專利名稱：用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種采用熒光能量共振現(xiàn)象監(jiān)測(cè)重金屬離子作為輔助因子使核酸分子發(fā)生水解反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)變化而用于定性定量檢測(cè)金屬離子的方法，適用于有害重金屬快速檢測(cè)研究。
背景技術(shù)：
重金屬鉛污染具有隱蔽性、表聚性與不可逆性等特點(diǎn)，不僅影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)等，而且通過食物鏈對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的危害，尤其是最近一段時(shí)間，我國(guó)相繼發(fā)生了幾起與重金屬鉛污染相關(guān)的公共衛(wèi)生事件，讓人們對(duì)環(huán)境鉛污染更加關(guān)注。鉛的傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)要么費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要么價(jià)格昂貴，都難以滿足環(huán)境與食品安全監(jiān)控的需求，因此，建立方便、快速的重金屬檢測(cè)技術(shù)十分必要。核酸分析方法用于病原檢測(cè)的已經(jīng)比較多，但是將其用于環(huán)境污染物檢 測(cè)方面的研究還不多見。本研究中所用的核酸一8-17脫氧核酶(DNAzyme8-17)是一種反式寡核苷酸,一個(gè)單鏈的DNA片段、非蛋白質(zhì)、非生物體組成成分，具有分子量小，穩(wěn)定性高，易人工合成，與其靶RNA配對(duì)的精確性高，但是需要特定的金屬離子作為輔助因子才能發(fā)生水解。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在鉛離子是使DNAzymeS-17發(fā)生水解的輔助因子，而其他的金屬離子則使DNAzymeS-17的雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生折疊，用熒光基團(tuán)DNAzyme8-17，根據(jù)熒光基團(tuán)的熒光變化來(lái)反應(yīng)核酸的結(jié)構(gòu)變化情況，用來(lái)檢測(cè)鉛離子。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，戢太云徐魯榮周培在《核酸熒光探針檢測(cè)鉛離子的研究》(核酸熒光探針檢測(cè)鉛離子的研究，2010年I期)中公開了一種方法，將8-17DNAzyme增加2個(gè)〃G-C〃堿基對(duì)進(jìn)行增強(qiáng)熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)修飾，并標(biāo)記上I個(gè)熒光基團(tuán)〃FAM〃和2個(gè)熒光猝滅基團(tuán)"Dabcyl"，設(shè)計(jì)成雙猝滅Pb2+熒光探針.研究了該探針對(duì)Cd2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+6種二價(jià)金屬離子的響應(yīng)，結(jié)果表明探針對(duì)Pb2+具有很強(qiáng)的特異性，在探針濃度為2.5X l(T7mol/L時(shí)，Pb2+濃度在8.5X 1(T8 7.5X l(T6mol/L范圍內(nèi)和探針的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，檢出限為8.5X10_8mol/L.該探針可用于Pb2+的定性和定量檢測(cè)。但該探針的穩(wěn)定性無(wú)法達(dá)到現(xiàn)有檢出要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針及其檢測(cè)方法，將核酸分析法結(jié)合發(fā)光方法，用于重金屬鉛的檢測(cè)。其檢測(cè)過程簡(jiǎn)單快速，為是否需要進(jìn)行后續(xù)的精準(zhǔn)檢測(cè)提供依據(jù)，為加強(qiáng)我國(guó)環(huán)境和食品安全控制和監(jiān)督提供技術(shù)支撐。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針，即DNAzymeS-17熒光探針，其DNA序列由以下:A) 5’ -FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3’，以及B) 3' -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5’ 所組成。
本發(fā)明涉及上述探針的制取方法，通過用DNA/RNA合成儀分別合成設(shè)計(jì)好熒光標(biāo)記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，將酶:底物:水=1:1:78的體積比配成的混合液置于PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解后過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產(chǎn)物，得到雙鏈熒光探針。本發(fā)明涉及一種基于上述探針的重金屬鉛快速定性檢測(cè)方法，通過對(duì)比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的熒光強(qiáng)度，得到所述探針對(duì)于鉛離子的特異性結(jié)果，并通過熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)Pb2+的定性檢測(cè)。