàn)。
v.計(jì)算所需小鼠每個(gè)測(cè)試復(fù)合物的治療組+對(duì)照組＝130只小鼠。
f.確認(rèn)研究在感染之前，通過(guò)腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺4天(150mg/kg)和接種前注射1天(100mg/kg)致使小鼠嗜中性白血球減少。測(cè)試有機(jī)體將在沙氏瓊脂糖培養(yǎng)基上次培養(yǎng)，35℃ 24小時(shí)。一組小鼠(5個(gè)一組)用0.1ml 106CFU/ml，懸浮于溫暖鹽水中的接種體通過(guò)側(cè)面尾部脈絡(luò)進(jìn)行感染。由早先的研究所提出的方法，這種接種體可穩(wěn)定再生的感染。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，最終候選菌種將證實(shí)感染。計(jì)算所需小鼠(5個(gè)小鼠/組×1個(gè)接種體×重復(fù)實(shí)驗(yàn))＝每個(gè)菌種10只小鼠。
g.定量效率研究為每個(gè)單獨(dú)或者復(fù)合使用的復(fù)合藥物，比較評(píng)估治療后感染小鼠腎中的真菌密度的治療功效。在24小時(shí)期間，每個(gè)復(fù)合物6-8個(gè)劑量組將用于每組3個(gè)小鼠的研究。對(duì)照組小鼠將接受自由輔藥互動(dòng)作用手段，與治療組相同劑量。一組非治療對(duì)照組將在治療開(kāi)始前和所有治療組治療末期完成后處死，以確定感染建立。在用吸入CO2致死后，小鼠的腎降被切除，在消毒后的0.9％鹽水中鋪成均勻分布的顆粒。將均勻混合物的連續(xù)稀釋液接種于SDA上，35℃孵育24小時(shí)后，數(shù)出存活真菌數(shù)。
1.感染培養(yǎng)先前所描述的測(cè)試有機(jī)體一夜后，得到接種體懸浮液，取0.1毫升從側(cè)面尾部脈絡(luò)注入到23-27克重小鼠中。
2.給藥劑量選擇決定于基于初步毒性研究所確定的最大忍受劑量。每個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(fluconazole)和測(cè)試復(fù)合物用6-8個(gè)治療組來(lái)測(cè)試。最終劑量組將與發(fā)起人協(xié)商后決定。
3. 24[每個(gè)劑量3只小鼠*8個(gè)組*1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(fluconazole)]只小鼠將在接種后2小時(shí)由腹膜內(nèi)注射給藥。
4. 120[每個(gè)劑量3只小鼠*8個(gè)組*5個(gè)測(cè)試復(fù)合物]只小鼠將在接種后2小時(shí)由腹膜內(nèi)注射給藥。
5. 72[(30小時(shí)對(duì)照+324小時(shí)對(duì)照)*12套測(cè)試組]只小鼠被用作對(duì)照。治療組的數(shù)量由及時(shí)處理每個(gè)實(shí)驗(yàn)的一定體積的樣品能力所決定?；谶@些樹(shù)目，每個(gè)復(fù)合物的8個(gè)治療組分為兩套(每套4個(gè))。
6.總共需要小鼠216只。
h.數(shù)據(jù)分析樣本大小沒(méi)有計(jì)算急毒實(shí)驗(yàn)用樣本大小的預(yù)先估價(jià)，因?yàn)檫@些研究在以前沒(méi)有做過(guò)，樣品大小用5，是與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相協(xié)和的，因?yàn)檫@能為初步評(píng)估測(cè)試藥物提供足夠的信息。
定量培養(yǎng)部分的樣品是按以下方法來(lái)計(jì)算的1)典型的抗微生物劑最佳給藥量組通常使真菌密度產(chǎn)生大約減少2-3log，2)為了使觀察平均數(shù)背離真實(shí)平均數(shù)不超過(guò)1SD，使用兩邊95％獨(dú)立間隔有80％可能性，需要6個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。用我們提議的方法，每個(gè)動(dòng)物的腎臟組織中將產(chǎn)生兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
定量培養(yǎng)研究24小時(shí)后，通過(guò)治療組小鼠腎中真菌密度的改變與開(kāi)始的對(duì)照組小鼠對(duì)比，計(jì)算功效。組織中的真菌密度改變用log10 CFU的變化來(lái)表示，所有治療和非治療的小鼠用描述統(tǒng)計(jì)學(xué)報(bào)導(dǎo)。每個(gè)復(fù)合物包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照構(gòu)造log10CFU對(duì)抗菌劑劑量的曲線。數(shù)據(jù)將適合用Emax模型來(lái)決定50％有效劑量。單獨(dú)藥劑和復(fù)合藥劑的效力(真菌濃度的改變)將用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)來(lái)處理。
權(quán)利要求
