專利名稱：人白細胞介素29成熟肽第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬淖儺愺w及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種人白細胞介素29成熟肽第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬淖儺愺w(hIL-29G)及其制備方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
人白細胞介素29(interleukin29，IL-29)是近年發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，又稱為干擾素入 I (interferon A I，IFN-入 I)，其與 IL-28A 和 IL-28B 同屬 IFN- A 家族(IFN A s)。人IL-29通過與細胞膜上的受體復合物結(jié)合，起始信號的轉(zhuǎn)導和發(fā)揮生物學作用。IL-29的受體是一種異二聚體型II類細胞因子受體，由IL-10受體P亞基(IL-1ORe也稱IL-1OR2)和一種II類孤兒受體鏈(即IL-28Ra)組成，其中IL-1ORe也是IL-10和IL-22受體組成部分，IL-28Ra或IFN- A Rl則決定與IL-29結(jié)合的特異性，并且可能介導細胞內(nèi)的信號傳遞。人IL-29與I型干擾素共享相同的Jak-STAT信號傳導途徑，激活相同的Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcript ion)信號轉(zhuǎn)導途徑，促進一組共同的基因表達。IL-29首先與其受體結(jié)合，啟動信號級聯(lián)反應，經(jīng)過多步磷酸化反應，激活STAT2,導致干擾素-激活基因因子3復合物(IFN-stimulated gene factor3complex,ISGF3)與干擾素激活反應元件(IFN-stimulated response element, ISRE)相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，IL-29表現(xiàn)出一些與I型干擾素相同的性質(zhì)，如抗病毒、抗增殖、體內(nèi)抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學活性。人IL-29主要在上皮細胞中進行表達，在人血液、大腦、肺、胰臟及睪丸中也有低水平的表達。不同起源的造 血和非造血細胞被各種病毒感染后，可誘導表達IL-29，目前已發(fā)現(xiàn)有麻疹病毒、腮腺炎病毒、心肌炎病毒、甲型流感病毒、仙臺病毒、新城雞瘟病毒、單鏈(+) RNA病毒、雙鏈DNA病毒等可誘導感染細胞表達IL-29。IFN是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、第一個克隆化和用于臨床治療疾病的細胞因子。目前，IFN主要用于某些腫瘤和病毒性疾病的治療，但對不同的腫瘤和病毒性疾病的療效差異很大，且常出現(xiàn)一些不良反應。IL-29的功能與I型IFN有一定相似，而且能選擇性地作用于不同類型的靶細胞，它們可作為I型(IFN-a、IFN-P)或II型(IFN-Y) IFN的替代品或輔助品用于某些疾病的治療，在腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及變態(tài)反應性疾病等防治方面具有潛在的應用價值。分子識別是分子間專一性的結(jié)合過程，人們所熟悉的分子識別的三個模型包括抗體與抗原、配體與受體、酶與底物的結(jié)合。本發(fā)明中，以理論設計的IL-29變異體及野生型IL-29作為配體，采用計算機模擬與靶細胞表面的相應受體結(jié)合，預測變異體與受體間的非共價相互作用的結(jié)合自由能，根據(jù)結(jié)合自由能的正負來選擇和確定定點突變位點。通過計算機模擬分析，發(fā)現(xiàn)IL-29成熟肽的35位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼釙r，該變異體與受體相結(jié)合的結(jié)合自由能低于野生型IL-29與受體相結(jié)合的結(jié)合自由能，由此選擇對IL-29成熟肽的第35位氨基酸進行定點突變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種人白細胞介素29成熟肽第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬淖儺愺w(hIL-29G)及其制備方法。(I)本發(fā)明的第一方面，提供一種插入了 hIL-29成熟肽第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬淖儺愺w編碼基因的重組真核表達載體，將本發(fā)明所述的hIL-29變異體編碼基因(SEQ ID No:1)與pPIC9KM(源于Invitrogen公司，經(jīng)本實驗室改造并已申請專利，申請?zhí)枮?201110410391.0)重組獲得所需載體，該重組真核表達載體為pPIC9KM-hIL-29G，如圖1所示；該重組載體表達的產(chǎn)物是肽鏈中第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬膆IL-29變異體(SEQ IDNo:2);而且，本發(fā)明將pPIC9KM的a因子中的限制性內(nèi)切酶Xho I識別位點CTCGAG與蛋白酶Kex2的識別位點GAGAAAAGA (編碼產(chǎn)物為Glu-Lys-Arg)，通過PCR方法引入hIL-29變異體編碼基因(SEQ ID No:1)的氨基端，使該重組真核表達載體表達的hIL_29變異體(SEQID No:2)的肽鏈不會因引入限制性內(nèi)切酶位點而增加額外的氨基酸殘基。(2)本發(fā)明的第二方面，提供一種表達人IL-29變異體的重組酵母工程菌GS115/hIL-29G。將本發(fā)明所述的重組真核表達載體pPIC9KM-hIL-29G轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115 (Invitrogen公 司)中可即可獲得該工程菌，而且pPIC9KM中的信號肽基因序列與hIL-29變異體的編碼基因均已整合到該工程菌的基因組中，因此該工程菌可將hIL-29變異體分泌型表達至培養(yǎng)液中。(3)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備hIL-29變異體肽的方法，該方法包括以下步驟:a)培養(yǎng)上述重組酵母工程菌，于培養(yǎng)液中添加1.5% (v/v)的甲醇作為誘導劑，誘導重組酵母工程菌分泌表達hIL-29變異體；b)離心培養(yǎng)液去除菌體和不溶物，收集培養(yǎng)液上清經(jīng)過超濾濃縮和透析除鹽處理；c)除鹽后的培養(yǎng)上清用強陽離子交換層析柱分離純化培養(yǎng)液中的hIL-29變異體，收集含有hIL-29變異體的洗脫液；d)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鑒定純化的hIL-29變異體。


