一種廣譜高效抗微生物肽Pb-CATH-OH1及其基因、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種來源于緬甸癖蛇（Python molurus bivittatus)的 cathelicidin 家族廣譜抗微生物肽Pb-CATH-OH1及其編碼基因，氨基酸序列和其在化妝品、保健品、食 品、飼料等日化添加劑及抗感染醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] Cathelicidin是一類由N端信號肽區(qū)域、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特 異的成熟肽區(qū)域構(gòu)成的具有多功能的宿主抗菌肽家族，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：具有N端信號肽區(qū)域 (30個(gè)殘基左右）、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域（99-114個(gè)殘基）和C端高度特異的成熟肽 區(qū)域（12-100個(gè)殘基）。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，能快速、廣譜地殺滅多種病原 微生物，包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲和病毒等，特別是對許多臨床耐藥細(xì) 菌同樣具有作用，這引起了人們的注意。除此之外，cathelicidin還具有許多其他生物學(xué) 活性，如對多種免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞）具有趨化作用、誘導(dǎo) 肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異 細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等。這些優(yōu)勢使其在臨床的應(yīng)用有著良好的前景。
[0003] 近年來由于抗生素的濫用，各種耐藥及超級耐藥菌層出不窮，對臨床的抗感染治 療造成巨大威脅，因此新型抗病原微生物模板的研發(fā)迫在眉睫。Cathelicidins對許多臨床 耐藥細(xì)菌有著很強(qiáng)的殺菌活性，對許多致病菌殺害作用的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)抗生素的作 用，體外抗微生物測試中，大多數(shù)Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下 快速殺死廣泛的微生物。最重要的是由于其特別的殺菌機(jī)制，不會(huì)引起耐藥性。目前發(fā)現(xiàn) 的Cathelicidins的殺菌機(jī)制有很多，常見的是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性介導(dǎo)的即通 過靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜 的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。此外，抗菌肽還具有其他 的殺菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制 細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin 介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
[0004] 關(guān)于抗菌肽藥物，目前cathelicidin的研宄熱點(diǎn)主要集中在消炎、抗感染和抗真 菌等方面，應(yīng)用方式可以是局部的也可以是系統(tǒng)的，劑型可以是口服也可以外用。尤其由于 陽離子抗菌肽的表達(dá)與皮炎、侵入性燒傷膿血癥、腫瘤病毒引起的肉贅等之間的病理聯(lián)系， 這些抗菌肽對這些疾病的局部治療有較好的開發(fā)前景。目前有部分抗菌肽藥物已進(jìn)入臨床 試驗(yàn)階段，例如Pexiganan是爪蟾抗菌肽Magainin的類似物，目前已作為治療足部感染藥 物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，它也是第一個(gè)進(jìn)行商業(yè)開發(fā)的抗菌肽；Hlfl-11是人乳鐵蛋白前11 個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽，通過I / II期臨床試驗(yàn)研宄表明Hlfl-1通過靜脈給藥時(shí)是 安全的、耐受性良好的；來源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進(jìn)入 臨床III期試驗(yàn)等。Cathelicidin的應(yīng)用不僅限于醫(yī)藥領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和日化用品領(lǐng) 域，cathelicidin也存在巨大的應(yīng)用潛能。
[0005] 2002年，世界衛(wèi)生組織（W H 0)發(fā)表公告指出"在牲畜養(yǎng)殖過程中，停止以往慣用 的飼料添加劑抗生素的做法，將在不危害動(dòng)物和農(nóng)民利益的前提下，可減少對人類健康的 威脅?？股刈鳛轱暳咸砑觿?yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，對畜牧業(yè)的發(fā)展起了重要的作用，但是其 在動(dòng)物體內(nèi)和動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留，以及病原菌產(chǎn)生的抗藥性問題，對人類的健康和環(huán)境產(chǎn) 生了負(fù)面的影響。并且完全使我國出口肉類，海產(chǎn)品等受到了限制，從而影響收益。尋找新 型、安全的抗菌劑代替抗生素，已成為當(dāng)前國內(nèi)外飼料學(xué)科的一項(xiàng)重要內(nèi)容?？咕木哂袕V 譜的抗菌作用，對畜禽具有促生長和治療疾病的功能，是無毒、無害、無殘留的綠色產(chǎn)品，有 望成為抗生素的替代品，在畜牧生產(chǎn)上發(fā)揮重要的作用。目前在畜禽生產(chǎn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖等均有 應(yīng)有。
