專利名稱：甘油發(fā)酵法制備1,3-丙二醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，一種甘油發(fā)酵法制備1，3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是有廣闊應(yīng)用前景的化工原料，主要用做聚醋和聚氨酯的單體以及溶齊U、抗凍劑或保護劑等。此外，1，3_丙二醇還可用作增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化劑的合成，也可作為產(chǎn)品中的組分如化妝品、打印機墨水、清潔劑、穩(wěn)定劑和燃料電池燃料等的添加劑來提高產(chǎn)品的性能。作為醫(yī)藥和有機合成的中間體，1，3_丙二醇可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。1，3-丙二醇作為中間體還生產(chǎn)多醇聚酯及作為碳鏈延伸劑，還可用于制備其它不飽和聚酯，如聚萘二甲酸丙二醇酯(PTN)和共聚聚酯以及制備新型聚氨酯樹脂等。1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物法，中國專利CN101134713A，CN1431183A等均是采用化學(xué)法，但是化學(xué)合成法副產(chǎn)物多，產(chǎn)品提純分離困難，生產(chǎn)成本高。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3_丙二醇以其利用再生資源、對環(huán)境污染小等特點越來越受到重視。目前生物合成法生產(chǎn)I,3-丙二醇存在產(chǎn)物濃度低，生產(chǎn)周期長和甘油轉(zhuǎn)化率低等問題，因此，采用廉價易得的原料，在溫和條件下制備I，3-丙二醇，對于提升I，3-丙二醇和下游產(chǎn)物的制備以及擴大應(yīng)用都有特別重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種合成由甘油發(fā)酵合成1，3_丙二醇的方法，實現(xiàn)1，3-丙二醇的條件溫和、成本低廉制備。本發(fā)明是這樣實 現(xiàn)的:將伊紐小單孢菌中sisl的3’，4’-雙脫羥基酶基因通過基因重組和DNA重排等技術(shù)得到2’ -脫羥基酶基因(sisll)。通過克隆得到sisll，隨后將其構(gòu)建到pET30a表達載體，并在E.coli BL21實現(xiàn)異源表達，構(gòu)建甘油脫水合成1，3_丙二醇(TOO)的工程菌BL21-sis，同時采用超分子自組裝模板法固定化，然后在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1，3_丙二醇，通過過濾發(fā)酵液、有機溶劑萃取等獲得產(chǎn)品1，3_丙二醇。具體技術(shù)方案如下:I)將伊紐小單孢菌中sisl的3’，4’ -雙脫羥基酶基因通過基因重組和DNA重排等技術(shù)得到2’ -脫羥基酶基因(sisll)，通過PCR方法加上生物磚標(biāo)準(zhǔn)化酶切位點EcoRI，hindIII并與生物磚骨架Pet30a連接，進行同義突變，完成生物磚元件Pet-sis的構(gòu)建；2)將構(gòu)建好的Pet-sis，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，甘油保種；3)進行發(fā)酵培養(yǎng)前先在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無菌注射器將種子液第I次接種于裝有種子培養(yǎng)基的血清瓶中再培養(yǎng)，將擴培的種子液第2次接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵后，得產(chǎn)物I，3-丙二醇。在步驟I)中，PCR儀、凝膠成像儀和蛋白電泳儀購自美國BIO-RAD公司。在步驟2)中，所述的伊紐小單孢菌購自買Takara公司，所述大腸桿菌BL21購買Takara 公司。
在步驟3)中，所述種子培養(yǎng)基可采用LB培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)的條件可為37°C、150r/min搖床培養(yǎng)；所述第I次接種的接種量可為5%;所述再培養(yǎng)的條件可為37°C、150r/min搖床培養(yǎng)；所述第2次接種的接種量可為10%;所述發(fā)酵的過程中可向發(fā)酵罐中通氮氣來維持體系的厭氧條件，并控制PH為6.8 ;所述發(fā)酵的過程中可加入補料混合溶液，所述補料混合溶液由甘油組成；所述分析發(fā)酵液中甘油和1，3-丙二醇濃度的方法可采用美國安捷倫高效液相色譜AgilentllOO分析發(fā)酵液中甘油和1，3_丙二醇濃度。在步驟3)中，在發(fā)酵過程中，可每間隔I 3h取樣，測定發(fā)酵液的菌體OD值，分析發(fā)酵液中甘油和1，3_丙二醇的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點在于將伊紐小單孢菌中sisl的3’，4’_雙脫羥基酶基因通過基因重組和DNA重排等技術(shù)得到2’ -脫羥基酶基因(sisll)。通過克隆得到sisll，將其構(gòu)建到pET30a表達載體，并在E.coli BL21實現(xiàn)異源表達，構(gòu)建甘油脫水合成1，3-丙二醇的工程菌BL21-sis，同時采用超分子自組裝模板法固定化，然后在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1，3_丙二醇。