一種編碼dna聚合酶的dna及其編碼的酶、應用和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及從超嗜熱古菌中分離的DNA聚合酶基因、質粒、編碼的DNA聚合酶、DNA聚合酶的制備及其應用，更具體的涉及從Pyrococcus?yayanosii中分離得到的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶、應用和制備方法；所述編碼DNA聚合酶的DNA具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；（ii）在（i）限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個或多個核苷酸。其編碼的DNA聚合酶具有超強耐高溫性能和高保真性能，優(yōu)異的抗抑制劑能力，能利用粗制樣品直接進行PCR反應。
【專利說明】—種編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的酶、應用和制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及從超嗜熱古菌中分離的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶、應用和制備方法,更具體的涉及從Pyrococcus yayanosii分離得到的編碼DNA聚合酶的DNA及其編碼的DNA聚合酶、應用和制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著分子生物學的發(fā)展,聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)越來越廣泛 地應用于基因克隆、遺傳疾病和病原微生物診斷、個體分型及刑偵、考古等領域。不同應用對PCR有不同需求，如基因克隆需保證能忠實地擴增得到目的基因、分子診斷需保證擴增的靈敏度、刑偵和遺傳疾病檢測又需要擴增能耐受一定的抑制劑，保證各類來源的模板能順利擴增。目前PCR反應主要是使用耐熱的DNA聚合酶，如從耐熱微生物Thermus aquaticus YTl中分離得到的Taq DNA聚合酶(美國專利號:4，889，818),其擴增效率高，且可使用引物探針來檢測目的片段，是目前各類檢測試劑盒常用的DNA聚合酶，但其擴增保真性差，容易出現(xiàn)非特異擴增和突變，同時對各種抑制劑敏感，如模板不純容易導致擴增失敗。另外一種Pfu DNA聚合酶，其擴增突變率大大降低且特異性得到很大提高，但該酶效率低、擴增產(chǎn)物少、延伸時間長(lkb/2min)，限制了其在很多領域中的應用(美國專利號:5，545，552)。
[0003]血液是常用的生物樣本之一，主要用于遺傳疾病、病原微生物診斷和血液分型，其中的血紅素、血紅蛋白、IgG、乳鐵蛋白等對DNA聚合酶有極強的抑制作用，如0.2%的全血就能完全抑制Taq DNA聚合酶擴增，添加BSA、T4gp32蛋白等也僅能在2%全血中擴增。通過突變Taq DNA聚合酶能提高其抗抑制劑能力，能在20%全血體系中擴增特定DNA片段(PCT專利，W02005/113829)。植物組織含有大量的多糖、多酚等物質，會抑制一般DNA聚合酶活性，動物組織中的各類蛋白和次生代謝產(chǎn)物也對DNA聚合酶活性有極強的抑制作用，且動植物組織中的核酸難以釋放出來。為了去除不同來源模板中的抑制劑，目前大都通過裂解組織、有機溶劑抽提、沉淀核酸等繁瑣步驟純化核酸，使用有機溶劑有一定毒害作用，且費時費力并太多樣品間易交叉污染，因此使用粗制樣品直接核酸擴增有極大的優(yōu)勢。市面上使用的基于Taq DNA聚合酶的直接PCR試劑盒，不能耐受高的變性溫度，無法有效釋放核酸，且對于高GC模板不能很好地擴增；另一種通過突變缺失高保真酶3’ -5’外切酶活性或與TaqDNA聚合酶按不同比例混合，使其能在全血中擴增，由于失去了校正活性，擴增錯誤率大大提高，對動植物組織也無法很好地擴增(PCT專利，W02009/140497)。

【發(fā)明內容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種從超嗜熱古菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其編碼出的蛋白質即DNA聚合酶具有超強的熱穩(wěn)定性(99°C半衰期為3h)，在PCR反應中具有較高的保真能力、較高的擴增效率，且具有抗各種抑制劑能力，能利用全血、血細胞、痕量干血潰、動植物組織等直接擴增目的片段，其抗抑制劑能力能容納到25%的全血的擴增。
[0005] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0006]從超嗜熱古菌中分離出的編碼DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一:
[0007](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0008](ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個或多個核苷酸。
[0009]本發(fā)明還提供一種DNA聚合酶，其具有如下氨基酸序列:
[0010](i)具有序列表中SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列；
