從多相混合物回收包含生物分子的水相的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從多相混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相的方法，所述多相混合物包含至少所述水相和與所述水相不混溶的其它液相，其中所述其它液相包含至少一種烴類化合物。本發(fā)明還涉及親水性過濾材料的應(yīng)用、包含所述過濾材料的裝置或包含所述裝置的試劑盒，用于從所述水相和包含至少一種烴類化合物的其它液相的混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相，所述其它液相與所述水相不混溶。
【專利說(shuō)明】從多相混合物回收包含生物分子的水相
[0001]本發(fā)明涉及一種從多相混合物回收其中包含溶解的生物分子的水相的方法，所述多相混合物包含至少所述水相和與所述水相不混溶的其它液相，其中所述其它液相包含至少一種烴類化合物。本發(fā)明還涉及親水性過濾材料的應(yīng)用、包含所述過濾材料的裝置或包含所述裝置的試劑盒，用于從所述水相和包含至少一種烴類化合物的其它液相的混合物回收包含溶解于其中的生物分子的水相，所述其它液相與所述水相不混溶。
[0002]就長(zhǎng)期貯存和/或組織學(xué)檢測(cè)而言，生物學(xué)樣品通過用化學(xué)固定劑(例如福爾馬林)誘導(dǎo)所述樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)來(lái)常規(guī)貯存，從而保存組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。固定之后，所述樣品通常被包埋進(jìn)蠟(最常用石蠟)中，從而允許對(duì)所述樣品進(jìn)行切片和封固，以供顯微鏡檢和/或組織學(xué)應(yīng)用。
[0003]近年來(lái)，已開發(fā)出用于分離和分析來(lái)自此類蠟包埋樣品的大分子的方法，所述大分子包括DNA、RNA且最近也包括蛋白質(zhì)。然而，這些應(yīng)用通常需要在任何其它處理步驟之前從所述樣品去除包埋介質(zhì)(所謂“脫蠟”/ “脫石蠟(cbparaffinisation) ”)。并且，脫蠟也有利于許多組織學(xué)染色方法。
[0004]傳統(tǒng)的脫蠟包括采用芳族溶劑，例如甲苯，特別是二甲苯。通常將新鮮切片或經(jīng)封固的顯微切片樣品浸入二甲苯浴直至石蠟溶解。在后續(xù)步驟中，用醇濃度遞減的一系列醇溶液洗滌該脫石蠟樣品以去除二甲苯，最后用水洗滌，從而使該樣品與水性反應(yīng)物/試劑溶液(例如，裂解緩沖液或染色溶液)相容?？墒牵妆绞强扇?、揮發(fā)性且有毒的有機(jī)溶劑。因此，在過去幾年中，為用毒性較低的脫石蠟劑替換二甲苯，人們做了大量的努力。組織學(xué)應(yīng)用中，替換二甲苯的例子包括礦物油和萜油，如d-檸檬烯，以及脂族烴類或異石蠟經(jīng)類(R.J.Buesa, M.V.Peshov, Annals of Diagnostic Pathology2009, 13, 246-256)。在相同 申請(qǐng)人:的共同在審的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?0165799.7中，描述了一種從蠟包埋樣品提取生物分子的方法，其中為了釋放所述生物分子進(jìn)入溶液以供其進(jìn)一步檢測(cè)、分析、分離和/或純化步驟的樣品細(xì)胞的裂解在兩相或多相系統(tǒng)中進(jìn)行，所述系統(tǒng)包含含有蠟溶解試劑和溶解的蠟的至少一種有機(jī)相和水性裂解緩沖液相。
[0005]另一種方法是簡(jiǎn)單地使所述包埋的生物學(xué)樣品懸浮于水性溶液中，然后使其在高于該包埋介質(zhì)熔點(diǎn)的溫度孵育，以將細(xì)胞物質(zhì)釋放進(jìn)入溶液以供進(jìn)一步處理(參見，例如，W002/46463A2)。
[0006]上述兩種方法均避免了使用毒性脫石蠟試劑和費(fèi)力的洗滌步驟，然而，仍需要從包含溶解于其中的生物分子的水相中物理移出所述溶解的、熔化的或再凝固的包埋介質(zhì)的步驟。從由水相和含烴相形成的二相或多相混合物回收包含溶解于其中的生物分子的所述水相的步驟通過將上層疏水層輕輕倒出，抽吸出各層之一使其彼此分離或?qū)Ω鲗舆M(jìn)行移液使其彼此分離來(lái)進(jìn)行。然而，所有前述的用于從其它層回收一層的方法均無(wú)法自動(dòng)化進(jìn)行，或者即便實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化也至少無(wú)法避免故障。
[0007]過濾常規(guī)用于從液體分離固體材料，而傳統(tǒng)的過濾部件(例如玻璃料、篩子等)通常不適于分離不混溶液體的混合物。
[0008] 在去除水污染領(lǐng)域中，采用所謂錯(cuò)流過濾法(也稱為切線流過濾法)來(lái)分離水和烴類(例如，油)的液體混合物(參見，例如，US5，158，681和DE43 OO 438C1)。在錯(cuò)流過濾法中，沿與濾器表面(通常是膜)成切線的方向以正壓引導(dǎo)進(jìn)料，由此所述物質(zhì)的部分能夠穿過所述膜的孔通過該膜。在傳統(tǒng)的所謂死端式(dead-end)過濾法中，在濾器表面上引導(dǎo)進(jìn)料，使濾液通過該濾器并從其另一端離開，而滲余物被阻擋在所述濾器中和/或所述濾器的表面上。盡管錯(cuò)流過濾法允許連續(xù)處理，但其較不適于對(duì)多個(gè)小樣品體積進(jìn)行快速低成本處理，尤其是考慮到自動(dòng)化方面。
[0009]因此，本發(fā)明的問題是提供一種從包含水相和與所述水相不混溶的至少一種其它液相的多相混合物回收包含溶解于其中的感興趣生物分子的水相的方法，其中所述其它液相包含至少一種烴類化合物，其中所述方法可在完全自動(dòng)化方法過程中用于分離所述生物分子。
[0010]該目標(biāo)通過本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)吃驚地發(fā)現(xiàn)，包含溶解于其中的感興趣生物分子的水相可以快速且可靠的方式從包含至少一種所述水相和與所述水相不混溶且包含至少一種烴類化合物的其它液相的多相混合物中回收，所述方法通過如下方式進(jìn)行:將所述多相混合物的進(jìn)料導(dǎo)向過濾部件表面上，包含溶解于其中的任何感興趣生物分子的水相能透過所述過濾部件，但包含至少一種烴類化合物的其它液相不能透過所述部件。 [0011]因此，本發(fā)明提供一種從多相混合物回收水相的方法，所述水相包含溶解于其中的感興趣生物分子，所述多相混合物包含至少所述水相和與所述水相不混溶且包含至少一種烴類化合物的其它液相，所述方法包括如下步驟:將所述多相混合物進(jìn)料導(dǎo)向過濾部件表面上，其中包含溶解于其中的任何感興趣生物分子的水相能夠透過所述部件，但包含所述至少一種烴類化合物的其它液相不能透過所述部件。具體而言，本發(fā)明方法可用于從所述多相混合物分離所述生物分子的方法。