圖1為重組真核表達質(zhì)粒pPIC9KM-hIL_29G的構(gòu)建圖譜圖2為hIL-29變異體編碼基因的PCR擴增結(jié)果圖3為克隆質(zhì)粒pUCm-hIL_29G的雙酶切鑒定結(jié)果圖4為hIL-29變異體的SDS-PAGE檢測結(jié)果
具體實施例方式以下結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明所涉及到的操作方法，這些實例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的測定均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；所用的培養(yǎng)基如無特別說明均按畢赤酵母表達手冊(Invitrogen公司)的配方進行配制。實例一、人IL-29變異體編碼基因的克隆1.設計和合成PCR引物根據(jù)GenBank中的人IL-29基因序列和pPIC9KM載體的因子信號肽序列以及本發(fā)明中發(fā)生突變的位點，用01igo7軟件設計一對特異性引物及突變引物如下:上游引物:5’ -CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3 ’下游引物:5’-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3，；突變引物:5’-TCTTCCAATGCGTCCITGGCCTTCTTGA-3’在上游引物中加入了限制性內(nèi)切酶Xho I識別位點(CTCGAG)和蛋白酶Kex2的識別位點(GAGAAAAGA，編碼產(chǎn)物為Glu-Lys-Arg)，下游引物中加入了 Not I位點(GCGGCCGC)，為了獲得突變產(chǎn)物，突變引物中第16位堿基設計為T，使該堿基組成的三聯(lián)體密碼由AGG突變?yōu)锳AG，該三聯(lián)體密碼編碼的第35位氨基酸由精氨酸(Arg)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，擴增產(chǎn)物的大小約560bp。2.人IL-29變異體編碼基因的克隆用RNA提取試劑Trizol(BBI公司)按說明書操作，從健康中國人外周血單個核細胞(PBMC)提取細胞總RNA ;取提取的總RNAl u L作為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)按說明書操作，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴增得到IL-29前體的cDNA ;反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取反應液5 y L作為模板，先用上游引物與突變引物進行PCR擴增IL-29變異體的部分編碼基因，反應條件如下:94°C 2min， 94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 15s，30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析；用EZ-1O柱式DNA回收試劑(BBI公司)回收純化約129bp的部分基因片段hIL-29FA;再將純化的部分基因片段作為上游引物與上述下游引物進行PCR擴增，反應條件如下:94V 2min，94°C 30s — 45°C 30s — 72°C lmin，2個循環(huán)，94°C 30s — 55°C 30s — 72°C lmin，28個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。最后將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示；將純化的目的基因片段與克隆載體pUCm-T (BBI公司)相連，構(gòu)建為重組質(zhì)粒并命名為pUCm-29G ;制備大腸桿菌JM109感受態(tài)，將重組質(zhì)粒pUCm-29G轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，然后接種于含IPTG和X_gaL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)16h，挑取陽性菌落接種至液體LB培養(yǎng)基進行擴增，提取重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果如SEQ ID No:1所示。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析并與GenBank中的人IL-29的cDNA序列進行比對，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pUCm-29G中目的基因的第104位堿基經(jīng)人工定點突變后，由G突變?yōu)锳，該堿基組成的三聯(lián)體密碼由AGG突變?yōu)锳AG，該三聯(lián)體密碼編碼的第35位氨基酸由精氨酸(Arg)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，結(jié)果與定點突變設計相符，如SEQ IDNo:2所示。實例二、構(gòu)建含hIL-29變異體編碼基因的重組真核表達載體提取pUCm_29G和載體pPIC9KM(源于Invitrogen公司，經(jīng)本實驗室改造并已申請專利，申請?zhí)枮?201110410391.0)的質(zhì)粒，各取20 ii L質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I進行雙酶切，回收約560bp的目的基因片段和載體pPIC9KM的大片段，用T4DNA連接酶(BBI公司)于16°C水浴連接20h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM109中，然后接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落接種液體LB培養(yǎng)基擴增，提取重組真核表達質(zhì)粒并命名為pPIC9KM-hIL-29G;用Xho I和Not I雙酶切鑒定重組真核表達質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29G，同時進行測序鑒定，測序結(jié)果證實pPIC9KM-hIL-29G中的hIL_29變異體的編碼基因序列與pUCm-29G中的完全一致。