1.該專利是為篩選能與已知藥物，相互作用并增強(qiáng)其療效，從而降低藥物臨床劑量的化合物而開(kāi)發(fā)的方法，這項(xiàng)發(fā)明包括(a)先確定幾種現(xiàn)在臨床上使用的或已經(jīng)被淘汰的先導(dǎo)藥物；(b)構(gòu)建多個(gè)具有多樣性的天然產(chǎn)物或合成化合物庫(kù)；(c)建立一個(gè)已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物亞最適劑量的功能性檢測(cè)分析方法；(d)采用c步中所建立的檢測(cè)方法，檢測(cè)及篩選b步中所構(gòu)建的天然產(chǎn)物或合成化合物庫(kù)中各化合物在不同濃度下與已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物相互作用的活性；(e)確定一種或者更多種具有增強(qiáng)已知藥物療效的化合物。
2.權(quán)利要求1中提出的方法，也包含對(duì)所確定的化合物的純化方法。
3.權(quán)利要求1中提出的方法，化合物庫(kù)中不僅包括小分子化合物同時(shí)也包括大分子化合物，例如蛋白質(zhì)、核酸以及SiRNA庫(kù)。
4.權(quán)利要求1中提出的方法，互動(dòng)先導(dǎo)化合物的檢出命中率是0.1％-1％。
5.權(quán)利要求1中提出的方法，互動(dòng)藥物指能增強(qiáng)已知藥物在亞最適劑量時(shí)的療效，k可達(dá)到最大療效劑量的10％-40％。
6.權(quán)利要求1中提出的方法，檢驗(yàn)系統(tǒng)包括任何生物化學(xué)結(jié)合試驗(yàn)，酶學(xué)檢驗(yàn)等。
7.權(quán)利要求6中提出的方法，檢驗(yàn)系統(tǒng)可以是基于任何細(xì)胞或動(dòng)物模型基礎(chǔ)上的生物檢驗(yàn)。
8.權(quán)利要求6中提出的方法，檢測(cè)系統(tǒng)可以應(yīng)用任何疾病模型的臨床試驗(yàn)。
9.權(quán)利要求1中提出的方法，篩選步驟d可以是應(yīng)用任何人工的或機(jī)械手來(lái)完成。
10.權(quán)利要求1中提出的方法，探測(cè)系統(tǒng)e可以是通過(guò)報(bào)告基因分析，cytoblot分析和顯微分析等方法來(lái)完成。
11.權(quán)利要求1中提出的方法，步驟(c)中亞最適劑量的確定使用了軟件及其運(yùn)算法則。
12.權(quán)利要求10中提出的方法，亞最適劑量用于指導(dǎo)配伍設(shè)計(jì)。
13.權(quán)利要求10中提出的方法，已知藥物的劑量被降低到亞最適劑量時(shí)可加強(qiáng)細(xì)胞用于篩選互動(dòng)伴侶或先導(dǎo)化合物的敏感度。
14.權(quán)利要求1-12中提出的方法，所篩選的化合物系未知或未曾應(yīng)用此方法鑒定而被報(bào)道。
15.對(duì)權(quán)利要求13中的化合物進(jìn)行確認(rèn)。
16.組成成分包括如何在權(quán)利要求1-12中的方法所確定的化合物、已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物及合適的藥劑載體。
17.已知藥物的亞最適濃度的確定需采用權(quán)利要求1-12中的任何方法。
18.組成成分包括采用權(quán)利要求1-12中任何方法所鑒定的亞最適濃度時(shí)的已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物及合適藥劑載體。
19.環(huán)六酚羧肽Beauvericin(SZC-101)被鑒定為一個(gè)酮康唑和其他唑類藥物的互動(dòng)藥物。
20.藥物組成成分或配伍藥劑劑型包括權(quán)利要求15中的組分。
21.通過(guò)權(quán)利要求1-3中的方法所確定的化合物，可用于鑒別與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)及其路徑。
全文摘要
這項(xiàng)發(fā)明為挖掘可以與低劑量已知藥物產(chǎn)生互動(dòng)作用的新一代化合物或配伍提供了一個(gè)有力的系統(tǒng)方法。選用已知的藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物被用作參照物，然后建立一個(gè)包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子的天然產(chǎn)物或合成化合物(純的或混合的)庫(kù)。通過(guò)建立包括生物化學(xué)的、基于細(xì)胞、動(dòng)物模型以及臨床治療在內(nèi)的活性檢測(cè)分析方法和確定參照物(10％－40％最大活性的)亞最適劑量，按照0.1％－1％的檢出率進(jìn)行高通量地篩選不同濃度下的天然產(chǎn)物或合成化合物庫(kù)。被鑒定為具有互動(dòng)作用的候選物必須在與已知藥物的亞最適劑量的結(jié)合后能增強(qiáng)已知藥物最大活性70％－100％的活性。最后，被檢測(cè)到的具有互動(dòng)作用的輔助藥物將繼續(xù)被純化和鑒定，最終從天然的或合成的混合物庫(kù)中分離純化出單一成分的互動(dòng)藥物。
文檔編號(hào)A61K31/70GK1968685SQ200480034073
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者張立新 申請(qǐng)人:張立新