[0012]與本領(lǐng)域用于該目的的已知方法相比較，本發(fā)明方法允許從其它液相快速且可靠地分離包含溶解于其中的感興趣生物分子的水相，所述其它液相例如包含溶解的包埋介質(zhì)(如從FFPE樣品溶解出的石蠟)，所述方法可完全自動(dòng)化。本發(fā)明方法還可用于從生物學(xué)樣品分離其它疏水性化合物(例如，脂肪或油)，所述方法采用一種或多種烷基溶劑以避免常用的耗時(shí)液-液提取步驟。
[0013]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“從多相混合物回收水相”指一種相從另一種相物理(空間)分離，且不僅是例如使乳液瓦解(collapse)。術(shù)語(yǔ)“多相混合物”包括含有2、3、4等個(gè)相的混合物，前提是所述混合物包含含有溶解于其中的生物分子的至少一個(gè)水相，和與所述水相不混溶的其它液相，其中，所述其它液相包含至少一種烴類化合物。然而，所述多相混合物還可包含多于兩種不同的相，例如，第三相是在所述水相和包含至少一種烴類化合物的其它液相中均不溶的固體，穩(wěn)定的乳化相或任何一種或多種中間相。然而，在大多數(shù)情況中且優(yōu)選地，本發(fā)明的多相混合物可是確切包含一種水相和包含所述至少一種烴類化合物的一種其它液相(獨(dú)立于任何中間相)的液二相混合物。
[0014]本發(fā)明中，與水不混溶的其它液相是指與水在室溫(23°C +/-2°C )下混合后不形成均一溶液的液相。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“至少一種烴類化合物”指包含碳和氫，優(yōu)選由碳和氫組成的任何有機(jī)化合物，包括直鏈和支鏈脂族烴和環(huán)烴，包括芳族烴例如二甲苯或甲苯。優(yōu)選地，本發(fā)明的至少一種烴類化合物選自下組:直鏈和環(huán)狀烷烴，所述后者包括具有1、2、3或更多C = C雙鍵的烴類，包括松節(jié)油，例如二戊烯、芳烴，優(yōu)選經(jīng)取代或未經(jīng)取代的單環(huán)和/或雙環(huán)同素環(huán)芳烴，例如二甲苯或甲苯，和/或各種經(jīng)取代或未經(jīng)取代的單環(huán)、雙環(huán)和/或多環(huán)雜環(huán)芳烴，及其混合物。優(yōu)選地，所述烴類化合物的大氣壓下(1，013.25毫巴)的熔點(diǎn)可高于室溫(23 °C +/-2 °C ) ο
[0015]本發(fā)明中，所述其它液相中存在的烴類化合物可以是(I)烷基溶劑或烷基溶劑的混合物，例如，十四烷、十六烷或礦物油的混合物，(2)熔化的石蠟或溶解于有機(jī)溶劑中的石蠟，其與所述水相不混溶，但不是烷基溶劑。更優(yōu)選地，所述液相可包含(3)烷基溶劑(I)和溶解于其中的石蠟(2)兩者，因此包含烴類化合物的混合物。
[0016]優(yōu)選地，所述至少一種烴類化合物(或所述其它液相中存在烴類化合物混合物的情況下的各烴類化合物)的鏈長(zhǎng)是至少6個(gè)碳原子，更優(yōu)選地是至少10個(gè)，甚至更優(yōu)選地是至少14個(gè)，且最優(yōu)選地是至少16個(gè)碳原子，分別對(duì)應(yīng)于烷基溶劑形式的直鏈非支化的烷烴己烷、癸烷、十四烷和十六烷。所述其它液相與包含溶解的感興趣生物分子的水相不混溶，并且優(yōu)選包含不同烴類化合物的混合物，優(yōu)選包含鏈長(zhǎng)不同的烴類化合物的混合物，例如石蠟，其在室溫下是主要由飽和烴類固體構(gòu)成的混合物，其通常通過石油蒸餾來(lái)制備。所述其它液相可包含其它烴類化合物，例如直鏈烷基溶劑(室溫下的直鏈烷烴液體)，例如，其可以是石蠟和有機(jī)溶劑(例如十六烷)的混合物，或內(nèi)含石蠟的烴類溶劑(例如十六烷、礦物油、d-檸檬烯等)溶液。盡管所述其它液相可包含其它非烴類化合物成分，例如酯、醛等，所述烴類化合物在所述相中的量可優(yōu)選高于50 %，更優(yōu)選高于75 %，甚至更優(yōu)選高于90%,且最優(yōu)選高于95% (w/w) ο [0017]包含所述生物分子的水相從與所述水相不混溶的其它液相的物理分離通過將多相混合物進(jìn)料導(dǎo)向過濾部件表面上來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，過濾部件包含至少一種親水性過濾材料，其優(yōu)選可被支撐結(jié)構(gòu)支持。此外或替代性地，所述過濾部件可包含預(yù)過濾結(jié)構(gòu)。因此，本文術(shù)語(yǔ)“過濾部件”涵蓋⑴親水性過濾材料與(ii)預(yù)過濾和(iii)支撐結(jié)構(gòu)的組合，前提是所述后者(ii和iii)之一存在或均存在。所述過濾部件中包含的親水性過濾材料允許所述水相通過，但使所述其它液相滯留。因此，與本領(lǐng)域已知用于分離油水混合物的錯(cuò)流膜分離技術(shù)不同，該進(jìn)料不以切線方向通過該膜，而是導(dǎo)向所述過濾材料(例如，膜)上，例如，沖擊角是15~165°，優(yōu)選是30~150°，更優(yōu)選是45~135°，甚至更優(yōu)選70~110°，且最優(yōu)選基本垂直的方向(沖擊角為90° +/-5° )。
[0018]該差異描述于圖1和圖2中:在錯(cuò)流過濾中(圖1)，進(jìn)料⑴沿切線方向通過濾器/膜表面(3)，之后該流的部分穿過該膜并且以約90°的角度從該流分離(濾液/透過物4)，而滲余物(2)隨該流(I)沿該膜傳送。
[0019]在本發(fā)明方法中(圖2)，進(jìn)料⑴導(dǎo)向?yàn)V器/膜表面上(3)，濾液(4)通過該濾器/膜(3)，而滲余物(2)滯留在所述濾器的相反側(cè)。
[0020]在本發(fā)明方法中，設(shè)想所述水相和其它液相的分離(主要)依賴通過過濾的物理分離?；诖耍景l(fā)明方法與基于吸附的方法相比還具有明顯優(yōu)勢(shì)。例如，在基于吸附的方法中，總是需要考慮待去除的化合物的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)選擇吸附結(jié)構(gòu)(例如，膜)，以允許所述吸附/結(jié)合結(jié)構(gòu)和所述化合物之間的吸附/結(jié)合相互作用。此外，可從樣品去除的化合物的量常受限于所述吸附/結(jié)合結(jié)構(gòu)中的相互作用/結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。相反，可將本發(fā)明方法應(yīng)用于很多種不同化學(xué)化合物而無(wú)需特定地配合所述過濾部件。此外，可采用相當(dāng)小的過濾部件從樣品去除非常大量的化合物，因?yàn)楸景l(fā)明方法不受所述過濾部件中可能的相互作用/結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量的限制。因此，如果待從所述水相分離的分子數(shù)量與所述過濾部件中全部位點(diǎn)(其可通過靜電、離子和/或范德華相互作用或共價(jià)結(jié)合與所述分子結(jié)合/相互作用)的數(shù)量的比>1，>10，>50或甚至>100，也可應(yīng)用本發(fā)明方法。