[0011](ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個或多個氨基酸。
[0012]本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達載體。
[0013]本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備前述DNA聚合酶的方法，包括用包含前述編碼DNA聚合酶的DNA的表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)轉化體，獲得DNA聚合酶。具體步驟如下:
[0014](I)分析基因結構，擴增成熟蛋白編碼序列，通過重疊PCR得到如SEQID N0.1所述的基因片段，構建至含啟動子的表達載體；
[0015](2)將表達載體轉化至宿主菌，得到能生產(chǎn)適用于PCR反應的DNA聚合酶的重組細胞；
[0016](3)擴大培養(yǎng)該重組細胞,誘導后用于制備該DNA聚合酶；
[0017](4)利用凝膠介質，例如鎳和肝素層析柱依次純化該DNA聚合酶。
[0018]本發(fā)明的第五個目的是提供一種前述的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用。
[0019]進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述DNA聚合酶直接應用于未純化的樣品體系。本發(fā)明所述DNA編碼出的DNA聚合酶能夠直接應用于未純化的樣品體系中，包括血液、血潰、血細胞、動植物組織，動植物細胞、微生物等未經(jīng)純化提取出核酸的樣品。
[0020]本發(fā)明的第七個目的是提供一種PCR擴增試劑盒，其包含有前述的DNA聚合酶。
[0021]本發(fā)明所述超嗜熱古菌是指Pyrococcus yayanosii,該古菌購自日本微生物菌種保藏中心(保藏編號:JCM:16557)，其分離自大西洋中脊4100m深處一個名為“Ashadze”的熱液口，生長于80-108°C，最適生長溫度為98°C，具有超強嗜熱生長特性(Jean-LouisBirrien 等，IJSEM，2011，61 (12):2827-2881 )。【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1示本發(fā)明DNA聚合酶Pya純化產(chǎn)物SDS-PAGE檢測結果。泳道I為UnstainedProtein Molecular Weight Marker (Thermo),泳道 2 為透析后得到的 DNA 聚合酶 Pya。
[0023]圖2示本發(fā)明DNA聚合酶Pya熱穩(wěn)定性。
[0024]圖3示本發(fā)明DNA聚合酶Pya擴增不同模板的應用。泳道I為人基因組1.5kb片段，2為Thermus thermophilus HB8GC含量為71%的2kb片段，3為大腸桿菌16srDNA片段，
4為人 β-Actin0.7kb 片段，M 為 Trans2k plus II DNAmarker?
[0025]圖4示本發(fā)明不同DNA聚合酶全血PCR擴增結果。泳道1、2為SN0Vamp?5 X PCRPremix (Snova), 3、4 為 IOXPya buffer, 5、6 為 5XPya direct PCR buffer, 7、8 為 TaqDNA 聚合酶(天根)、9、10 為 Pfu DNA 聚合酶(天根)，M 為 Trans2k plus II DNA marker。
[0026]圖5示本發(fā)明DNA聚合酶Pya擴增不同濃度全血的結果。泳道1、2為10%、15%人全血，3 ~8 為 25%、20%、15%、10%、5%、2.5% 兔全血，M 為 Trans2k plus II DNA marker?
[0027]圖6示本發(fā)明DNA聚合酶Pya擴增不同來源粗樣品的結果。泳道I為干血潰，2為血細胞，3 為全血，M 為 Trans2k plus II DNA marker。
[0028]圖7示本發(fā)明DNA聚合酶Pya在全血PCR擴增不同片段中的應用。泳道I為β-Actin片段，2為高GC片段，3為GAH)片段；4~6為基因組擴增，M為IOObp DNA Ladder。
[0029]圖8示本發(fā)明DNA聚合酶Pya在不同動植物組織直接擴增中的應用。泳道1、2為油菜和白菜葉片直接擴增18srDNA約70bp片段，3、4為約IOObp線粒體片段，5為小鼠尾巴直接擴增約300bp片段。
【具體實施方式】
[0030]為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方 案，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0031]實施例1.Pyrococcus yayanosii DNA聚合酶基因的克隆與表達