這種方法的益處在于大大突破了甘油生物法生產(chǎn)1，3_丙二醇甘油轉(zhuǎn)化率低的瓶頸，提高了底物轉(zhuǎn)化率，縮短了發(fā)酵時間，從而降低了生產(chǎn)成本，為微生物利用甘油發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的工業(yè)化奠·定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式通過以下實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實施例的限制。實施例1I)生物磚元件Pet-sis的構(gòu)建提取伊紐小單孢菌基因組，根據(jù)NCBI公布的依紐小單孢菌生物合成基因簇(FJ160413)基因序列設(shè)計合成PCR所需的引物。上游引物sisll 為:CCC AAGCTT TCACACCGAGATCTGC(HindiII)；下游引物sisI2 為:CCG GAATTC ATGGAACCAGGACTTG (EcoR I)。向200 μ L eppedoff管中，加入200pmol的dNTPs,上下游引物各20 μ mol,模板DNA約lng,5UFast Pfu DNA聚合酶，10 μ L5 X Fast Pfu酶Buffer,然后加無菌蒸懼水至總體積50 μ L0利用Biometra TProfessional PCR儀反應(yīng)參數(shù)是94°C預(yù)變性5min后,94。。變性45s，66.8°C退火45s，72。。延伸90s，30個循環(huán)，然后72°C延伸5min，得到PCR產(chǎn)物。提取質(zhì)粒Pet30a，經(jīng)HindIII/EcoR I雙酶切，連接前端載體片段和目的基因插入片段，得到質(zhì)粒Pet-sis轉(zhuǎn)化到DH5 α中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑單菌落，370C LB液體培養(yǎng)基200r/min震蕩培養(yǎng)14h。2)工程菌的構(gòu)建。提取質(zhì)粒Pet-sis，轉(zhuǎn)化到BL21中，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)24，挑單菌落，370C LB液體培養(yǎng)基200r/min震蕩培養(yǎng)14h得到工程菌BL21_sis。3)發(fā)酵培養(yǎng)(I)發(fā)酵方式:10L機械攪拌發(fā)酵罐，通氮氣分批發(fā)酵(2)培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉8 %，葡萄糖2 %，酵母粉8 %，硫酸鎂0.2%.碳酸鈣 0.2%，氯化鈷 2μ g.L-1，甘氨酸 0.2%, (NH4) 2S045g,iI pH7.0,0.1Mpa 滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):發(fā)酵培養(yǎng)基為添加15.0%甘油的LB培養(yǎng)基；再添加微量元素10mL/Lo微量元素溶液(/L)=ZnCl2,0.06g ；MnCl2.4Η20，0.2g ;Η3Β03，0.08g ；CoCl2.6Η20,0.1g ；CuCl2.2Η20，0.0lg ；NiCl2.6Η20，0.020g ；Na2MoO4.2Η20，0.040g。(3)發(fā)酵過程:發(fā)酵培養(yǎng):將擴培的種子液以9%的接種量接種于裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速HOrpm，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐中通氮氣來維持發(fā)酵體系的厭氧條件。pH控制:用濃度為2mol/LNa0H溶液自動調(diào)節(jié)為6.8。補料控制:根據(jù)分批發(fā)酵中甘油消耗與堿液消耗的比例關(guān)系，以甘油(折合后):NaOH =74: 9的比例(質(zhì)量比)配制混合溶液，補料時用該混合溶液代替單純的NaOH溶液，在調(diào)節(jié)pH的同時進行甘油流加，補料結(jié)束后換回單純的NaOH溶液，繼續(xù)消耗完發(fā)酵液中殘余的甘油。取樣分析:每間隔2h取樣，測定發(fā)酵液的菌體OD值，分析發(fā)酵液中甘油和1，3_丙
二醇濃度。4)發(fā)酵結(jié)果:從6h補料開始，發(fā)酵液中的甘油濃度一直維持在17g/L左右，1，3_丙二醇的濃度快速增加，Ilh左右菌 體生長進入穩(wěn)定期，15h時發(fā)酵結(jié)束，繼續(xù)補料，發(fā)酵液中仍然含有17.1 g/L的殘余甘油。發(fā)酵結(jié)束時I，3-丙二醇濃度為33.7g/L，轉(zhuǎn)化率為0.56g/g，生產(chǎn)強度為 2.25g/L。5)發(fā)酵產(chǎn)物的分離:發(fā)酵收獲后，離心分離和回收催化酶，發(fā)酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機濃縮后，得到I，3-丙二醇36.33g(收率80.7% )0實施例2各培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件同上。