[0021]在本發(fā)明中，過濾部件包含至少一種親水性過濾材料，其優(yōu)選可被支撐結(jié)構(gòu)支持。此外或替代性地，所述過濾部件可包含預(yù)過濾結(jié)構(gòu)。因此，本文術(shù)語(yǔ)“過濾部件”涵蓋(i)親水性過濾材料與(ii)預(yù)過濾和(iii)支撐結(jié)構(gòu)的組合，前提是所述后者(ii和iii)之一或均存在。所述過濾部件中包含的親水性過濾材料允許水相通過，但使所述其它液相滯留。
[0022]本發(fā)明中所用的親水性過濾材料能透過包含溶解于其中的任何感興趣生物分子的水相，但不能透過包含至少一種烴類化合物的其它液相。本發(fā)明中“能透過包含溶解于其中的任何感興趣生物分子的水相”指，在所述水相通過所述過濾部件的步驟中，在所述樣品的進(jìn)一步處理過程中待檢測(cè)、分析、分離和/或純化的任何生物分子基本不被所述過濾部件的任何部分排斥、保留、吸附或與所述過濾部件的任何部分結(jié)合等。優(yōu)選被保留的感興趣生物分子少于0.1 μ g/mg膜。本發(fā)明中，若在以每分鐘1，OOOxg,優(yōu)選2，OOOxg,更優(yōu)選3，500xg,甚至更優(yōu)選5，OOOxg且最優(yōu)選6，OOOxg離心時(shí)，100 μ L所述其它液相中有少于10 μ L，優(yōu)選少于5 μ L，更優(yōu)選少于I μ L且最優(yōu)選少于0.1 μ L通過過濾材料，則所述過濾材料不能透過其它液相。
[0023]優(yōu)選地，所述過濾部件包含至少一種親水性過濾材料，優(yōu)選具有以下形式:膜、濾器、帶小孔徑(例如，約0.2 μ m)的玻璃料、薄膜、絨料(fleece)、有孔的整體塊狀物，或含有親水性過濾材料的粉末、粒子、珠、顆?；蚯蝮w的濾床。優(yōu)選地,所述親水性過濾材料不以中空纖維形式存在。
[0024]優(yōu)選地，所述親水性過濾材料可選自下組:乙酸纖維素(CA)、聚酰胺(PA)、聚醚砜(PES)和聚偏二氟乙烯(PVDF)或其混合物，例如以下混合物:CA和PA 'Ck和PES 'Ck和PVDF ;CA、PA 和 PES ;CA、PA 和 PVDF ;CA、PA、PES 和 PVDF ；PA 和 PES ；PA 和 PVDF，PA、PES 和PVDF或PES和PVDF。更優(yōu)選地，所述親水性過濾材料選自下組:乙酸纖維素和聚酰胺。優(yōu)選地，所述過濾材料的最大孔徑是0.45 μ m,更優(yōu)選地是0.40 μ m,甚至更優(yōu)選地是0.35、
0.30、0.29或0.25 μ m,且最優(yōu)選是0.22 μ m。最小孔徑優(yōu)選至少是0.01 μ m，更優(yōu)選是至少
0.05 μ m,甚至更優(yōu)選是至少0.10或0.15 μ m且最優(yōu)選至少0.20 μ m。
[0025]所述親水性過濾材料的厚度優(yōu)選可以是至少10 μ m,更優(yōu)選是至少25 μ m,甚至更優(yōu)選是至少50 μ m,特別優(yōu)選地是至少75 μ m,且最優(yōu)選是至少100 μ m。
[0026]所述親水性過濾材料的供于水的流速優(yōu)選是每平方厘米約5~50mL/min，更優(yōu)選是約10~30mL/min (根據(jù)DIN58355以I巴壓強(qiáng)差測(cè)定)。
[0027]所述親水性過濾材料供于水的起泡點(diǎn)優(yōu)選是至少2.0巴，更優(yōu)選是至少2.5巴，且甚至更優(yōu)選是至少2.9巴(根據(jù)DIN58355在室溫下測(cè)定)。除了至少一層親水性過濾材料以外，本發(fā)明的過濾部件可包含預(yù)過濾結(jié)構(gòu)和/或支撐結(jié)構(gòu)，所述預(yù)過濾結(jié)構(gòu)能透過所述水相和其它液相以防止固體顆粒堵塞所述親水性過濾材料的表面，所述支撐結(jié)構(gòu)支持所述親水性過濾材料并固定其位置。所述預(yù)過濾結(jié)構(gòu)和所述支撐結(jié)構(gòu)均可獨(dú)立地以玻璃料、篩板等形式存在，且不限于此，并可由既不干擾所述烴類化合物又不干擾所述水相或溶解于其中的任何生物分子的任何惰性材料(例如，聚乙烯)制成。
[0028]本發(fā)明方法中，所述水相可優(yōu)選利用重力、壓強(qiáng)、真空、吸力或離心通過所述過濾部件。為了使分離過程加速，可優(yōu)選地通過施加壓強(qiáng)、真空/吸力或離心力(不限于此)迫使所述水相通過所述過濾部件。優(yōu)選向所述過濾部件施加的力/功率取決于待分離的相和所用的過濾材料。允許以合理速度分離而不損壞所述過濾部件和/或使其能透過其它液相的所述力的合適范圍可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)容易地確定。
[0029]如上所述，所述多相混合物優(yōu)選是包含水相和與所述水相不混溶的其它液相的二相混合物。所述其它液相優(yōu)選可包含上述烴類化合物的混合物。
[0030]優(yōu)選地，導(dǎo)向所述過濾部件的表面上的多相混合物不是內(nèi)含所述水相的所述其它液相的乳液，反之亦然(分別是w/o或o/w乳液)。優(yōu)選地，所述水相和所述其它液相以兩個(gè)基本分開的液相形式存在，盡管彼此有物理接觸。優(yōu)選地，所述水相和其它液相的密度不同，從而所述兩相的混合物優(yōu)選以在液-液中間相處彼此物理接觸的兩個(gè)不同層的形式存在。優(yōu)選地，所述其它液相的密度可低于所述水相的密度，更優(yōu)選地，所述其它液相的密度低于lg/mL。優(yōu)選地，多于50%，更優(yōu)選地多于75%，甚至更優(yōu)選地多于90%且最優(yōu)選地多于95% (w/w)的所述多相混合物在接觸所述過濾部件表面時(shí)不以乳液形式存在。若所述多相混合物以乳液形式存在，則可使該乳液在接觸所述過濾部件之前在離心機(jī)中離心，從而將所述乳液分成在液-液中間相處彼此物理接觸的兩個(gè)不同的層。
[0031]所述多相混合物可通過使蠟包埋的生物學(xué)樣品接觸至少一種水性裂解緩沖液并任選地使所述樣品在所述水性裂解緩沖液的存在下升溫來(lái)獲得。
[0032]優(yōu)選地，所述多相混合物可通過如下方法獲得:
[0033]I)使蠟包埋生物學(xué)樣品接觸含有與水不混溶的至少一種有機(jī)溶劑的蠟溶解試劑；
[0034]2)任選地孵育步驟I中獲得的樣品；
[0035]3)向仍含有所述蠟溶解試劑的樣品添加水性裂解緩沖液；
[0036]4)孵育步驟3中獲得的混合物以獲得多相混合物，所述多相混合物包含作為至少一個(gè)其它液相的至少一個(gè)有機(jī)相和水相，所述有機(jī)相基本包含溶解的蠟和蠟溶解試劑，所述水相包含溶解的感興趣生物分子，
[0037]其中若省略步驟2，步驟I和3可作為一個(gè)合并步驟進(jìn)行。
