專利名稱：胎兒有核紅細胞分離純化方法及唐氏綜合癥篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有核紅細胞(NRBC)分離純化及快速基因篩查試劑盒制備，屬于分子細胞生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體是涉及一種孕婦外周血中的胎兒NRBC分離純化和用NRBC進行唐氏綜合癥(Down’ s syndrome, DS)的快速基因檢測的試劑盒，可以應(yīng)用于DS的產(chǎn)前篩查。
背景技術(shù)：
唐氏綜合征，又稱為先天愚型，21三體綜合征。在孕婦中胎兒DS的發(fā)病率為1/100，大多數(shù)在早期發(fā)生流產(chǎn)。在新生兒中，其發(fā)病率為1/600— 800，且隨著孕婦年齡的增大而遞增，每個孕婦都有一定的風(fēng)險，是人類最常見的一種染色體異常疾病，其臨床表現(xiàn)為智力低下(智商在25 - 30%之間)，先天性多發(fā)畸形，獨特面容和生長發(fā)育障礙等，常伴有先天性心臟病和消化道畸形，是引起智力低下的主要病因之一。患者大多數(shù)生活不能自理，給家庭和社會帶來了極大的 ·精神負擔(dān)和經(jīng)濟損失。DS的發(fā)病機制是染色體減數(shù)不分離。正常情況下減數(shù)分裂時DNA復(fù)制一次，細胞連續(xù)分裂兩次，第一次減數(shù)分裂配對的同源染色體分離到兩個子細胞，第二次減數(shù)分裂兩條姐妹染色體分別分離到兩個細胞，卵子受精后從精子來的一條染色體單體和卵子的一條染色單體結(jié)合，恢復(fù)成受精卵的二倍體結(jié)構(gòu)，而DS的發(fā)病原因大部分是由于第一次減數(shù)分裂時同源染色體不分離，造成子代細胞較正常細胞多一條染色體，第二次減數(shù)分裂時姐妹染色體既使分裂正常，受精后也會成為21三體，導(dǎo)致DS。還有少數(shù)情況是第二次減數(shù)分裂時姐妹染色體不分離所至，迄今為止，醫(yī)學(xué)上對此類疾病尚無有效的預(yù)防和治療措施，唯一可以采取的手段就是通過產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷盡可能早期發(fā)現(xiàn)，終止妊娠來防止患兒出生，國外許多國家在八十年代已將其列為必檢項目。因此，開展唐氏綜合征產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷對于提高我國人口素質(zhì)具有重大意義，是優(yōu)生的重要內(nèi)容之一。目前的臨床上常規(guī)應(yīng)用的DS篩查方法是先進行孕婦外周血中甲胎蛋白和絨毛膜促性腺激素等血清標記物含量篩查，通過專業(yè)軟件運用統(tǒng)計學(xué)方法測算出該孕婦生DS患兒的風(fēng)險率，高于設(shè)定值的孕婦建議作羊水穿刺，作染色體分析，以最終確診。然而，上述篩查方法的在假陽性率高達99%以上時，而漏檢率仍超過20%，因此遠遠不能滿足實際需要。另外，目前確診唐氏兒的方法是傳統(tǒng)的羊膜腔穿刺取羊水或絨毛膜細胞培養(yǎng)后行染色體核型分析，這種技術(shù)診斷時間長，約3周左右，且具有一定的危險性。因此，該方法雖被認是一種較安全可靠的診斷方法，診斷精確度較高，但診斷率低，即使是高齡孕婦也不愿采用此法，病人依從性差，不能作為篩查技術(shù)應(yīng)用。因此建立無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷取材方法，降低產(chǎn)前診斷的風(fēng)險是產(chǎn)前診斷工作的一項重大課題。利用孕婦外周血胎兒細胞進行產(chǎn)前診斷即是最具前途的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法之一，因?qū)τ谔簺]有任何風(fēng)險，對孕婦無痛苦，易被接受、推廣，近年來研究十分活躍，是遺傳病產(chǎn)前診斷的發(fā)展方向。孕婦外周血存在胎兒細胞已被國內(nèi)外許多研究所證實。孕婦外周血中胎兒細胞包括胎兒有核紅細胞(Nucleated red blood cell、NRBC)、胎兒淋巴細胞、胎兒滋養(yǎng)細胞及粒細胞，可見通過胎盤屏障進入母體循環(huán)的胎兒細胞是一個混合群體。將適宜于進行產(chǎn)前診斷的靶細胞從母體外周血中分離出來是實施無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的前提。目前國內(nèi)外學(xué)者的研究集中在胎兒有核紅細胞上，并一致認為胎兒有核紅細胞是最佳的靶細胞。