實例三、重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GS115及其高拷貝重組工程菌的篩選提取經(jīng)測序鑒定的pPIC9KM-hIL_29G質(zhì)粒，取20ii L用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切使之線性化，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分離純化，回收線性化的pPIC9KM-hIL-29G ;混合線性化的pPIC9KM-hIL-29G與酵母GSl 15感受態(tài)細胞，按照畢赤酵母表達手冊(Invitrogen公司)的方法進行電轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不含His的MD培養(yǎng)板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選MD平板上生長旺盛的優(yōu)勢菌落接種于含0.5mg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選生長旺盛的優(yōu)勢菌落接種于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，如此重復培養(yǎng)并依次增加G418濃度至4mg/mL，從含4mg/mL G418的YPD平板篩選得到高拷貝整合的畢赤酵母重組工程菌 GS115/hIL-29G。實例四、人IL-29變異體的誘導表達、純化及分析將從含4mg/mL G418的YPD平板篩選得到的高拷貝整合的畢赤酵母重組工程菌GS115/hIL-29G接種至事先配好的BMGY培養(yǎng)基中，于30°C、220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)24h ;將培養(yǎng)液室溫3000g離心5min收集細胞，用25mL BMMY重懸細胞，于30°C、220rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)；在轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基后，每隔24h向培養(yǎng)液中添加1.5 %的甲醇進行誘導表達，連續(xù)培養(yǎng)96h。離心收集培養(yǎng)上清，取20 ii L上清進行SDS-PAGE，檢測培養(yǎng)上清中hIL_29變異體的表達情況。接著用羊抗人IL-29多克隆抗體(R&D公司)進行Western blotting,鑒定表達的hIL-29變異體。然后將培養(yǎng)上清先用超濾膜濃縮(截流分子量為IOkDa)，再用SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析純化，純化產(chǎn)物再經(jīng)SDS-PAGE檢測和Westernblotting鑒定。SDS- PAGE結(jié)果顯示重組hIL_29變異體的分子量為23kDa左右，如圖4所
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權(quán)利要求
1.一種人白細胞介素29(hIL-29)成熟肽變異體的重組真核表達載體，其特征在于，所述的重組真核表達載體中插入了人工定點突變的人白細胞介素29變異體的編碼基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達載體中的hIL-29變異體的編碼基因，其DNA的核苷酸序列對應于序列表中的SEQ ID NO:1，該序列第104位堿基G (鳥嘌呤)經(jīng)人工定點突變?yōu)锳 (腺嘌呤)，由該堿基組成的三聯(lián)體密碼AGG突變?yōu)锳AG。
3.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達載體中的hIL-29突變體編碼基因的編碼產(chǎn)物，其氨基酸序列對應于序列表中的SEQ ID NO:2，該序列中第35位氨基酸殘基由精氨酸(Arg)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)。
4.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重組畢赤酵母的染色體中整合有權(quán)利要求I所述的人工定點突變的hIL-29突變體的編碼基因，并且分泌表達hIL-29突變體至培養(yǎng)液中。
5.一種制備人白細胞介素29突變體的方法，其特征在于，包括步驟: (1)用適當?shù)呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌； (2)在培養(yǎng)液中添加適當?shù)?誘導劑，誘導重組畢赤酵母工程菌分泌表達重組白細胞介素29突變體； (3)從培養(yǎng)液中分離純化出重組畢赤酵母分泌表達的hIL-29突變體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(I)所用的培養(yǎng)液為BMGY培養(yǎng)液和BMMY培養(yǎng)液；步驟(2)所用的誘導劑為甲醇，添加甲醇的終濃度為培養(yǎng)液體積的1.5% ;步驟(3)所用的分離純化hIL-29突變體的方法為用強陽離子型SP離子交換層析分離培養(yǎng)液中的hIL-29突變體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人白細胞介素29成熟肽第35位精氨酸定點突變?yōu)橘嚢彼岬淖儺愺w(hIL-29G)及其制備方法，屬于生物工程領域。本發(fā)明的具體制備方法包括以下步驟1)人工設計合成hIL-29成熟肽的上下游引物和定點突變引物；2)用上下游引物從hIL-29的cDNA擴增hIL-29成熟肽編碼基因，再用突變引物對第104位堿基進行定點突變；3)構(gòu)建含hIL-29變異體編碼基因的重組真核表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組酵母工程菌；4)培養(yǎng)重組酵母工程菌，于培養(yǎng)液添加1.5％(v/v)甲醇誘導其表達hIL-29變異體；5)采用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析從培養(yǎng)液上清純化hIL-29變異體。本發(fā)明構(gòu)建的酵母工程菌可進行高密度培養(yǎng)并分泌表達第35位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬膆IL-29突變體，適用于工業(yè)化制備人白細胞介素29成熟肽突變體。
文檔編號C12N1/19GK103224951SQ20131002821
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者陳偉, 葛春蕾, 鄭海軍, 陸源, 朱榮, 鄔敏辰, 吳靜 申請人:江南大學