[0038]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“蠟包埋樣品”包含如制備用于組織化學(xué)或其它化學(xué)和/或生物分析的用蠟包埋的任何生物樣品。所述蠟通常由高級(jí)烴的復(fù)雜混合物組成，并可包含其它組分如高級(jí)脂肪酸和/或糖醇的酯類等。然而，也可采用適合用作生物學(xué)樣品的包埋介質(zhì)的可溶于烴類的任何其它蠟，例如聚酯蠟。所述蠟可來(lái)源于天然和/或合成，并且可額外包含增強(qiáng)或改善所述蠟的樣品包埋性質(zhì)或特定特性的添加劑，例如少量的有機(jī)聚合物、DMSO或高級(jí)聚烯烴類。優(yōu)選地，所述蠟可以是石蠟，石蠟是主要由飽和烴類組成的混合物，室溫下為固體，其通常通過石油蒸餾制備。無(wú)論采用何種類型的石蠟，無(wú)論采用所謂高熔點(diǎn)或低熔點(diǎn)石蠟或其混合物，所述樣品都可以采用本發(fā)明的方法、裝置和/或試劑盒來(lái)處理。
[0039]優(yōu)選地，所述樣品可以是福爾馬林固定石蠟包埋的樣品，其中生物學(xué)樣品在用石蠟包埋之前已用甲醛固定。所述生物學(xué)樣品可以是來(lái)源于人、動(dòng)物或植物，或微生物(如細(xì)菌、酵母病毒或真菌)的完整生物體，生物體的部分，特別是組織碎片或組織切片。也可采用分離自細(xì)胞培養(yǎng)物的經(jīng)包埋的細(xì)胞。
[0040] 作為裂解緩沖液，可采用能夠裂解/破壞含細(xì)胞物質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞的任何水性溶液，由此將其中包含的生物分子釋放進(jìn)入溶液但不破壞所述感興趣的生物分子。哪種裂解緩沖液適合于從細(xì)胞釋放所述感興趣的生物分子取決于所述細(xì)胞的類型并且為技術(shù)人員已知。本領(lǐng)域已知可用于本發(fā)明方法的多種水性裂解緩沖液。若被包埋的樣品是已固定的樣品，例如福爾馬林固定的樣品，則所述裂解緩沖液可包含本領(lǐng)域已知的用于減少樣品中的交聯(lián)數(shù)的額外成分。然而，所述裂解緩沖液中并非必須有此類額外成分存在，因而日所述交聯(lián)可在上述實(shí)施方式的步驟4的孵育過程中被有效移除，甚至在不存在用于減少交聯(lián)數(shù)的化合物的情況下也能被有效移除，例如，若在約90°C的溫度下施行孵育。
[0041]本發(fā)明方法的這個(gè)實(shí)施方式的一大優(yōu)勢(shì)在于，所述樣品的脫蠟無(wú)需采用有毒化學(xué)物。此外，從樣品分離溶解蠟無(wú)需繁復(fù)的洗滌步驟或?qū)Ｓ玫臉渲４送?，步驟3中所用的裂解緩沖液以及用于在收集回收的水相之后從所述水相分離和/或純化所述核酸的任選步驟中的任何其它試劑和手段可幾乎不受限地在寬范圍的方法和/或手段中進(jìn)行選擇。這意味著所述方法可特定地適應(yīng)樣品的特殊要求。
[0042]所述蠟溶解試劑優(yōu)選可以是無(wú)毒的并且可包含與水不混溶的至少一種有機(jī)溶劑/化合物。所述蠟溶解試劑可以是液體，至少其在與含蠟樣品接觸時(shí)是液體。優(yōu)選地，所述溶劑可以是烴類化合物，優(yōu)選地選自下組:直鏈、支鏈和環(huán)狀C6-C16烷烴或其混合物，更優(yōu)選地選自下組=Cltl-C16烷烴或其混合物，甚至更優(yōu)選地選自下組=C13-C16烷烴或其混合物，并且最優(yōu)選地可以是十四烷、十五烷或十六烷。也可采用芳族試劑，例如二甲苯、甲苯或其混合物。無(wú)論是純?nèi)軇┬问竭€是溶劑混合物形式，施加至所述蠟包埋樣品用于脫蠟的任何溶劑的熔點(diǎn)優(yōu)選在大氣壓下低于室溫(23±2°C)。此外，所述溶劑或溶劑混合物應(yīng)既不溶于水(即，其在水中的溶解度應(yīng)少于0.01% (w/w))又不與水混溶(即，其在與水混合后應(yīng)不形成均一溶液)。本文中的術(shù)語(yǔ)“純的形式”指施加至蠟包埋樣品以使蠟溶解的試劑，該試劑先前未經(jīng)稀釋 和/或與其它溶劑混合。然而，這并不表示關(guān)于其它非溶劑化合物的存在的特定純度級(jí)別。若某一溶劑以純的形式施加至所述樣品，優(yōu)選該溶劑的熔點(diǎn)低于室溫。然而，若熔點(diǎn)高于室溫的“溶劑”在溶劑混合物中存在時(shí)，在大氣壓下的室溫條件下(23±2°C )是液體，則此類溶劑也可施用于所述蠟包埋樣品。
[0043]優(yōu)選地，所述溶劑或溶劑混合物的大氣壓下的沸點(diǎn)高于150°C，更優(yōu)選地高于200°C，且最優(yōu)選聞?dòng)?50°C。選擇的臘溶解試劑的沸點(diǎn)聞?dòng)?50°C使得所述樣品的石臘一旦溶解即保持在液態(tài)且不因蠟溶解試劑的不希望的蒸發(fā)而再凝固。此外，發(fā)現(xiàn)上述有機(jī)溶劑或其混合物與步驟3中添加所述裂解緩沖液之后獲得水相形成穩(wěn)定乳液的趨勢(shì)較低。令人吃驚的是，甚至在去污劑(如SDS)的存在下也是如此。此外，上述溶劑能夠使固體石蠟在室溫下于數(shù)秒內(nèi)或至多數(shù)分鐘內(nèi)(優(yōu)選約15秒~約15分鐘)溶解。
[0044]可向所述蠟溶解試劑添加或所述蠟溶解試劑中可包含染料/著色劑，所述染料/著色劑可溶于所述蠟溶解試劑但不溶于水，例如不溶于水的蒽醌溶劑染料，如作為“油綠(oil green) ”市售可得的1，4_ 二 [ (4-甲基苯基)氨基]-9，10-蒽二酮。
[0045]例如，內(nèi)含少至約I μ g量的〃油綠〃的約30mL所述蠟溶解試劑(例如，十六烷)(等同于約0.003% (w/v))即足以使所述有機(jī)相具有強(qiáng)色，而所述水相的顏色保持不變，這非常便于對(duì)完全相分離和水相回收的視覺控制。
[0046]步驟2的蠟包埋樣品中蠟溶解試劑的混合物的孵育步驟可在15~85°C的溫度范圍進(jìn)行，優(yōu)選20~55°C，更優(yōu)選室溫~35°C，且最優(yōu)選室溫。若進(jìn)行該孵育步驟，則該步驟優(yōu)選持續(xù)I秒~3小時(shí)，更優(yōu)選10秒~I小時(shí)，甚至更優(yōu)選20秒~30分鐘，且最優(yōu)選30秒~5分鐘。并且，可同時(shí)或“幾乎同時(shí)”對(duì)所述樣品施用所述蠟溶解試劑和所述水性裂解緩沖液，即，一種緊接著另一種施用，即，所述脫蠟劑緊接著所述裂解緩沖液施用，反之亦然。在這種情況下，任選省略步驟2，并步驟I和3同時(shí)或“幾乎同時(shí)”地進(jìn)行。
[0047]在本發(fā)明方法的采用上述烷烴作為蠟溶解試劑的優(yōu)選實(shí)施方式中，尤其有利的是，可在低溫下非常快速地且以(幾乎)定量的方式從所述樣品回收包埋介質(zhì)，即使向所述樣品同時(shí)或“幾乎同時(shí)”地添加水性裂解緩沖液和蠟溶解試劑。因此，細(xì)胞裂解前無(wú)需繁復(fù)且耗時(shí)的脫蠟以及相分離步驟。