理由是=NRBC具有如下特征:(I)可在妊娠早期出現(xiàn)，壽命短(不超過90天)，便于早期診斷；(2)可表達出特殊的抗原成分，便于富集；(3)可發(fā)生特殊的血紅蛋白反應(yīng)，便于鑒定；(4)攜帶胎兒全部遺傳信息(基因組)，便于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析。如何對上述細胞尤其是母體外周血中胎兒有核紅細胞加以富集、分離并進行胎兒基因診斷，是目前產(chǎn)前診斷研究的一個熱點。國內(nèi)外學(xué)者大多利用各種胎兒細胞表面特異抗原的單克隆抗體，經(jīng)流式細胞計數(shù)儀分離純化胎兒細胞，但這些NRBC絕大多數(shù)為母源性，胎源性NRBC比例很低，Reading等報道用1.083和1.090g/ml兩種不同密度梯度的Percoll分離液對母體外周血單個核細胞進行分離，經(jīng)FISH和Y珠蛋白單抗標記后進行FACS證實，高密度梯度的分離液可顯著提高胎兒細胞的產(chǎn)量。綜上所述，目前國內(nèi)外關(guān)于這方面的研究都存在胎兒細胞富集、分離的數(shù)量少，純度不夠，操作過程復(fù)雜，并且應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的疾病范圍非常有限，使得該項工作沒有根本的突破。因此建立一套穩(wěn)定可靠、操作簡便、富集力強、分離純度高的富集和分離胎兒有核紅細胞的新方法，并用于產(chǎn)前多種遺傳性疾病的診斷，然后能普及推廣。實時熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的能夠?qū)O微量特異DNA (基因)拷貝數(shù)進行精確定量的最先進的基因劑量定量新技術(shù)。由于唐氏綜合征的每個體細胞中21號染色體為3條，而其它常染色體為2條，因此21號染色體上的單拷貝基因劑量是其它常染色體上的單拷貝基因劑量的1.5倍，因此可以選擇21號染色體上的單拷貝基因如DSCRl和常染色體上的單拷貝同源序列，通過競爭性熒光定量PCR技術(shù)來檢測出它們的相對拷貝數(shù)的比值來判斷21號染色體的倍性，從而從微量DNA標本中檢測出唐氏綜合征。將分離出的胎兒有核紅細胞進行純化，提取DNA后，再采用競爭性實時熒光定量PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)精確檢測其21號染色體基因劑量，從而診斷唐氏綜合征，必將使該遺傳病的產(chǎn)前篩查和診斷 更加快速準確和易于推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡便，能夠快速分離純化孕婦外周血存在胎兒NRBCs，進而用競爭性熒光定量共擴增聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)進行唐氏綜合癥產(chǎn)前基因篩查的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種胎兒有核紅細胞的分離純化方法:取孕期在10 - 18周的孕婦外周靜脈血2 - 5ml，加入到含有10E+8個抗⑶45抗體磁珠與肝素的抗凝采血管中負篩選，充分混勻以吸附白細胞，然后于磁分離器上分離后取上層血液轉(zhuǎn)移到含有10E+7個抗CD71抗體磁珠與肝素的抗凝采血管中正篩選，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分洗滌，獲得胎兒NRBC ;然后于磁分離器上分離，去凈PBS后加入超純水，98°C下裂解細胞釋放DNA，置一20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ环N唐氏綜合癥篩查試劑盒，包括DNA提取試劑、含有10E+8個抗⑶45抗體磁珠與肝素的抗凝采血管、含10E+7個⑶71抗體磁珠與肝素的抗凝采血管、DSCR和USC2特異的共用引物、雙色熒光Taqman探針以及SRY基因特異的引物和探針；所述DSCR和USC2特異的共用引物為:上游引物:5，-AAA GTT TCT TCT GGA TCTACA G-3，(SEQ ID NO:1);下游引物:5，_TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3，(SEQ ID NO:2);DSCR特異 TaqMan 探針 DSCRTM:5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’(SEQID NO:3);USC2 特異 TaqMan 探針 5’ -[HEX] CAAAAC TCA CAG AGG GAC TC [TAMRA]-3’ (SEQID NO:4)。