生物法制備高純度l-叔亮氨酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物合成法制備L-叔亮氨酸的方法。該方法是將表達亮氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因大腸桿菌種子液接入自誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到粗菌體，加入緩沖溶液得到細胞懸浮液。然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸銨進行生物催化反應(yīng)，獲得L-叔亮氨酸轉(zhuǎn)化液。轉(zhuǎn)化液離心，調(diào)節(jié)溶液pH，柱層析，解析，濃縮得到高純度L-叔亮氨酸產(chǎn)品。本發(fā)明充分利用酶的高效性、專一性和溫和性，與傳統(tǒng)化學(xué)合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小等特點。
【專利說明】生物法制備高純度L-叔亮氨酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物合成法制備L-叔亮氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-叔亮氨酸是制備是生產(chǎn)阿扎那韋(抗HIV藥物)、波普瑞韋(Boc印revir)(抗丙肝病毒藥物)、特拉匹韋 (Telaprevir)(抗丙肝病毒藥物)等抗病毒藥物中間體，同時由于叔丁基的空間位阻大，叔亮氨酸又作為金屬的手性配體應(yīng)用于不對稱合成。
[0003]目前L-叔亮氨酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成法又主要有化學(xué)合成、化學(xué)拆分和手性合成三種方法。1993年，U.Groth等以2，5-二乙基吡嗪為原料(Liebigs Ann.Chem.1993，715-719)，經(jīng)叔丁基化、水解合成叔亮氨酸乙酯，收率70%。由于所用試劑三乙基氧鎗四氟硼酸鹽、N-氯代琥珀酰亞胺和叔丁基鋰價格昂貴，因此成本高；另外，工業(yè)化規(guī)模制備易產(chǎn)生有害氧化物。1994年，Clive等以特戊醛為原料(Tetrahedron Lett.1994，35:2459~2462)，首先利用Wittig反應(yīng)，經(jīng)過加成，取代，水解，氫化，得到消旋的叔亮氨酸，總收率僅為25%。中國專利CN200710044378報道了消旋叔亮酰胺與光學(xué)純酸性拆分劑(如扁桃酸、對甲基二苯甲酰酒石酸等)在拆分溶劑中反應(yīng)成鹽析出，再經(jīng)酸水解得L-叔亮氨酸。美國專利US201224537(2012年)報道了利用D_(+)_ 二苯甲酰酒石酸與L-叔亮氨酸具有選擇性沉淀反應(yīng)生成D- (+) - 二苯甲酰酒石酸-L-叔亮氨酸沉淀，經(jīng)過濾、水解該沉淀物即可得到L-叔亮氨酸。選擇性拆分D，L-叔亮氨酸，分別得到純度到D-和L-叔亮氨酸。1992年，Ogura等以(R) _苯甘氨醇為手性誘導(dǎo)劑(Bull.Chem.Soc.Jpn, 1992，69，2359-2365)與特戊醛發(fā)生不對稱Strecker反應(yīng)，引入手性中心，不對稱合成了(S)-叔亮氨酸，總收率達56%，e.e值達100%。
[0004]在生物合成法中，專利EP0141223(1985)等發(fā)現(xiàn)用固定在苯酚樹脂上的青霉素G?；?PGA)可選擇性水解N-苯乙酰_(R，S)-叔亮氨酸生成(S)-叔亮氨酸。去除酶后，將溶液酸化到PH3，再濃縮除去苯乙酸和N-苯乙酰-(R)-叔亮氨酸后，用乙醇和水萃取得到
[5]-叔亮氨酸，收率達96%。專利DE9529211.1報道了利用(RS)-5-叔丁基海因為底物，經(jīng)(R)-海因酶作用開環(huán)生成中間體N-氨甲酰-(R)-叔亮氨酸，最后在硝酸溶液(pHO)作用下脫去氨甲酰，生成R-叔亮氨酸，收率達85.5%,e.e99.5%。專利US6949658報道了消旋的叔亮氨酰胺，在水為溶劑、堿性條件下，經(jīng)腸道菌酶拆分得到(S)-叔亮氨酸和(R)-叔亮氨酰胺，濃縮母液，向其加入適量有機溶劑(異丙醇或DMF)，攪拌冷卻，不需分離即可直接得到結(jié)晶的(S)-叔亮氨酸，可達到92%的收率。黎舒婷等利用可以產(chǎn)生亮氨酸脫氫酶(LeuDH)的重組大腸桿菌作為催化劑(藥物生物技術(shù)，2009，16(3):202~206)，將底物三甲基丙酮酸轉(zhuǎn)化為(S)-叔亮氨酸，并且在轉(zhuǎn)化體系中加入可以產(chǎn)生甲酸脫氫酶(NAD+)的重組大腸桿菌，把這兩種菌混合后進行全細胞轉(zhuǎn)化，通過分批加入底物的方法，最終產(chǎn)物(S)-叔亮氨酸濃度為42mg/mL(42g/L)，轉(zhuǎn)化率為82%。專利CN1934264A公開了德國Degussa公司利用亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶全細胞得到(S)-叔亮氨酸，e.e.值為99%。該工藝初始底物濃度低于500mM(約65g/L)，總濃度為1.0M(130.lg/L)，加入外部輔因子的總量少于0.0OOl底物當量，轉(zhuǎn)化率為96%。專利CN102352387A公開了尚科生物利用固定化全細胞催化劑制備非天然氨基酸的方法，該細胞為重組細胞，重組細胞中含有甲酸脫氫酶基因和亮氨酸脫氫酶基因。產(chǎn)物后處理采用溶劑萃取和重結(jié)晶的方法。