[0048]因此，不同于現(xiàn)有技術(shù)已知的若干方法，在脫蠟時(shí)無(wú)需升溫和/或長(zhǎng)時(shí)間孵育，而升溫和/或長(zhǎng)時(shí)間孵育可能對(duì)生物分子(例如，核酸)的品質(zhì)和得率有負(fù)面影響，在樣品中存在尚未被蛋白酶滅活的核酸消化酶如RNA酶和DNA酶時(shí)尤其如此。在裂解前或同時(shí)脫除石蠟也縮短了所需裂解時(shí)間，因?yàn)榕c包埋樣品相比，水性裂解緩沖液能更快及有效地滲透脫石蠟樣品，即，可采用更短裂解時(shí)間和/或更低裂解溫度。然后，含生物分子的水相的回收通過本發(fā)明方法以快速且可靠的方式進(jìn)行，從而包括裂解和分離的整個(gè)方法快速且可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0049]如上所述，甚至不必在添加水性裂解緩沖液之前使所述樣品與蠟溶解試劑接觸孵育。并且所述蠟溶解試劑和所述水性裂解緩沖液可同時(shí)加入樣品。在這種情況下，優(yōu)選混合所述樣品以確保證完全的相接觸，例如但不限于通過渦旋，實(shí)驗(yàn)室振蕩器振蕩，移液器上下吹打等。也可添加其它化合物，如蛋白酶。
[0050]另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，本發(fā)明方法可與現(xiàn)有技術(shù)已知的多種裂解緩沖液和裂解方案聯(lián)合通用，例如包含在QIAamp FFPE試劑盒中的ATL緩沖液，包含在QIAsymphony DNA試劑盒中的Pl緩沖液(皆可獲自德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))，或PBS緩沖液。例如，所述裂解緩沖液可包含緩沖劑和至少一種去污劑，所述緩沖劑優(yōu)選選自下組:Tris、Mops、Mes、H印es、硼酸鹽、磷酸鹽和碳酸鹽，所述去污劑優(yōu)選選自下組:非離子型、陰離子型、陽(yáng)離子型及兩性離子型去污劑或其混合物。更優(yōu)選的去污劑選自陰離子或兩性離子去污劑。甚至更優(yōu)選的裂解緩沖液可包含陰離子去污劑，最優(yōu)選十二烷基硫酸鈉。此外，可以使用非離子表面活性劑，如取代苯酚或聚乙氧基化糖，市售可得如曲通(Triton)X-114 (陶氏化學(xué)品公司(Dow Chemical C0.)，美國(guó)密歇根州米德蘭)，曲通X_100 (陶氏化學(xué)品公司，美國(guó)密歇根米德蘭)或吐溫20(默克公司(Merck)，德國(guó)達(dá)姆施塔特)，以及陽(yáng)離子表面活性劑如季銨表面活性劑，例如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)或正辛基三甲基溴化銨(OTAB)。
[0051]所述裂解緩沖液可包含一種或多種其它物質(zhì)，所述其它物質(zhì)優(yōu)選選自下組:螯合劑、還原劑、無(wú)機(jī)鹽如硫酸銨、PH指示劑和穩(wěn)定劑如疊氮鈉。所述裂解緩沖液的pH優(yōu)選在4~11范圍內(nèi)，優(yōu)選7~10，且最優(yōu)選8~9。
[0052]除裂解緩沖液外，也可在步驟3中向所述混合物添加蛋白水解劑。所述蛋白水解劑也可已包含于向所述樣品添加的裂解緩沖液中。所述蛋白水解劑可優(yōu)選選自下組:蛋白酶和非酶促蛋白水解化合物，且更優(yōu)選地可以是蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胞內(nèi)蛋白酶Lys-C、溴化氰、重組芽孢桿菌蛋白酶例如QIAGEN蛋白酶溶菌酶(Lysozyme)或其混合物。[0053]如步驟4所述的孵育向所述樣品添加水性裂解緩沖液之后獲得的混合物的步驟可優(yōu)選地在15~95°C的溫度范圍進(jìn)行，優(yōu)選20~70°C，且最優(yōu)選37~65°C，包括56°C。該孵育可優(yōu)選地進(jìn)行30秒~24小時(shí),更優(yōu)選45秒~12小時(shí),甚至更優(yōu)選50秒~5小時(shí)，且最優(yōu)選I分鐘~2小時(shí)。然而，孵育的溫度與時(shí)間可隨樣品的種類、量和新鮮程度以及所用裂解緩沖液而變化。這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定最適裂解條件，特別就孵育時(shí)間和溫度而言。在一些情況下，還可優(yōu)選進(jìn)行〃兩步孵育〃法，首先在37~65°C的溫度范圍孵育所述混合物約I分鐘~約3小時(shí)，然后任選地如本發(fā)明所述從有機(jī)相回收水相，并在升高的溫度下(例如，至高約90°C)孵育該水相例如約10分鐘~約5小時(shí)。同樣地，任選可在升高的溫度(如90°C )下孵育之后從所述有機(jī)相回收所述水相。在該情況下，減少了所述水相的不希望的蒸發(fā)的程度。本發(fā)明方法可包括其它步驟:收集通過所述過濾部件后的水相。用于收集通過所述過濾部件后的樣品溶解的手段和裝置是本領(lǐng)域已知的。此外，所述方法還可包括從所述水相檢測(cè)、分析、分離和/或純化感興趣生物分子 的任何步驟，其中所述方法、裝置和試劑取決于待檢測(cè)、分析、分離和/或純化的生物分子，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0054]本發(fā)明中，“生物分子”包括任何核酸，如DNA或RNA，具體是線性的、分支的或環(huán)狀的，單鏈或雙鏈的核酸分子，更具體地是(但不限于)mRNA、siRNA、mi RNA, snRAN、tRNA、hnRNA或核糖酶、基因組、質(zhì)粒或細(xì)胞器DNA ;任何核苷酸、寡核苷酸或多聚核苷酸，包括合成的、經(jīng)修飾的或經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸或多聚核苷酸；PCR引物、用于雜交的短DNA或RNA片段；PNA(肽核酸)；任何蛋白質(zhì)、肽或氨基酸，包括未經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)標(biāo)記的抗體、受體、激素、生長(zhǎng)因子和經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)、核酸、傳染性來(lái)源的蛋白質(zhì)和肽；代謝物、任何脂質(zhì)；糖(單體、寡聚物或聚合物)；蛋白聚糖；任何低分子量的通路產(chǎn)物、信號(hào)分子、受體或酶活化劑或抑制劑；藥物和藥物代謝物。
[0055]優(yōu)選地，所述生物分子是核酸。優(yōu)選地，所述核酸可選自下組:核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，包括天然產(chǎn)生的，重組和/或化學(xué)或生物技術(shù)工程改造的真核、原核或病毒來(lái)源的核酸，包括但不限于:gDNA、cDNA、rRNA、mi RNA, siRNA、piRNA、snRNA、LNA(鎖定核酸)、PNA(肽核酸)、或其片段。使用合適的裂解緩沖液(如市售購(gòu)自恰根公司(QIAGEN)(德國(guó)希爾頓)的PKD緩沖液)時(shí)，甚至DNA和RNA均可用本發(fā)明方法從同一樣品分離。所述核酸優(yōu)選是DNA，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少有IOObp的DNA。
