專利名稱：一種珊瑚球菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一株珊瑚球菌及其在病原真菌防治方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國乃至世界部分產(chǎn)區(qū)的主要糧食作物，水稻稻曲病是我國主要稻作區(qū)水稻生產(chǎn)后期普遍發(fā)生的一種真菌性病害，該病主要危害穗部，減產(chǎn)嚴(yán)重的達(dá)到10%-20%，給廣大稻產(chǎn)區(qū)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，由于氣候條件的變化以及不合理的施肥和耕作，導(dǎo)致稻曲病危害日益嚴(yán)重。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，大部分省區(qū)都有種植。據(jù)報道，全世界有棉花病害120多種，我國已發(fā)現(xiàn)了 40余種，其中嚴(yán)重危害的有15種。苗期發(fā)生較重的是立枯病、疫病和炭疽??；成株期危害較重的是黃萎病和枯萎病；鈴期危害較重的是疫病、紅粉病、紅腐病和炭疽病等，這些病害常常給棉花生產(chǎn)造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。黃瓜，又名胡瓜，屬葫蘆科甜瓜屬中幼果具刺的栽培種，一年生攀緣性草本植物，全國各地均有栽培。黃瓜枯萎病一般在結(jié)果期才表現(xiàn)癥狀，即植株下部葉片葉肉部分出現(xiàn)黃色斑痕，葉脈仍保持綠色，再由下向上逐漸萎蔫，后期整葉變黃。切開病株莖桿可見維管束呈褐色，導(dǎo)致植株死亡。盡管輪作的栽培方式可以有效降低發(fā)病程度，但是不能根本上解決病害，化學(xué)農(nóng)藥雖然能根本去除病害，但是也給環(huán)境帶來巨大的污染和破壞，同時通過生物鏈富集也會對人體健康造成威脅。因此，通過尋求新型的防病、治病手段，達(dá)到有效的控制病原菌病害，已成為生產(chǎn)實踐中迫切需要解決的課題。基于生物防治的高效、安全、環(huán)保等優(yōu)點以及人們對糧食以及生食蔬菜的需求，采取生物防治法已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點問題。粘細(xì)菌是一類具有復(fù) 雜的多細(xì)胞行為和形態(tài)的原核生物，屬于革蘭氏陰性菌，在固體表面能夠滑行運動，并廣泛存在于土壤以及食草動物糞便之中，其復(fù)雜的生活周期，近年來已成為科研工作者研究菌株生理遺傳的模式型菌株。粘細(xì)菌作為一種高等的原核生物，因其菌株的特異性和特殊的次級代謝產(chǎn)物及其酶類，越來越受到研究者的青睞。這些豐富的次級代謝產(chǎn)物之中包括種類繁多的抗真菌活性物質(zhì)以及高活性酶類，目前從粘細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有活性的物質(zhì)大約近400中，占微生物來源總數(shù)的4%左右。近年來，以粘細(xì)菌作為目的菌株的研究已經(jīng)涉及到分子生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，生物技術(shù)以及生物活性物質(zhì)等多個領(lǐng)域。堆囊菌屬和珊瑚狀珊瑚球菌屬作為粘細(xì)菌眾多屬之中的兩大類，被篩選出來的菌株越來越多，其中堆囊菌株研究的更為廣泛，而珊瑚狀珊瑚球菌，因其很難篩選與培養(yǎng)，目前篩選出來并研究的模式菌株少之又少。目前重要糧食作物病蟲害日益嚴(yán)重，依靠農(nóng)藥防治在防治病蟲害的同時，也帶來了新的環(huán)境污染，因此迫切的需要發(fā)現(xiàn)具有高效、綠色無污染的生物防治手段
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一株新的具有生物防治功能的微生物菌株。本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):一株珊瑚球菌EGB(Corallococcus coralloides EGB),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCCNO:M2012528o該珊瑚球菌EGB通過如下方法篩選純化得到:1.首先選擇合適的土樣采集地點，采用合適的采集方法采集土樣，然后進(jìn)行自然風(fēng)干。因為兔糞是粘細(xì)菌的天然基質(zhì)，并且為了使篩選過程有目的性，后續(xù)的粘細(xì)菌純化方法采用糞粒誘導(dǎo)平板法和酵母誘導(dǎo)平板法兩種方法，并將兔糞上是否有子實體產(chǎn)生作為篩選的標(biāo)記。2.將出現(xiàn)的子實體接種到Y(jié)WCX固體培養(yǎng)基，反復(fù)畫線純化，并最終接種到CAS培養(yǎng)基中，通過濁度的變化情況觀察所篩選出來的菌株的純度。3.通過生理生化分析與16SrDNA分析，結(jié)果與已報道菌株比較，綜合分析該菌株的發(fā)育類型。4.采用合適的方法對篩選到的菌株進(jìn)行保存。本發(fā)明所述的珊瑚球菌EGB在制備防治棉花枯萎病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的珊瑚球菌EGB在制備防治黃瓜黃枯萎病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的珊瑚球菌EGB在制備防治水稻稻曲病的藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明采用兔糞子實體誘導(dǎo)法成功的從所采集的土樣中篩選到一株粘細(xì)菌菌株，經(jīng)鑒定為珊瑚球菌，該菌在生長過程中能夠抑制多種植物病原真菌的生長，其發(fā)酵上清能夠很好的裂解多種病原菌的菌絲體，具有較好的實際應(yīng)用價值，可應(yīng)用于制備防治花枯萎病、黃瓜黃枯萎病及水稻稻曲病的藥物。