SRY基因特異的引物和探針:SRY上游引物:5’-CCA GTG GAA AAT GCT TAC TG-3’(SEQ ID NO:5);SRY 下游引物:5，-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3，(SEQ ID NO:6)；SRY特異的探針:5’ -R0X-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:7)。上述試劑盒還含有IX PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶，Mg++、dNTPs及PCR反應(yīng)緩沖液。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用抗CD45抗體磁珠負篩選，繼之以抗CD71抗體磁珠正篩選，可以從母血中有效分離有核紅細胞，再用高靈敏度與高準確性的競爭性熒光定量PCR技術(shù)檢測DSCR區(qū)特異片段的相對劑量，輔以Y染色體特異片段SRY基因的相對劑量作為內(nèi)部質(zhì)控，可以快速精確地檢測21號染色體的倍性。
具體實施例方式實施例11、胎兒NRBC的分離純化和DNA提取取孕期在10-18周的孕婦外周靜脈血2_5ml，加入到含有10E+8個抗⑶45抗體磁珠的肝素抗凝管中負篩選，充分混勻以吸附白細胞，然后于磁分離器上分離5分鐘，取上層血液轉(zhuǎn)移到含有10E+7個抗⑶71抗體磁珠的肝素抗凝管中正篩選，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分洗滌，獲得胎兒NRBC ; 然后于磁分離器上分離5分鐘去凈PBS后，加入超純水，98°C下裂解細胞5min，釋放DNA，置一 20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、用21號染色體特異序列DSCR區(qū)段序列和2號染色體上的同源序列USC2分別合成其共用引物和片段特異的雙色Taqman熒光探針以及Y染色體上特異單拷貝序列SRY基因特異的引物和探針。上述引物和探針為專利‘一種雙色競爭性熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測試劑盒’(專利號CN200910020242.6)所述的競爭性PCR引物和探針及依據(jù)ENSG00000184895所設(shè)計合成的SRY特異的引物和探針:競爭性PCR 上游引物:5，-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G_3，(SEQ ID NO:1);競爭性PCR 下游引物:5，-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’ (SEQ ID NO:2)；DSCR特異 TaqMan探針DSCRTM:5，-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA [TAMRA] _3，(SEQ ID NO:3) ;USC2 特異 TaqMan 探針 5’-[HEX] CAA AAC TCA CAG AGG GAC TC [TAMRA]-3’(SEQ ID NO:4)0SRY 上游引物:5，-CCA GTG GAA AAT GCT TAC TG-3，(SEQ ID NO:5);SRY 下游弓丨物:5，-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3，(SEQ ID NO:6);SRY 特異的探針:5’-R0X-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:7)DSCR 擴增產(chǎn)物 171bp，序列為:AAAGTTTCTT CTGGATCTA CAGAAAAAAT TTTTTTTTTTCAATCTAAAA ACTGGAAATT CTAGGGTTTT TGTACATTTT GGATGCACTG GGAATTTATT AGCACAAAATCATTCTTTGC AACTCAAAAT TCAGAAGGGA CTCTACCATAT CTTAGCTCAG AGCACAGAGGACSEQ ID NO:8)；USC2 擴增產(chǎn)物 169bp，序列為:AAAGTTTCTT CTGGATCTAC AGGAGTTTTT CATTTCCAATCTAAAAACTA GAAGCTCTAG CATTTTGTACA TTTTTTGTTGT TGCACTGGAA GTTTAACTATTGGCACAAAAT CATTCTTCAAA ACTCACAGAG GGACTCTGCC ATTACTTAGC TCAGAGCACA GAGGA (SEQID NO:9)；SRY 特異擴增產(chǎn)物:CCAGTGGAAA ATGCTTACTG AAGCCGAAAA ATGGCCATTCTTCCAGGAGG CACAGAAATT ACAGGCCATG CACAGAG (SEQ ID NO:10)。3.