[0056]優(yōu)選地，分離和/或純化溶解于所述水相的生物分子的步驟可通過至少一種色譜和/或基于固相的方法進(jìn)行，包括常規(guī)和反向色譜、凝膠過濾色譜、離子交換色譜、三螺旋親和色譜、離液劑介導(dǎo)的或不含離液劑的親和結(jié)合(吸附)，包括由結(jié)合試劑介導(dǎo)的對(duì)二氧化硅或聚苯乙烯基質(zhì)/表面的吸附。優(yōu)選地，所述至少一種色譜和/或基于固相的方法可選自下組:凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反向色譜和親和結(jié)合。此外或替代性地，所述生物分子還可通過選擇性沉淀所述感興趣生物分子或樣品中存在的雜質(zhì)/不需要的其它化合物來(lái)純化。若感興趣的生物分子是核酸，可例如通過添加陽(yáng)離子表面活性劑(例如CTAB(溴化十六烷基三甲基銨))來(lái)使蛋白質(zhì)沉淀。
[0057]有若干試劑盒市售可得以供生物分子的檢測(cè)、分析、分離和/或純化，其中的許多可用于檢測(cè)、分析、分離和/或純化從本發(fā)明所述的多相混合物回收的水相中存在的生物分子。若核酸待分離和/或純化，這些試劑盒包括但不限于，例如，QIAamp、AllPr印DNA/RNA和QIAsymphony組織試劑盒(其全部來(lái)自德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))。
[0058]本發(fā)明還涉及親水性過濾材料、包含所述過濾材料的裝置或包含所述裝置的試劑盒用于從與水相不相容的其它液相回收所述水相的應(yīng)用，所述水相包含溶解于其中的生物分子(優(yōu)選核酸或蛋白質(zhì))，其中所述其它液相包含至少一種烴類化合物，優(yōu)選是如上所述溶解于至少一種有機(jī)溶劑的蠟。所述有機(jī)溶劑優(yōu)選選自下組:直鏈、支鏈和環(huán)狀C6-C16烷烴、烯烴或其混合物，所述其它液相更優(yōu)選地是溶解于十四烷、十五烷、十六烷或其混合物的石蠟。用于進(jìn)行本發(fā)明方法的裝置包含具有進(jìn)口和出口的中空主體，所述中空主體包含親水性過濾材料，所述親水性過濾材料優(yōu)選由支撐結(jié)構(gòu)支持，所述支撐結(jié)構(gòu)優(yōu)選是玻璃料或篩板形式。
[0059]所述親水性過濾材料可優(yōu)選地具有以下形式:膜、濾器、帶小孔徑(例如，約
0.2 μ m)的玻璃料、薄膜、絨料(fleece)、有孔的整體塊狀物，或含有親水性過濾材料的粉末、粒子、珠、顆?；蚯蝮w的濾床。優(yōu)選地，所述親水性過濾材料不以中空纖維形式存在。
[0060]優(yōu)選地，所述親水性過濾材料可選自下組:乙酸纖維素(CA)、聚酰胺(PA)、聚醚砜(PES)和聚偏二氟乙烯(PVDF)或其混合物，例如以下混合物:CA和PA 'Ck和PES 'Ck和PVDF ;CA、PA 和 PES ;CA、PA 和 PVDF ;CA、PA、PES 和 PVDF ；PA 和 PES ；PA 和 PVDF，PA、PES 和PVDF或PES和PVDF。更優(yōu)選地，所述親水性過濾材料選自下組:乙酸纖維素和聚酰胺，及其混合物。優(yōu)選地，所述過濾材料的最大孔徑是0.45 μ m,更優(yōu)選地是0.40 μ m,甚至更優(yōu)選地是0.35、0.30、0.29或0.25 μ m,且最優(yōu)選是0.22 μ m。最小孔徑優(yōu)選至少是0.01 μ m，更優(yōu)選是至少0.05 μ m,甚至更優(yōu)選是至少0.10或0.15 μ m且最優(yōu)選至少0.20 μ m。
[0061]所述親水性過 濾材料的厚度優(yōu)選可以是至少10 μ m,更優(yōu)選是至少25 μ m,甚至更優(yōu)選是至少50 μ m,特別優(yōu)選地是至少75 μ m,且最優(yōu)選是至少100 μ m。
[0062]所述親水性過濾材料的供于水的流速優(yōu)選是每平方厘米約5~50mL/min，更優(yōu)選是約10~30mL/min (根據(jù)DIN58355以I巴壓強(qiáng)差測(cè)定)。
[0063]所述親水性過濾材料供于水的起泡點(diǎn)優(yōu)選是至少2.0巴，更優(yōu)選是至少2.5巴，且甚至更優(yōu)選是至少2.9巴(根據(jù)DIN58355在室溫下測(cè)定)。
[0064]所述中空主體可由適合樣品收集、貯存或處理的任何材料制成，如塑料、金屬、玻璃、瓷器等。優(yōu)選地，所述主體可由塑料制成，更優(yōu)選地，所述主體可由熱塑樹脂制成，例如但不限于:聚丙烯、聚乙烯、聚丙烯共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亞胺、聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚交酯、乙烯-聚醋酸乙烯酯、氯乙烯酯、醋酸乙烯酯共聚物、聚乙酸酯、聚醚醇、醋酸乙烯酯共聚物等。優(yōu)選所述裝置的進(jìn)口開于所述裝置的“上端”，而出口開于所述裝置的“底側(cè)”。特別優(yōu)選所述進(jìn)口和所述出口彼此相對(duì)。任選地，所述裝置可包含至少一個(gè)可移動(dòng)的關(guān)閉裝置以關(guān)閉所述裝置的進(jìn)口和/或出口。在所述中空主體內(nèi)部或其底端，即，在出口側(cè)，所述中空主體配備有至少一層所述親水性過濾材料，所述親水性過濾材料以如下方式布置在流動(dòng)區(qū)域中:進(jìn)料中的基本全部水相在通過所述出口離開該中空主體之前必經(jīng)所述親水性過濾材料層。合適的親水性過濾材料及其性質(zhì)已在上文有描述。
[0065]優(yōu)選地，所述裝置還包含支持親水性過濾材料層的支撐結(jié)構(gòu)，以改善該層的機(jī)械穩(wěn)定性并將該材料保留在所述中空主體內(nèi)部。所述支撐結(jié)構(gòu)可以具有，例如，玻璃料、篩板等形式。所述裝置還可包含預(yù)過濾結(jié)構(gòu)，所述預(yù)過濾結(jié)構(gòu)被置于所述親水性過濾材料上方以保留進(jìn)料中存在的固體顆粒，否則所述固體顆粒會(huì)阻擋所述親水性膜。所述預(yù)過濾結(jié)構(gòu)可以具有，例如，玻璃料、篩板、濾器等形式。優(yōu)選地，所述預(yù)過濾結(jié)構(gòu)以及所述支撐結(jié)構(gòu)均不通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合、吸附、化學(xué)反應(yīng)、靜電或離子相互反應(yīng)等與形成進(jìn)料的所述多相混合物中存在的化合物尤其是感興趣的生物分子或溶劑相互反應(yīng)。本發(fā)明中，親水性過濾部件如上所述包含至少一種親水性過濾材料和至少一種預(yù)過濾或支撐結(jié)構(gòu)。
[0066]優(yōu)選地，所述裝置可以是漏斗、柱體、注射器或多孔板，更優(yōu)選地是配備有如上所述的親水性過濾材料或親水性過濾部件的離心柱。優(yōu)選地，本發(fā)明裝置是配備有所述親水性過濾材料/親水性過濾部件的離心柱。