[0005]本發(fā)明利用高表達亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的大腸桿菌，以三甲基丙酮酸為底物，一步轉(zhuǎn)化得到L-叔亮氨酸。采用自誘導(dǎo)系統(tǒng)高密度培養(yǎng)發(fā)酵工藝，通過連續(xù)流加底物三甲基丙酮酸方法，使底物濃度大于130g/L，轉(zhuǎn)化率達到90%以上。轉(zhuǎn)化液經(jīng)過交換樹脂柱層析和重結(jié)晶，產(chǎn)品純度大于99%。該方法選擇性高、純度高、條件溫和、成本低和污染小，具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種生物合成法制備高純度L-叔亮氨酸的方法。
[0007]本發(fā)明所提供的制備L-叔亮氨酸的方法，是將大腸桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得到粗菌體，加入緩沖溶液得到菌體液。然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸銨進行生物催化反應(yīng)，獲得L-叔亮氨酸轉(zhuǎn)化液。離心，調(diào)節(jié)溶液pH，柱層析，解析，濃縮得到高
純度產(chǎn)品。
[0008]本發(fā)明所提供的生物合成法制備高純度L-叔亮氨酸，包括以下步驟:
[0009](I)分別構(gòu)建含有亮氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因的大腸桿菌重組細胞。分子生物學(xué)操作方法按照文獻 Organic Process Research & Development, 2006,10,666-669。
[0010](2)基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)。大腸桿菌發(fā)酵一般使用IPTG誘導(dǎo)表達系統(tǒng)大量表達目的蛋白，但是IPTG價格昂貴，且IPTG誘導(dǎo)蛋白表達在操作上比較繁瑣，特別是過量加入抑制菌體生長，發(fā)酵過程中易出現(xiàn)有毒蛋白表達、質(zhì)粒不穩(wěn)定等問題，這些嚴重阻礙了規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明采用外源基因自誘導(dǎo)表達方法，在培養(yǎng)基中添加一定量的葡萄糖，使大腸桿菌首先以葡萄糖為碳源支持生長至飽和，葡萄糖消耗完之后，培養(yǎng)基中添加的乳糖開始起作用，誘導(dǎo)蛋白表達的同時，乳糖的代謝產(chǎn)物葡萄糖也可繼續(xù)作為細菌生長的碳源。因為過多量的葡萄糖會抑制后期乳糖對蛋白表達的誘導(dǎo)作用，所以在培養(yǎng)基中用0.5%的甘油代替葡萄糖給細菌提供碳源和能源，再另外添加0.05%葡萄糖和0.2%乳糖。此外，100 μ M FeCl3對菌體的高密度生長和蛋白的高量表達起到支持作用。
[0011](3)重組細胞懸浮液的制備:發(fā)酵液離心得粗菌體，用ΡΗ6.0-7.0磷酸緩沖液洗滌和懸浮，獲得細胞懸浮液。
[0012](4)生物合成反應(yīng):將上述兩種重組細胞懸浮液按比例混合，直接加入部分的底物三甲基丙酮酸-氨水反應(yīng)液和甲酸銨，置于30°C水浴鍋中攪拌反應(yīng)24-48h。離心，獲得含有L-叔亮氨酸的溶液，溶液經(jīng)HPLC檢測，三甲基丙酮酸的轉(zhuǎn)化率達90%以上。
[0013](5)產(chǎn)物的后期純化:將上述轉(zhuǎn)化溶液pH值調(diào)節(jié)至5-8，然后上樣于層析柱中，依次用水溶液和氨水 溶液進行洗脫，收集含產(chǎn)品的洗脫液。濃縮，結(jié)晶，既得產(chǎn)品。
[0014]其中，所述自誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量份的物質(zhì)組成:0.5-1.5%胰蛋白胨，0.1-1.0 % 酵母浸出物，10-50mM Na2HPO4,10_50mM KH2PO4, 20-1OOmM NH4Cl, 1-1OmMNa2SO4,1-1OmM MgSO4,0.1-1.0 % 甘油，0.01-0.1 % 葡萄糖，0.1-0.5 % 乳糖，50-120 μ MFeCl3O[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-42°C，優(yōu)選為37-40°C;攪拌轉(zhuǎn)速為120-250轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選150-200轉(zhuǎn)/分鐘；pH值為6.0-7.5，優(yōu)選6.5-7.0 ;發(fā)酵時間為12-24小時。