[0006] 緬甸癖蛇（Python molurus bivittatus)，是蛇亞目癖科癖屬印度癖的亞種之一， 以體型巨大著稱，平均身長至高可達(dá)7米，體重可達(dá)91公斤，也是世界上最巨型的六種蛇類 之一。緬甸蟒屬于東南亞地區(qū)的本土品種，是一種夜行性蛇類，多居于熱帶森林里，在中國 多見于廣東、廣西、福建、云南、海南、貴州等地。目前關(guān)于緬甸癖蛇cathelicidin宿主防御 肽的研宄和應(yīng)用還沒有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種在亞微摩爾劑量下即具有很強(qiáng)的抗微生物活性的來源于緬甸 蟒蛇的一種抗微生物肽，Pb-CATH-OH1及其基因、氨基酸序列和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是 基于上述理論研宄和現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種具有強(qiáng)抗菌活性的緬甸蟒蛇抗微生物肽 Pb-CATH-OH1及其應(yīng)用，著重醫(yī)藥制備，化妝品、保健品、食品和新型飼料添加劑等中的應(yīng) 用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0009] Pb-CATH-OH1是緬甸蟒蛇cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，含有31個(gè)氨基 酸殘基，分子量是3800. 82Da，理論等電點(diǎn)（pi)為12. 33, 一種堿性多肽（含有13個(gè)堿性氨 基酸殘基）。
[0010] 緬甸蟒蛇抗菌肽Pb-CATH-OH1基因的克隆包括：
[0011] 緬甸蟒蛇肺總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì) 引物，利用PCR方法篩選緬甸蟒蛇抗菌肽Pb-CATH-OH1基因。5'端引物分別為 P1(5,-ATGATGGAAGGGTGCTTCTGG-3'）和 P2 (5,-GCTGAACTTCACCATCAAAGAGAC-3'），PCR 另 一擴(kuò)增引物為 CL0NTECH 公司 Creator? SMART ? cDNA Library Construction Kit 中的 3'PCR Primer 引物，其序列為 5' -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3'。獲得陽性單克 隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定?；驕y序結(jié)果表明編碼緬甸蟒蛇抗菌肽Pb-CATH-OH1前體 cathelicidin的基因由528個(gè)核苷酸組成，自5'端至3'端序列為：
[0012] 1 a.tgatggaa.g ggtgcttctg gaggatcttg ctggtggctg gggctctttc igcctctggg 61 gctgccgcac tgccacacag accactgacc tatgaggagg ctgtggcttt t.ggtgtggaa 121 ctctacaaca agaaagcagg ggaggactcc cgatataggc tactggaggc tgtccctcag 181 cctga.ttggg atccca.cttc tgagfcigcatc caagagctga ac11caccat ca.aagagacg 241 gtgtgcctgg tccaagaaga acgtgccgag gatgaatgcg acttcaaaga cgacgggctg $01 gtcaaagaat gctccggcta. ctatttcttt gacgagacgc caccagtggc agttctcact 361 tgtgtmacf二g tggggggt腿 tgaggaggag acggaagagg fci牌 421 cccaaacgtg tgaagagatt caagaaattc ttccggaaga tcaagaaagg gtttcgcaaa 481 atcttcaaga aaacgaagat tttcattggt ggcaccattc ccatctaa
[0013] 編碼緬甸蟒蛇成熟肽Pb-CATH-OHl的為433位到525位的核苷酸序列，其編碼的 氛基酸序列為 iLysLArgS-PheS-LysA-LysS-Phee-PheLArgS-Lysg-IleW-Lysn-LysU-Gly13-?]! e 14-Arg15-Lys16-Ile17-Phe 18-Lys19-Lys20-Thr21-Lys 22-Ile23-Phe24-Ile25-Gly 26-Gly27-Thr28-I le29-Pro 30-Ile31〇
[0014] 緬甸蟒蛇抗菌肽Pb-CATH-OHl基因作為基因工程制備緬甸蟒蛇抗菌肽 Pb-CATH-OHl 的應(yīng)用。
[0015] Pb-CATH-OHl的化學(xué)制備方法：
[0016] 根據(jù)編碼緬甸蟒蛇cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽Pb-CATH-OHl 氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀（433A, Applied Biosystems)合成其全序列。通過HPLC 反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于97%。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-T0F)測定其分子量，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測序儀測定氨基酸序 列結(jié)構(gòu)。合成的Pb-CATH-OH1抗菌肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0018] 基因克隆得到編碼緬甸蟒蛇cathelicidin抗微生物肽的基因，通過化學(xué)合成方 法得到成熟肽Pb-CATH-OH1。該抗微生物肽富含堿性氨基酸，具有很強(qiáng)的抗菌活性，抗菌實(shí) 驗(yàn)顯示其對多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。另外，其還具有很低細(xì)胞毒性，無溶血活 性，結(jié)構(gòu)簡