[0067]用于進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒包含親水性過濾材料(優(yōu)選地,所述親水性過濾材料如上所述包含在所述裝置中)，和選自下組的至少一種其它組成部分:所述試劑盒的使用說(shuō)明書、裂解緩沖液、蠟溶解試劑、蛋白水解劑和用于通過色譜和/或親和結(jié)合來(lái)純化所述感興趣生物分子的固相。優(yōu)選地，所述裂解緩沖液、蠟溶解試劑和蛋白水解劑可以是上述那些。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0068]圖1說(shuō)明錯(cuò)流過濾法的原理。
[0069]圖2說(shuō)明死端式過濾法的原理，后者用于本發(fā)明方法。 [0070]圖3顯示本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí)施方式，其為離心柱，該離心柱包含中空主體(5)、進(jìn)口(6)和出口(7)，所述中空主體(5)配備有親水性過濾材料(3)，所述親水性過濾材料
(3)由多孔玻璃料形式的支撐結(jié)構(gòu)(8)支持。
[0071]圖4顯示對(duì)包含gDNA的四個(gè)樣品的OD掃描，所述樣品已根據(jù)本發(fā)明方法從FFPE組織切片分離并純化(參見實(shí)施例2)。
[0072]圖5顯示對(duì)上述FFPE樣品的凝膠電泳分析結(jié)果(實(shí)施例2)。
[0073]圖6顯示對(duì)采用本發(fā)明方法從FFPE樣品獲得的人扁桃體DNA中的KRAS的密碼子12和13中的突變的分析結(jié)果(實(shí)施例2)。
[0074]圖7顯示采用本發(fā)明方法的由水性裂解緩沖液和d-檸檬烯與十六烷的混合物形成的乳液的分離(實(shí)施例3)。
[0075]圖8顯示采用本發(fā)明方法的由水性裂解緩沖液和二甲苯形成的乳液的分離(實(shí)施例4)。
實(shí)施例
[0076]實(shí)施例1:本發(fā)明的裝置的制備
[0077]向配備有玻璃料的標(biāo)準(zhǔn)離心柱(德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))放置帶0.2μπι孔徑的乙酸纖維素濾器(0Ε66，德國(guó)達(dá)塞爾的施萊些許爾微型科學(xué)有限公司(Schleicher&Schiill Microscience GmbH))，該濾器用手術(shù)刀切割成合適形狀。為在操作過程中固定該濾器，用塑料環(huán)將其固定。
[0078]實(shí)施例2:從FFPE樣品分離gDNA
[0079]將來(lái)自大鼠肝臟FFPE塊的切片(樣品1:一片切片，樣品2:兩片切片，樣品3:三片切片)和來(lái)自女性人類扁桃體FFPE塊的切片(樣品4:一片切片)置于反應(yīng)管中。各切片厚度為ΙΟμπ?。向所述樣品添加包含十六烷和油可溶性染料的200μ L如共同再審申請(qǐng)10165799.7中所述的蠟溶解試劑，以及作為裂解緩沖液的180 μ L緩沖液ATL (德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))和20 μ L蛋白酶K(德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))。所述樣品通過潤(rùn)旋并在振湯鮮育箱中以1，OOOrpm在56 C下振湯I(xiàn)小時(shí)來(lái)混合。所述樣品在室溫下以20，400xg離心I分鐘。然后，使所述樣品在約90°C孵育I小時(shí)，以去除甲醛誘導(dǎo)的交聯(lián)。上部烴層避免了該步驟中的水相蒸發(fā)。使所述樣品冷卻至室溫并轉(zhuǎn)移至實(shí)施例1的離心柱。然后，以2，OOOxg離心所所述樣品，之后，水相通過所述親水性過濾部件，而包含溶解石蠟和蠟溶解試劑的烴相留在柱中。收集水相，并按照QIAamp FFPE Minelute手冊(cè)，采用該試劑盒中提供的柱來(lái)純化所述水相。樣品用100 μ L ATE緩沖液(德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))從所述Minelute柱洗脫，并在光學(xué)密度(OD)測(cè)量之前另用100 μ L ATE緩沖液稀釋，以測(cè)定所述樣品中存在的gDNA的量。圖4所示結(jié)果顯示,在ATE緩沖液中稀釋的gDNA樣品的常規(guī)光譜。所述樣品中存在的gDNA的量是:
[0080]樣品16.2 μ g gDNA (一片10 μ m FFPE大鼠肝臟組織切片)
[0081 ] 樣品215.8 μ g gDNA (兩片10 μ m FFPE大鼠肝臟組織切片)
[0082]樣品320.4 μ g gDNA (三片IOym FFPE大鼠肝臟組織切片)
[0083]樣品422.8 μ g gDNA ( 一片IOym FFPE人扁桃體組織切片)
[0084]在含有2.5 μ L Gel Red (凝膠紅)的0.8 %瓊脂糖凝膠(50mL)上分析IOyL的各樣品，該凝膠在100V下于Ix TAE緩沖液內(nèi)跑膠40分鐘。采用ATE緩沖液作為空白對(duì)照。結(jié)果示于圖5，顯示分離自FFPE樣品的gDNA的典型凝膠。
[0085]作為對(duì)采用本發(fā) 明方法分離自FFPE樣品的核酸進(jìn)行可能的下游分析的示例，采用市售可得的therascreen? KRAS Pyro?試劑盒(德國(guó)希爾頓的恰根公司(QIAGEN))通過焦磷酸測(cè)序?qū)Λ@自樣品4的gDNA篩選KRAS基因的密碼子12和13中的突變，所述測(cè)序按照生產(chǎn)商的方案如下進(jìn)行:各包含來(lái)自樣品4的IOnggDNA的四個(gè)樣品用靶向密碼子12/13的引物在PCR中擴(kuò)增。使所述擴(kuò)增子固定在鏈霉親和素Sepharose?高效珠上。制備單鏈DNA并進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。
[0086]結(jié)果示于圖6。全部四個(gè)示例顯示無(wú)突變的野生型KRAS密碼子12/13的典型直方圖(還顯示野生型的理論直方圖以供比較)。這進(jìn)一步證明采用本發(fā)明方法可從FFPE樣品獲得高質(zhì)量的DNA，其無(wú)需進(jìn)一步純化即可用于下游分析。
[0087]實(shí)施例3:從水相和含d-檸檬烯的相的混合物回收所述水相
[0088]向300 μ L水性裂解緩沖液(50mM Tris硫酸鹽；50mM十二烷基磺酸鈉，pH8.5)添加200 μ L CitriSolv (德國(guó)施韋特的費(fèi)舍爾科技公司(Fisher Scientific))和200 μ L十六烷(含有油綠作為著色劑)。渦旋該雙相混合物(圖7a)以形成乳液(圖7b)。將所述乳液轉(zhuǎn)移至實(shí)施例1的離心柱(圖7c)。使該柱以1，500xg離心2分鐘，之后所述水相通過所述親水性過濾部件，而包含d-檸檬烯和十六烷的烴相保留在柱中(圖7d)。該實(shí)施例顯示，甚至水相和其它液相的乳液也可通過本發(fā)明方法分離。