[0016]所述重組細胞懸浮液的制備方法為:發(fā)酵液離心得粗菌體，用PH6.0-7.0磷酸緩沖液洗滌和懸浮，獲得細胞懸浮液。。
[0017]所述細胞懸浮液中菌體的質(zhì)量百分含量為1% -20%，優(yōu)選為15%。
[0018]所述底物中，三甲基丙酮酸初始加入濃度為60_80g/L，甲酸銨加入終濃度為100-130g/L。剩余的三甲基丙酮酸在反應(yīng)時間內(nèi)連續(xù)流加完畢。
[0019]所述生物合成反應(yīng) 條件是，反應(yīng)溫度25-35°C，pH值為8.5-9.5，反應(yīng)時間24_48h，離心，獲得含有L-叔亮氨酸的溶液，溶液經(jīng)HPLC檢測，三甲基丙酮酸的轉(zhuǎn)化率達90 %以上。
[0020]所述調(diào)節(jié)溶液pH是將pH值用稀鹽酸調(diào)節(jié)至5-8，然后上樣于所述層析柱中，依次用水溶液和氨水溶液進行洗脫，收集含產(chǎn)品的洗脫液。濃縮，結(jié)晶，既得產(chǎn)品。
[0021]所述層析柱中的介質(zhì)為離子交換樹脂。所述離子交換樹脂優(yōu)選為強酸性陽離子型樹脂。
[0022]本發(fā)明是生物合成法制備L-叔亮氨酸，充分利用酶的高效性、專一性和溫和性，與傳統(tǒng)化學(xué)合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小等特點。
[0023]本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化法制備L-叔亮氨酸，所用菌株為高表達亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的重組菌，采用自誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)酵，通過離子交換樹脂分離純化，產(chǎn)物純度可達到99%以上；本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化法制備L-叔亮氨酸，產(chǎn)量可達130g/L以上，三甲基丙酮酸轉(zhuǎn)化率可達90%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為含有亮氨酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒pET-LeuDH圖譜
[0025]圖2為含有甲酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒pET-fdh圖譜
【具體實施方式】
[0026]實施例1、含有亮氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因的兩種重組菌的構(gòu)建
[0027]從臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)分別提取基因組DNA，通過PCR方法分別獲得fdh(甲酸脫氫酶)目的基因片段，LeuDH(亮氨酸脫氫酶)目的基因片段；然后，通過質(zhì)粒pETDuet-Ι表達fdh目的基因和LeuDH目的基因。詳細的操作方法見 Organic Process Research & Development, 2006,10,666-669。
[0028]實施例2、基因工程菌自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)(兩種重組菌培養(yǎng)方法相同)。將100 μ I的基因工程菌種子液接入含100 μ g/ml卡那霉素的IOml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm過夜培養(yǎng)。取400 μ I處于對數(shù)生長期的菌液接入含100 μ g/ml卡那霉素的40ml下述培養(yǎng)基中，在37°C，200rpm，培養(yǎng)12h。培養(yǎng)基組成為:1%胰蛋白胨，0.3%酵母浸出物，25mMNa2HP04，25mMKH2PO4, 50mM NH4Cl，5mM Na2SO4, 2mM MgSO4,1.0%甘油，0.05%葡萄糖，0.25%乳糖，100 μ MFeCl3O
[0029]實施例3、重組細胞懸浮液的制備:發(fā)酵液離心(10000g，5分鐘，4°C )得粗菌體，用pH6.0-7.0磷酸緩沖液洗滌和懸浮，用于下述實驗或儲存于_20°C待用。
[0030]實施例4、制備L-叔亮氨酸:將上述兩種重組細胞懸浮液按1: 2 (表達亮氨酸脫氫酶基因重組菌:表達甲酸脫氫酶基因重組菌)比例混合，菌體加入至50mMpH9.0磷酸緩沖液中，菌體加入終濃度為120g/L.然后加入濃度為0.05g/L的NAD+，再加入底物三甲基丙酮酸-氨水溶液(140g三甲基丙酮酸用10%氨水調(diào)pH至9.0)和IlOg甲酸銨,置于30°C水浴鍋中攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)液經(jīng)HPLC檢測，三甲基丙酮酸的轉(zhuǎn)化率達42%，每升發(fā)酵液中含有L-叔亮氨酸58.8g/L。