圖1菌株純化流程2發(fā)酵上清液對酵母細(xì)胞的裂解TEM圖(1.0 y m)左圖為去離子水處理酵母細(xì)胞，右圖為發(fā)酵上清液處理酵母細(xì)胞。圖3菌株的特性圖片A圖為EGB單菌光鏡圖(100 X )，B圖為EGB單菌TEM圖(500nm)，C圖為EGB菌落光鏡圖(10X)。圖4基于16S rDNA的菌株EGB系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖5菌株生長過程中對植物病原真菌的生長抑制圖。A棉花枯萎病菌；B黃瓜黃枯萎病菌；C水稻稻曲病菌。每幅附圖中左邊的照片為處理組，右邊的照片為對照組。圖6發(fā)酵上清液對菌絲體的裂解圖

A:上清液處理水稻稻曲病原菌菌絲，B:上清液處理黃瓜枯萎病原菌菌絲，C:上清液處理棉花枯萎病原菌菌絲。每幅附圖中左邊的照片為對照組，右邊的照片為處理組。生物材料保藏信息Corallococcus coralloides EGB,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCC NO:M2012528。
具體實施例方式實施例1.菌株的分離純化1.1樣品采集后室溫下自然風(fēng)干(減少霉菌及雜菌的污染)。從山東東營采集土樣室溫下自然風(fēng)干。1.2粘細(xì)菌子實體的誘導(dǎo)1.2.1糞粒誘導(dǎo)平板法:將風(fēng)干的土樣盛大約20克于培養(yǎng)皿內(nèi)，在土樣表面半埋A 3-4個滅過菌的兔糞，加入25 u g/mL乙醚滅菌的放線菌酮(25mg/ml)或多菌靈(30mg/L)，浸泡6h后，倒去殘液，30°C保溫培養(yǎng)，48h后開始觀察糞球上子實體的形成。1.2.2酵母誘導(dǎo)平板法:以WCX (青霉素青霉素終濃度100mg/L)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，倒入無菌平板，在培養(yǎng)基表面用酵母劃十字線，在十字線中心放少量土樣，28°C恒溫培養(yǎng)，72h后開始觀察子實體的形成。1.3兔糞子實體的形成1.3.1粘細(xì)菌的分離純化①用毛細(xì)管尖端挑取1. 2.1誘導(dǎo)出的子實體，接種于YWCX (WCX培養(yǎng)基:
0.l%CaCl2 2H20 ；1.5%Agar ；25 u g/ml放線菌酮溶液；0.1%的結(jié)晶紫；pH值7.2)培養(yǎng)基上(用滅菌酵母交叉劃線)，30°C培養(yǎng)。②如發(fā)現(xiàn)蠕蟲，將初步分離純化的菌落接種于VY/4 (安琪酵母0.5%，CaCl2 2H200.1%，維生素B120.5 u g/mL,瓊脂粉1.5%，0.1%的結(jié)晶紫；pH7.2 ；)斜面培養(yǎng)基上，置-80°C冰箱冷凍48h，取出后立即再采用YWCX培養(yǎng)基反復(fù)轉(zhuǎn)接法，直至得到純菌株。③用毛細(xì)管尖端及時挑取疑似菌落邊緣的細(xì)菌，反復(fù)轉(zhuǎn)接于含VY/4培養(yǎng)基的平板，30°C恒溫保濕培養(yǎng)。如發(fā)現(xiàn)蠕蟲，將初步分離純化的菌落接種于VY/4斜面培養(yǎng)基上置-80°C冰箱冷凍48h。1.4CAS培養(yǎng)基驗證純度將純化后的粘細(xì)菌EGB 接種于 CAS 培養(yǎng)基(Casitonel%, MgSO4.7H200.1%, pH7.2)中，30°C振蕩培養(yǎng)2d后培養(yǎng)液澄清即表明該粘細(xì)菌為純菌株。1.5菌種菌株的功能驗證與菌種保藏1.5.1將純化的菌株EGB接種到VY/4固體平板培養(yǎng)基上，查看透明圈的形成情況。1.5.2采用食草兔糞真空干燥保藏法。將純化的菌種接種到經(jīng)高溫滅菌消毒的食草兔糞，30°C培養(yǎng)5 - 8d，當(dāng)子實體出現(xiàn)的時候，將長有子實體的兔糞放入到真空干燥器中保存。1.6菌株發(fā)酵上清液的制備及其對酵母細(xì)胞的裂解將菌株EGB (CCTCC NO:M2012528)接種到VY/4液體培養(yǎng)基(安琪酵母0.5%，CaCl2 *2H200.l%pH7.0)中，30°C培養(yǎng)3-4天，6000rpm離心20min，收集上清液?；钚园茬鹘湍讣?xì)胞經(jīng)過熱處理之后，用制備的發(fā)酵上清液50°C處理2h，并以去離子水處理作為對照。之后通過透射電鏡觀察酵母細(xì)胞的變化情況(圖2)。實施例2.