[0089]采用親水性聚酰胺濾器(Sartolon Polyamid,孔徑0.2 μ m,來(lái)自德國(guó)哥廷根的賽多利斯公司(Sartorius))獲得相似結(jié)果。
[0090]實(shí)施例4:從所述水相和二甲苯的混合物回收水相
[0091]為了更好地觀察，使用前通過添加少量油綠對(duì)二甲苯染色。使200yL 二甲苯與水性裂解緩沖液(50mMTris硫酸鹽；50mM十二烷基磺酸鈉，pH8.5)混合。將該混合物渦旋直至形成乳液(圖8a)。將所述乳液轉(zhuǎn)移至離心柱上，所述離心柱配備有玻璃料，并且所述膜之一已用于實(shí)施例3，其由乙酸纖維素或聚酰胺制成。然后，將所述柱置于收集管內(nèi)，并在臺(tái)式離心機(jī)內(nèi)以3，OOOxg離心I分鐘。如圖Sb所示，兩種情況下，所述乳液均被破壞并且所述水相與所述有機(jī)相清晰 分開。采用乙酸纖維素膜獲得的結(jié)果示于圖8b的左側(cè)，而采用聚酰胺膜獲得的結(jié)果示于右側(cè)。
【權(quán)利要求】
1.用于從多相混合物回收水相的方法，所述水相包含溶解于其中的生物分子，所述多相混合物包含至少所述水相和與所述水相不混溶且包含至少一種烴類化合物的其它液相，所述方法包括如下步驟:將所述多相混合物進(jìn)料導(dǎo)向過濾部件表面上，其中包含溶解于其中的任何感興趣生物分子的所述水相能透過所述過濾部件，但包含所述至少一種烴類化合物的所述其它液相不能透過所述過濾部件。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述過濾部件包含至少一種親水性過濾材料，所述過濾部件優(yōu)選為以下形式:膜、濾器、玻璃料、薄膜、絨料、有孔的整體塊狀物，或含有親水性過濾材料的粉末、粒子、珠、顆?；蚯蝮w的濾床。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述親水性過濾材料選自下組:乙酸纖維素、聚酰胺、聚醚砜和聚偏二氟乙烯，及其混合物。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，利用重力、壓強(qiáng)、真空、吸力或離心使所述水相通過所述過濾部件。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多相混合物是包含所述水相和與所述水相不混溶的其它液相的二相混合物。
6.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多相混合物通過使蠟包埋的生物學(xué)樣品接觸水性裂解緩沖液并任選地在所述水性裂解緩沖液存在下加熱所述樣品來(lái)獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述多相混合物通過以下方式獲得: 1)使蠟包埋的生物學(xué)樣品接觸含有與水不混溶的至少一種有機(jī)溶劑的蠟溶解試劑； 2)任選地孵育步驟I中所得的混合物； 3)向仍然含有所述蠟溶解試劑的混合物添加水性裂解緩沖液； 4)孵育步驟3中獲得的混合物以獲得所述多相混合物，所述多相混合物包含至少一種有機(jī)相和水相，所述有機(jī)相基本包含溶解的蠟和所述蠟溶解試劑，所述水相包含溶解的生物分子， 其中步驟I和3也能作為一個(gè)合并步驟進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述樣品是石蠟包埋樣品，優(yōu)選是福爾馬林固定的石蠟包埋樣品(FFPE樣品)，并且所述蠟溶解試劑包含至少一種有機(jī)溶劑，優(yōu)選選自下組:直鏈、支鏈和環(huán)狀C6-C16烷烴、烯烴或其混合物，更優(yōu)選地選自下組:直鏈、支鏈和環(huán)狀C6-C16烷烴或其混合物，甚至更優(yōu)選地選自下組=C13-C16烷烴或其混合物，最優(yōu)選地是十四烷、十五烷或十六烷。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，除所述裂解緩沖液之外還向步驟3中的混合物添加蛋白水解劑，或者在步驟3中向樣品添加的裂解緩沖液中已包含蛋白水解劑，所述蛋白水解劑選自下組:蛋白酶和非酶促蛋白水解化合物，優(yōu)選是蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胞內(nèi)蛋白酶Lys-C、溴化氰、重組芽孢桿菌蛋白酶、溶菌酶或其混合物。
10.如權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包含收集通過所述過濾部件后的水相的附加步驟，和檢測(cè)、分析、分離和/或純化來(lái)自所述水相的感興趣生物分子的任選附加步驟，所述生物分子優(yōu)選是核酸。
11.如權(quán)利要求1~10所述的方法，其特征在于，所述分離和/或純化溶解于所述水相的生物分子的步驟通過至少一種色譜法和/或基于固相的方法進(jìn)行，優(yōu)選通過選自下組的方法進(jìn)行:凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、反向色譜法和親和結(jié)合法。
12.親水性過濾材料、包含所述親水性過濾材料的裝置或包含所述裝置的試劑盒用于從與水相不混溶的其它液相回收所述水相的應(yīng)用，所述水相包含溶解于其中的生物分子，優(yōu)選是核酸，所述其它液相包含至少一種烴類化合物，優(yōu)選是溶解于至少一種有機(jī)溶劑的蠟，所述有機(jī)溶劑選自下組:直鏈、支鏈和環(huán)狀C6-C16烷烴、烯烴或其混合物，或優(yōu)選地是溶解于十四烷、十五烷、十六烷或其混合物的石蠟。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裝置包含具有進(jìn)口(6)和出口(7)的中空主體(5)，所述中空主體(5)包含親水性過濾材料(3)，所述親水性過濾材料(3)優(yōu)選由支撐結(jié)構(gòu)(8)支持，所述支撐結(jié)構(gòu)(8)優(yōu)選是玻璃料或篩板形式。
14.如權(quán)利要求12或13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裝置是漏斗、柱體、注射器或多孔塊狀物，優(yōu)選是離心柱。
15.如權(quán)利要求12~14中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包含親水性過濾材料和選自下組的至少一種其它組成部分:所述試劑盒的使用說(shuō)明書、裂解緩沖液、蠟溶解試劑、蛋白水解劑和通過色譜和/或親和結(jié)合來(lái)純化所述感興趣生物分子的固相，所述親水性過濾材料優(yōu)選包含 在如權(quán)利要求13或14所述的裝置中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103998608SQ201280060197
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月6日
【發(fā)明者】約爾格·胡克倫布羅奇, F·納茲 申請(qǐng)人:恰根有限公司