雙色競爭性熒光定量PCR及多重PCR反應(yīng)50ul反應(yīng)體系中含上述四個引物各lOpmol，各探針各lOpmol，待檢測DNAlOOng，IX PCR 緩沖液，Taq DNA 聚合酶 1.5u, Mg++ 終濃度 2.0mmoI/L, dNTPs 終濃度 0.2mmol/L 然后在FTC2000實時熒光定量PCR儀上96°C下預(yù)變性2min，然后94°C變性10sec，50°C復(fù)性30sec，6(TC延伸40sec，共45個循環(huán)，并在60°C延伸時采集熒光。每一個標本重復(fù)三次實驗，取各標本的Ct值的平均值。通過對26名唐氏綜合征患者(男性17名，女性9名)和48位正常受試者(男性23名，女性25名)的多重PCR反應(yīng)實驗表明，唐氏綜合征患者的USC2與DSCRl片段的Ct值的差值為0.79±0.26 ;其而正常人的USC2與DSCRl的差值為0.12±0.06，二者有顯著性差異。女性患者和女性正常人的SRY基因檢測均為陰性；男性患者和正常人的SRY基因檢測為陽性，其Ct值與USC2的Ct值的差值為1.14±0.17。如果設(shè)定以正常人的USC2與DSCRl的差值的均數(shù)加其三倍的標準差為判斷是否 為正常的標準，則如果待測標本的USC2與DSCRl的差值大于0.3，可判斷為DS高危；由于男性患者和正常人的SRY基因Ct值與USC2的Ct值的差值為1.14±0.17，可以對DS進一步確認。
權(quán)利要求
1.一種胎兒有核紅細胞的分離純化方法，其特征是，取孕期在10 — 18周的孕婦外周靜脈血2 - 5ml，加入到含有10E+8個抗⑶45抗體磁珠與肝素的抗凝采血管中負篩選，充分混勻以吸附白細胞，然后于磁分離器上分離后取上層血液轉(zhuǎn)移到含有10E+7個抗CD71抗體磁珠與肝素的抗凝采血管中正篩選，磷酸緩沖鹽溶液充分洗滌，然后于磁分離器上分離，去凈磷酸緩沖鹽溶液后加入超純水，98°C下裂解細胞釋放DNA，置一 20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.一種使用權(quán)利要求1分離純化的有核紅細胞進行唐氏綜合癥篩查的試劑盒，其特征是，包括DNA提取試劑、含有10E+8個抗CD45抗體磁珠與肝素的抗凝采血管、含10E+7個CD71抗體磁珠與肝素的抗凝采血管、DSCR和USC2特異的共用引物、雙色熒光Taqman探針以及SRY基因特異的引物和探針； 所述DSCR和USC2特異的共用引物為:上游引物:5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCTACA G-3，;下游引物:5，-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3，;DSCR 特異 TaqMan 探針DSCRTM:5’ -[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]_3’ ；USC2 特異 TaqMan 探針5’ -[HEX]CAAAAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]_3’ ；所述SRY基因特異的引物和探針:SRY上游引物:5’-CCA GTG GAA AAT GCT TAC TG-3，;SRY 下游引物:5，-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3’；SRY 特異的探針:5，-ROX-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3，。
3.如權(quán)利要求2所述的唐氏綜合癥篩查試劑盒，還含有IXPCR緩沖液，Taq DNA聚合酶，Mg++、dNTPs及磷酸緩沖鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胎兒有核紅細胞分離純化方法及唐氏綜合癥篩查試劑盒，屬于分子細胞生物學(xué)檢測領(lǐng)域。它首先將孕婦外周血與CD45抗體標記磁珠充分混合以吸附白細胞，于磁分離器上棄之并將上層細胞轉(zhuǎn)至含CD71抗體標記磁珠的試管中，充分混勻，于磁分離器上分離收獲有核紅細胞；再提取其基因組DNA；將SRY、DSCR和USC2特異探針以及DSCR和USC2競爭性引物及SRY特異性引物和待測DNA加入同一個競爭性熒光定量PCR反應(yīng)體系，進行競爭性多重實時熒光定量PCR反應(yīng)，獲得DSCR和USC2的Ct，計算其差值進而判斷待測樣本是否DS高危。
文檔編號C12N5/078GK103103161SQ20131004545
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者夏慶杰, 楊林, 吳蘋 申請人:山東亞大藥業(yè)有限公司