[0032]菌種購買于日本微生物菌種保藏中心(保藏編號JCM16557)，將購買的菌種以 12000rpm 離心 5min,棄上清；細胞沉淀參照 Wizard* Genomic DNA Purificationkit (Promega公司)提取基因組DNA,簡要步驟如下:細胞沉淀以600 μ L Nuclei LysisSolution (核裂解液)重懸，80°C水浴5min裂解細胞；冷卻至室溫后，加入200 μ L ProteinPreciptitation Solution (蛋白沉淀液)，震蕩混勻，冰浴5min ;12000rpm離心5min ;吸取上清至另一個干凈的離心管,加入600 μ L異丙醇，混勻后冰浴IOmin ; 12000rpm離心5min ；核酸沉淀以700 μ L70%乙醇洗滌兩次，12000rpm離心5min后，棄上清，室溫干燥核酸沉淀IOmin至無酒精味，加入50 μ L洗脫緩沖液溶解。
[0033]根據(jù)Pyrococcus yayanosii全基因組序列，分析得到其DNA聚合酶基因,其全序列包含3942bp，編碼1313aa，通過與其他物種中DNA聚合酶比對，得到其成熟蛋白由兩段DNA編碼，共776aa。設計并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物:BamH I PyaffF:cgcGGATCCatgattctggatgctgacta, Pya493R:cataatagctgttggccaggattttgatggcgcgctg,Pya3085F:caaaatcctggccaacag ctattatggctattatggttatgcg，PyaWR:tccGTCGACggcattctggaagtgctggag。下劃線部分GGATCC代表BamH I酶切位點，GTCGAC代表Sal I酶切位點。首先擴增上下游編碼區(qū)片段，以引物BamH I PyaWF和Pya493R擴增約1.5kb片段；以引物Pya3085F和PyaWR擴增約0.9kb片段，按以下體系配制PCR反應液，50 μ L體系中包含:基因組 DNA50ng，引物各 400nM，dNTPs200 μ Μ, 5 X PrimeSTARlf Buffer (Mg2+plus) 10 μ L,PrimeSTARli HS0.5 μ L(寶生物公司)。PCR 擴增程序為:98°C 2min，(94°C 10s ；55°C 20s ；68 °C 1.5min或lmin) 25cycles, 68°C延伸5min。PCR產(chǎn)物電泳并回收目的條帶，添加相同量上下游片段，以基因兩端引物BamH I PyaWF和PyaWR進行重疊PCR，拼接得到全長編碼區(qū)。回收得到的全長約2.5kb片段，以BamH I和Sal I酶切，連接至同樣酶切的含T7啟動子載體中，轉化至DH5a感受態(tài)細胞中。
[0034]通過菌液PCR和酶切鑒定，得到的陽性質粒測序驗證后轉化至表達菌Rosetta (DE3)細胞中。挑取單菌落培養(yǎng)至OD6tltl=0.4，加入0.1mM IPTG誘導4h，收集菌體超聲波破碎，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。
[0035]實施例2.DNA聚合酶Pya的純化
[0036]將能正確表達DNA聚合酶Pya的菌種按1:100接種至500mL含200mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入終濃度30mg/L的卡那霉素和34mg/L氯霉素，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600=0.4，加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導目的蛋白表達，于30°C誘導4h ;收集誘導后菌液，12000rpm 離心 2min,棄上清，細胞用 20mL buffer A (20mM Tris-HCl (pH7.8), 0.1MKCl, 50mM NaCl)加30mM咪唑重懸，于-80°C冰箱中凍存12h ;37°C溶解細胞，超聲波破碎后于70°C水浴鍋處理30min，12000rpm離心10min ;上清過鎳親和介質(IDA，國家生化工程技術研究中心)，以含400mM咪唑的buffer A洗脫；洗脫液過肝素親和介質(國家生化工程技術研究中心)，以含200mM、400mM、600mM、lM NaCl的buffer A洗脫；收集各蛋白峰經(jīng)SDS-PAGE檢測，含200mM NaCl的buffer A能洗脫部分目的蛋白，含400mM的buffer A大量洗脫目的蛋白，純度達到95%以上(圖1)。將得到的產(chǎn)物透析至Storage buffer:20mMTris HCl (ρΗ7.4)，0.1mM EDTA, 0.l%Tween20, 0.5%Nonidet P40, 0.1M KCl, 50% 甘油。
[0037]實施例3.DNA聚合酶Pya在核酸擴增中的應用
[0038]實施例2中得到的酶以72°C 30min摻入的核苷酸量確定活性，稀釋為2.5u/ μ L，以熒光探針法測試其3’_5’外切酶活性，結果Pya具有較強的校正活性，說明其擴增保真性能較好。為了測試DNA聚合酶Pya的熱穩(wěn)定性，將酶于99°C孵育，取O、l、2、3、4h處理的酶測DNA聚合酶活性，結果DNA聚合酶Pya具有極高的熱穩(wěn)定性，其99°C半衰期為3h(圖2)。 [0039]測試DNA聚合酶反應條件，以PUC19質粒為模板，設計引物PCR擴增約2.7kb片段確定其反應的最適pH及K+、NH4+、Mg2+離子濃度。