I)發(fā)酵過程:發(fā)酵培養(yǎng):將擴培的種子液以9%的接種量接種于裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速HOrpm，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐中通氮氣來維持發(fā)酵體系的厭氧條件。pH控制:用濃度為2mol/LNa0H溶液自動調(diào)節(jié)為6.4。補料控制:根據(jù)分批發(fā)酵中甘油消耗與堿液消耗的比例關(guān)系，以甘油(折合后):NaOH = 8: I的比例(質(zhì)量比)配制混合溶液，補料時用該混合溶液代替單純的NaOH溶液，在調(diào)節(jié)pH的同時進行甘油流加，補料結(jié)束后換回單純的NaOH溶液，繼續(xù)消耗完發(fā)酵液中殘余的甘油。取樣分析:每間隔2h取樣，測定發(fā)酵液的菌體OD值，分析發(fā)酵液中甘油和1，3_丙
二醇濃度。2)發(fā)酵結(jié)果:從8h補料開始，發(fā)酵液中的甘油濃度一直維持在19g/L左右，1，3_丙二醇的濃度快速增加，13h左右菌體生長進入穩(wěn)定期，18h時發(fā)酵結(jié)束，繼續(xù)補料，發(fā)酵液中仍然含有19.1 g/L的殘余甘油。發(fā)酵結(jié)束時I，3-丙二醇濃度為35.7g/L，轉(zhuǎn)化率為0.58g/g，生產(chǎn)強度為 2.35g/g/L。3)發(fā)酵產(chǎn)物的分離:發(fā)酵收獲后，離心分離和回收催化酶，發(fā)酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機濃縮后，得到 I，3-丙二醇36.33g(收率84.7% )0
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及1，3-丙二醇的合成，是將伊紐小單孢菌中SiSl的3'，4'-雙脫羥基酶基因通過基因重組和DNA重排等技術(shù)得到2'-脫羥基酶基因(sisll)。通過克隆得到sisll，隨后將其構(gòu)建到pET30a表達載體，并在E.coli BL21實現(xiàn)異源表達，構(gòu)建甘油脫水合成1，3_丙二醇(TOO)的工程菌BL21-sis，同時采用超分子自組裝模板法固定化，然后在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1，3_丙二醇，通過過濾發(fā)酵液、有機溶劑萃取等獲得產(chǎn)品1，3-丙二醇。
2.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于甘油脫脫羥基合成1，3_丙二醇的工業(yè)工程菌的構(gòu)建是由伊紐小單孢菌中sisl突變得到sisll，使用基因重組和DNA重排技術(shù)，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌BL21。
3.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于采用超分子自組裝模板對甘油脫氫合成1，3-丙二醇的工業(yè)工程菌固定化，并在酸性水溶液中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
4.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于將經(jīng)固定化的甘油脫氫合成1，3_丙二醇的工業(yè)工程菌，在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1，3-丙二醇，發(fā)酵的工藝技術(shù)條件為溫度為25-370C >200r/min 振蕩培養(yǎng)時間 21_26h。
5.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于發(fā)酵液先經(jīng)過濾分離催化酶重復(fù)使用，利用乙酸丁酯萃取獲得產(chǎn)品I ，3-丙二醇。
全文摘要
一種生物法發(fā)酵法制備1,3-丙二醇(PDO)的生產(chǎn)工藝，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將伊紐小單孢菌中sisI的3′,4′-雙脫羥基酶基因通過基因重組和DNA重排等技術(shù)得到2′-脫羥基酶基因(sisII)。通過克隆得到sisII，隨后將其構(gòu)建到pET30a表達載體，并在E.coli BL21實現(xiàn)異源表達，構(gòu)建甘油脫水合成1,3-丙二醇的工程菌BL21-sis，同時采用超分子自組裝模板法固定化，然后在含有甘油的培養(yǎng)基中發(fā)酵合成1,3-丙二醇，通過過濾發(fā)酵液、有機溶劑萃取等獲得產(chǎn)品1,3-丙二醇。該制備1,3-丙二醇的方法，具有生產(chǎn)周期短，所需設(shè)備簡單，環(huán)境友好，操作簡單易控，原料廉價等優(yōu)點，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有重大的實用價值。
文檔編號C12R1/29GK103146766SQ20131006991
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者蔡佩君, 趙云, 拾沖, 譚靜萍, 李 榮, 李成軍, 趙明光 申請人:徐州凱米克新材料有限公司