菌株的鑒定2.1形態(tài)學(xué)特征(圖3)分離篩選得到的粘細(xì)菌EGB經(jīng)革蘭氏染色顯示陰性，通過結(jié)晶紫染色在100X油鏡下觀察該菌株單菌的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該菌株單菌呈桿狀，無鞭毛，兩端呈透明狀，透射電鏡下觀察單菌周圍有一層粘液層；通過光鏡IOX觀察發(fā)現(xiàn)該菌株在生長的過程具有群體效應(yīng)，生長后期單菌聚集在一起形成子實體。2.2 鑒定通過對該菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增，得到該菌的16S rDNA基因序列，登錄NCBI (www.ncb1.nlm.nih.govPblastP),將所得測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中已知序列利用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲取與實驗菌株相似的典型菌株的16SrDNA序列。進(jìn)一步將該菌株與同源性較高的23個菌株的16S rDNA進(jìn)行序列比對，利用ClustalX(Versionl.83)和MEGA4.1軟件進(jìn)行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，用Neighbor-Join法得到系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，結(jié)果顯示，該菌株與珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides strainDSM 51548)的16S rDNA喊基序列相似性達(dá)100%,即將所分離到的菌株鑒定為珊瑚球菌(Corallococcus coralloides)(圖4)。將該菌株送交位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCCNO:M2012528o實施例3.菌株(Corallococcus sp.EGB)對幾種植物病原真菌抗性的研究3.1選取一種合適的培養(yǎng)基(安琪酵母0.5%，CaCl2 2H200.1%，馬鈴薯30%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%)使菌株EGB (CCTCC NO:M2012528)和幾種植物病原真菌:棉花枯萎病菌、黃瓜黃枯萎病菌及水稻稻曲病菌都能夠在其上生長，并且營養(yǎng)成分不相互干擾。首先挑取幾種植物病原真菌菌絲至平板中央，待病原菌長出健壯菌絲后，在其兩側(cè)接上所分離到的粘細(xì)菌EGB (CCTCC NO:M2012528)，30°C培養(yǎng)4_7天，發(fā)現(xiàn)所選取的幾種植物病原菌周邊菌絲逐漸枯萎，生長明顯受到抑制(圖5)。3.2將菌株EGB (CCTCC NO:M2012528)接種到VY/4液體培養(yǎng)基(安琪酵母0.5%,CaCl2 2H200.l%pH7.0)中，30°C培養(yǎng) 3-4 天，6000rpm 離心 20min，收集上清液，備用。3.3挑取棉花枯萎病菌、黃瓜黃枯萎病菌及水稻稻曲病菌的健壯菌絲，用3.2中制備的發(fā)酵上清液30°C 處理l_2h，并以去離子水處理作為對照。之后用棉蘭染色法對菌絲進(jìn)行染色，相比于對照組，處理組中的幾種植物病原菌的菌絲體著色明顯下降，說明菌株的發(fā)酵上清液對幾種植物病原菌的菌絲結(jié)構(gòu)造成了破壞，使在棉蘭染色之后棉蘭無法著色(圖6)。
權(quán)利要求
1.一株珊瑚球菌EGB (Corallococcus coralloides EGB),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCCNO:M2012528o
2.權(quán)利要求1所述的珊瑚球菌EGB在制備防治棉花枯萎病的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的珊瑚球菌EGB在制備防治黃瓜黃枯萎病的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要 求1所述的珊瑚球菌EGB在制備防治水稻稻曲病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種珊瑚球菌及其應(yīng)用。一株珊瑚球菌(Corallococcus coralloides)EGB，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年12月17日，保藏號為CCTCC NOM2012528。該菌在生長的過程中對以水稻稻曲病、棉花枯萎病以及黃瓜黃枯枯萎病植物病原真菌的生長具有良好的抑制作用，該菌株的發(fā)酵上清液對這幾種病原真菌的菌絲具有明顯的裂解作用。同時該菌株所產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物也是潛在的研究價值所在。
文檔編號C12R1/01GK103103152SQ201310028459
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者崔中利, 李周坤, 黃彥 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)