配制IOXbuffer B:500mMTris-HCl (pH7.4 ~8.8)，15mM MgCl2,分別添加不同濃度 KCl、(NH4)2SO4' MgCl2,反應體系為 20μ L 含:10Xbuffer B (ρΗ7.4 ~8.8) 2 μ L，dNTPs (2.5mM) 1.6μ L,弓 I 物 PAs 及PAa(IOyM)各 0.5 μ L，Pya0.2 μ L, pUC19 (15ng/μ L) 0.5 μ L,按 98 °C 2min, (98 °C 10s,60°C 20s, 68°C 2min40s) 25cycles,最后 68°C延伸 5min,電泳檢測確定最適 buffer。結果DNA 聚合酶 Pya 的最適反應 buffer 為:10XPya buffer:500mM Tris-HCl (pH8.4), 150mMKCl, 5mM(NH4)2SO4, 20mM MgCl20 以 IOXPya buffer 和 Pya 分別擴增 Thermus thermophilusHB8約2kb高GC片段(約72%)、人基因組DNA約0.71Λβ-ActinjP 1.5kb片段、大腸桿菌菌液為模板擴增16srDNA約1.5kb片段，結果均能很好地擴增得到目的片段(圖3)。
[0040]實施例4.DNA聚合酶Pya直接擴增粗制樣品的應用
[0041]以BD vacutainer真空采血管采集的人全血為模板，測試Pya用于全血直接PCR擴增效果，向體系中添加不同濃度的BSA和Betaine，結果BSA最佳終濃度為
0.01%，Betaine 終濃度為 0.35M，根據(jù)測試結果配制 5XPya direct PCR buffer:250mMTris-HCl (ρΗ8.4), 75mM KCl, 2.5mM (NH4)2SO4, IOmM MgCl2,0.05%BSA, 1.75M Betaine ;分別使用 SN0Vamp?5XPCR Premix (Snova), Taq DNA 聚合酶(天根)、Pfu DNA 聚合酶(天根)和Pya DNA 聚合酶(10XPya buffer 和 5XPya direct PCR buffer)擴增人全血約 IOObp 片段，全血終濃度為2.5%和5%。結果除Pya外，其他酶均不能擴增，IOXPya buffer能很好地擴增2.5%全血，5%全血擴增效果較差，使用5XPya direct PCR buffer均能很好地擴增得到目的條帶(圖4)。
[0042]以采集的兔全血為模板，分別添加終濃度為2.5%、5%、10%、15%、20%、25%全血，或終濃度為10%、15%人全血，使用5 X Pya direct PCR buffer擴增約IOObp片段，結果均能擴增得到目的條帶，說明DNA聚合酶Pya能耐受約25%全血(圖5)。
[0043]分別以5%血細胞(全血離心后，以相同體積TE重懸)、濾紙上的干血潰(裁剪為1mm碎片，直接加入PCR體系)和5%全血擴增人β -Actin約750bp片段，結果均能得到目的條帶，DNA聚合酶Pya具有擴增痕量血液樣品的能力(圖6)。
[0044]以5%人全血為模板，擴增β -Actin約IOObp片段，約IOObp高GC片段(GC含量70%)和GAPD約IOObp片段，結果Pya均能擴增得到目的條帶，對復雜模板也能很好地擴增(圖 7)。
[0045]以10 μ L槍頭戳取小塊油菜、白菜葉片，直接加至PCR體系，擴增約70bpl8srDNA和IOObp線粒體DNA片段；戳取小塊小鼠尾巴組織，加至反應體系直接擴增約300bp片段，結果不同來源組織均能很好地擴增得到目的片段(圖8)。
[0046]以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本【技術領域】的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種編碼DNA聚合酶的DNA，其特征在于:其具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替換一個或多個核苷酸。
2.—種DNA聚合酶，其特征在于:其具有如下氨基酸序列: (i)具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列； (ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替換一個或多個氨基酸。
3.包含權利要求1所述的DNA的表達載體。
4.制備權利要求2所述的DNA聚合酶的方法，其特征在于:包括用權利要求3所述的表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)轉化體，獲得DNA聚合酶。
5.權利要求2所述的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用，其特征在于:所述DNA聚合酶直接應用于未純化的樣品體系。
7.根據(jù)權利要求6所 述的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用，其特征在于:所述未純化的樣品體系為血液、血潰、血細胞、動物組織、動物細胞、植物組織、植物細胞中的任意一種。
8.—種PCR擴增試劑盒，其特征在于包含有權利要求2所述的DNA聚合酶。
【文檔編號】C12N9/12GK103966244SQ201310044362
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月4日 優(yōu)先權日:2013年2月4日
【發(fā)明者】龍虎, 李春芳, 狄廷娣, 周裕程, 萬強 申請人:思洛生物技術股份有限公司