本發(fā)明涉及一種基于上述探針的重金屬鉛快速定量檢測(cè)方法，通過對(duì)探針中加入已知濃度的Pb2+，并且在260nm處掃描熒光強(qiáng)度，從而構(gòu)建出Pb2+濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系曲線；隨后將待測(cè)樣品在260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度值帶入線性關(guān)系曲線，從而得到Pb2+的濃度并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。本發(fā)明原理在于:基于DNAzymeS-17在Pb2+的輔助作用下，會(huì)從其水解位點(diǎn)處發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致DNAzyme8-17的雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而其他的金屬離子卻不能作為輔助因子促使DNAzyme8-17發(fā)生水解反應(yīng)。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過改進(jìn)的核酸熒光探針，不僅不受檢測(cè)的環(huán)境溫度必須控制在4°C以內(nèi)的約束，在室溫下就可以進(jìn)行；并且通過雙淬滅設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)更低濃度的鉛離子的檢出。操作簡(jiǎn)單、快速。


圖1為本發(fā)明改進(jìn)探針的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明不同Pb2+濃度下熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)示意圖。圖3為實(shí)施例探針的特異性示意圖。圖4為Pb2+濃度與熒光強(qiáng)度間的線性關(guān)系示意圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例包括以下步驟:1)用DNA/RNA合成儀分別合成設(shè)計(jì)好熒光標(biāo)記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，
將酶:底物冰=1:1:78的體積比配成的混合液置于PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解后過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產(chǎn)物，得到DNA序列如圖1所示的雙鏈熒光探針；然后將紫外分光光度計(jì)260nm處OD=L 000濃度的，雙鏈探針I(yè)mL分別在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30V六個(gè)溫度下避光放置3小時(shí)。2)在室溫下將5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無(wú)菌水490 u L均勻混合，掃描探針的背景熒光強(qiáng)度；隨后分別取40ii L濃度為5.0X10_6mol/L的鎘、鋅、鎂、銅、錳、鉛6種二價(jià)金屬鹽的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無(wú)菌水450 u L均勻混合的探針溶液中，掃描熒光強(qiáng)度；根據(jù)探針中加入不同的金屬離子以后的熒光強(qiáng)度變化，確定探針對(duì)Pb2+的特異性，從而實(shí)現(xiàn)Pb2+的快速定性檢測(cè)。3)將熒光探針的初始濃度設(shè)計(jì)為2.5X10_7mol/L、l.25X 10_7mol/L兩個(gè)濃度梯度，Pb2+的初始濃度設(shè)計(jì)為 1.0Xl(T5mol/L、7.5X 10_6mol/L、5.0X 10_6mol/L、2.5Xl(T6mol/LU.25X l(T6mol/L、l.0X l(T6mol/L、5.0X l(T7mol/L、2.5 X l(T7mol/L、1.25 X l(T7mol/L、
1.0X 10_7mol/L10個(gè)濃度梯度，室溫下向10 ii L探針與450 u L超純水混合液中分別滴加40 u L各濃度的Pb2+溶液，檢測(cè)各濃度樣品對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，并以Pb2+的ii M濃度為橫坐標(biāo)x，260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)y，得到如圖4所示的線性關(guān)系曲線為:I y M以下的曲線為y=118.llx+57.268 ;luM以上的曲線為y=96.68x+82.37 ;由此實(shí)現(xiàn)探針對(duì)Pb2+定量檢測(cè)。4)在自來(lái)水中添加Pb (NO3) 2標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為1.5 X l(T7mol/L、
7.5X 10_7mol/L、l.5X10_6mol/L的樣品溶液。為了避免自來(lái)水中雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，配制的樣品溶液先用0.45 ii m和0.22 ii m的微孔濾膜過濾除去雜質(zhì)。然后用0.25 ii M探針檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度，通過計(jì)算出的Pb2+濃度平均值除以添加濃度，得出添加回收率，從而驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)用火焰原子吸收光譜測(cè)定添加回收率，通過與常規(guī)檢測(cè)方法的對(duì)比，說明此方法用來(lái)檢測(cè)Pb2+濃度的可行性。熒光核酸探針檢測(cè)自來(lái)水中鉛的添加回收率以及FAAS檢測(cè)自來(lái)水中鉛的添加回收率如下所示:探針檢測(cè)結(jié)果FAAS檢測(cè)結(jié)果的比較