[0031]實施例5、連續(xù)流加底物制備L-叔亮氨酸:將上述兩種重組細胞懸浮液按
I: 2(表達亮氨酸脫氫酶基因重組菌:表達甲酸脫氫酶基因重組菌)比例混合，菌體加入至50mMpH9.0磷酸緩沖液中，菌體加入終濃度為120g/L.然后加入濃度為0.05g/L的NAD+，再加入底物三甲基丙酮酸-氨水溶液(60g三甲基丙酮酸用10%氨水調(diào)pH至9.0)和IlOg甲酸銨，置于30°C水浴鍋中攪拌反應(yīng)10h。然后用恒流泵連續(xù)流加剩余的三甲基丙酮酸-氨水溶液(80g三甲基丙酮酸用10%氨水調(diào)pH至9.0)，繼續(xù)反應(yīng)14h，反應(yīng)液經(jīng)HPLC檢測，三甲基丙酮酸的轉(zhuǎn)化率達96 %，每升發(fā)酵液中含有L-叔亮氨酸134.4g/L。
[0032]實施例6、L-叔亮氨酸的分離純化 [0033]發(fā)酵液用INHCl調(diào)節(jié)pH到中性，高速離心機離心20分鐘得上清液，上清液過732陽離子交換樹脂，用去離子水水洗到流出液為近無色，然后用0.8mol/L氨水從樹脂上解吸L-叔亮氨酸，HPLC檢測，收集L-叔亮氨酸含量在50%以上的解吸液，然后濃縮，低溫重結(jié)晶得L-叔亮氨酸，收率為87 %，純度為99.2 %。
【權(quán)利要求】
1.一種生物合成制備L-叔亮氨酸的方法，是將表達亮氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因大腸桿菌種子液接入自誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到粗菌體，加入緩沖溶液得到細胞懸浮液。然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸銨進行生物催化反應(yīng)，獲得L-叔亮氨酸轉(zhuǎn)化液。轉(zhuǎn)化液離心，調(diào)節(jié)溶液PH，柱層析，解析，濃縮得到高純度產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述自誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量份的物質(zhì)組成:0.5-1.5%胰蛋白胨，0.1-1.0%酵母浸出物，10-50mM Na2HPO4,10_50mMKH2PO4, 20-1OOmM NH4Cl, 1-1OmM Na2SO4,1-1OmM MgSO4,0.1_1.0%甘油，0.01-0.1 %葡萄糖，0.1-0.5%乳糖，50-120 μ M FeCl3O
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-42°C，攪拌轉(zhuǎn)速為120-250轉(zhuǎn)/分鐘，pH值為6.0-7.5，發(fā)酵時間為12-24小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述重組細胞懸浮液的制備方法為:發(fā)酵液離心得粗菌體，用PH6.0-7.0磷酸緩沖液洗滌和懸浮，獲得細胞懸浮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述細胞懸浮液中菌體的質(zhì)量百分含量為1%-20%,優(yōu)選為15%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述底物中，三甲基丙酮酸終濃度為160g/L，初始加入濃度為60-80g/L，剩余的三甲基丙酮酸在反應(yīng)時間內(nèi)連續(xù)流加完畢，甲酸銨加入濃度為100-130g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述生物合成反應(yīng)條件是，反應(yīng)溫度25-35°C，pH值為8.5-9.5，反應(yīng)時間 12-24 h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述調(diào)節(jié)溶液pH是將pH值用稀鹽酸調(diào)節(jié)至5-8，然后上樣于所述層析柱中，依次用水溶液和氨水溶液進行洗脫，收集含產(chǎn)品的洗脫液。濃縮，結(jié)晶，既得產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述層析柱中的介質(zhì)為離子交換樹脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述離子交換樹脂優(yōu)選為強酸性陽離子型樹脂。
【文檔編號】C12P13/04GK103966275SQ201310044292
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月5日
【發(fā)明者】朱嘉震, 史峻嵩, 李海存, 王穎, 趙新遠, 尹傳祥, 王金才 申請人:山東斯遞爾化工科技有限公司