權(quán)利要求
1.一種用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針，其特征在于，其DNA序列由以下:A)5’-FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3'，以及B)3’ -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5’ 所組成。
2.一種制備權(quán)利要求1所述探針的方法，其特征在于，用DNA/RNA合成儀分別合成設(shè)計(jì)好熒光標(biāo)記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，將酶:底物:水=1:1:78的體積比配成的混合液置于PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解后過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產(chǎn)物，得到雙鏈熒光探針。
3.一種基于權(quán)利要求1所述探針的重金屬鉛快速定性檢測(cè)方法，通過對(duì)比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的熒光強(qiáng)度，得到所述探針對(duì)于鉛離子的特異性結(jié)果，并通過熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)Pb2+的定性檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的定性檢測(cè)是指:在室溫下將5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無(wú)菌水490 u L均勻混合，掃描探針的背景熒光強(qiáng)度；隨后分別取40 y L濃度為5.0X 10_6mol/L的鎘、鋅、鎂、銅、錳、鉛6種二價(jià)金屬鹽的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無(wú)菌水450 u L均勻混合的探針溶液中，掃描熒光強(qiáng)度；根據(jù)探針中加入不同的金屬離子以后的熒光強(qiáng)度變化，確定探針對(duì)Pb2+的特異性，從而實(shí)現(xiàn)Pb2+的快速定性檢測(cè)。
5.一種基于權(quán)利要求1所述探針的重金屬鉛快速定量檢測(cè)方法，通過對(duì)探針中加入已知濃度的Pb2+，并且在260nm處掃描熒光強(qiáng)度，從而構(gòu)建出Pb2+濃度與熒光強(qiáng)度之間檢測(cè)體系及其線性關(guān)系曲線；隨后將待測(cè)樣品在260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度值帶入線性關(guān)系曲線，從而得到Pb2+的濃度并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，所述的探針對(duì)不同濃度的特異性的含有不同濃度的Pb2+離子的檢測(cè)體系是指:將熒光探針的初始濃度設(shè)計(jì)為2.5X10_7mOl/L、1.25X10_7mol/L 兩個(gè)濃度梯度，Pb2+ 的初始濃度設(shè)計(jì)為 1.0X l(T5mol/L、7.5Xl(T6mol/L、5.0X l(T6mol/L、2.5 X l(T6mol/L、1.25 X l(T6mol/L、1.0 X l(T6mol/L、5.0 X l(T7mol/L、2.5Xl(T7mol/L、l.25X 10_7mol/L、1.0X 10_7mol/L10 個(gè)濃度梯度，室溫下向 IOy L 探針與450 u L超純水混合液中分別滴加40 ii L各濃度的Pb2+溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的線性關(guān)系曲線是指:以Pb2+的PM濃度為橫坐標(biāo)x，260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)y，得到IyM以下的曲線為y =118.llx+57.268 ；luM 以上的曲線為 y=96.68x+82.37。
全文摘要
一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針及其檢測(cè)方法，通過對(duì)比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的熒光強(qiáng)度，得到所述探針對(duì)于鉛離子的特異性結(jié)果，并通過熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)Pb2+的定性檢測(cè)；通過對(duì)探針中加入已知濃度的Pb2+，并且在260nm處掃描熒光強(qiáng)度，從而構(gòu)建出Pb2+濃度與熒光強(qiáng)度之間檢測(cè)體系及其線性關(guān)系曲線；隨后將待測(cè)樣品在260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度值帶入線性關(guān)系曲線，從而得到Pb2+的濃度并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)過程簡(jiǎn)單快速，為是否需要進(jìn)行后續(xù)的精準(zhǔn)檢測(cè)提供依據(jù)，為加強(qiáng)我國(guó)環(huán)境和食品安全控制和監(jiān)督提供技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103160504SQ20131006618
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者周培, 邢海波, 戢太云, 詹學(xué)佳 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)