專利名稱：大胡蜂鎮(zhèn)靜肽前體基因及其編碼的多肽和制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的蜂毒基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體(Preprosecapin)基因的cDNA序列，該cDNA序列編碼的多肽是意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，該多肽經(jīng)過翻譯后加工所得到的多肽(成熟肽)是意大利蜜蜂鎮(zhèn)靜肽(Secapin)的同系物。本發(fā)明還涉及有該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的制備方法。
背景技術：
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒鎮(zhèn)靜肽(Bee venomous Secapin)是意大利蜜蜂蜂毒的四個多肽之一，約占蜂毒干重的1％，由25個氨基酸組成(Eur.J.Biochem.1978，83405-410；Abstr.15 Eur.Pepetide.Symp.1978，p84)。按來源和生化性質(zhì)，它屬堿性多肽，Secapin其生物活性與溶血肽相似，具有消炎、抗菌、降壓、鎮(zhèn)靜等作用(Eur.J.Biochem.1978，83405-410)。
1984，Vlask和Kreil將意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位點，用32p標記的cDNA探針篩選出陽性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亞隆到PUC8，得到了蜂毒Preprosecapin基因，對該基因的測序結(jié)果進行氨基酸序列推導，獲77個氨基酸殘基，其中最后25個氨基酸殘基與已知Secapin氨基酸序列一致，前32個氨基酸殘基為信號肽，中間20個氨基酸為極性肽前體，Preprosecapin基因經(jīng)過翻譯后加工，即在蜜蜂的毒囊中經(jīng)過蜜蜂體內(nèi)一種水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin(Eur.J.Biochem.1984.145279～242.)。Secapin與其他幾種蜂毒多肽在醫(yī)學與生物物理學上有重要的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因的多核苷酸，該多核苷酸編碼意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的一個同系物，該前體蛋白經(jīng)加工后得到的活性多肽為意大利蜜蜂Secapin多肽的一個同系物。
本發(fā)明目的之二是提供一種新的意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，該多肽為大胡蜂Preprosecapin蛋白。
本發(fā)明目的還提供了這種制備大胡蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸探針、含大胡蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸的重組載體、含重組載體的宿主細胞，以及多肽抗體的方法。
在本發(fā)明，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸雜交，較佳地，該多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列。
在本發(fā)明還提供了一種分離的大胡蜂蜂毒Secapin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA；一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
本發(fā)明還提供了一種制備具有大胡蜂蜂毒Secapin活性多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成大胡蜂蜂毒Preprosecapin表達載體，所述的核苷酸序列與SEQID No.5核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的重組細胞；(c)在適合表達大胡蜂蜂毒Preproecapin蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有大胡蜂蜂毒Secapin蛋白活性的多肽。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白基因，該基因所編碼的Preprosecapin多肽(大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體)經(jīng)過胡蜂體內(nèi)一種水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin，此活性多肽是一種生物活性物質(zhì)，可應用于醫(yī)學上的關節(jié)炎、神經(jīng)性疾病、吸毒等的輔助治療，可作為抗原用于蜂毒免疫制劑的制備，可作為生物學研究的工具酶。大胡蜂Preprosecapin基因可為研究大胡蜂蜂毒免疫的分子機理，為開發(fā)利用大胡蜂蜂毒資源提供新的依據(jù)。
具體實施例方式
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為234個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID No.5，開放讀框位于1～234位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來；還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術語“大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)的核苷酸序列，如SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指位于SEQ ID No.5序列的編碼框1～234位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列同源性低至約70％簡并序列也能編碼出SEQ ID No.6所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ IDNo.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與大胡蜂蜂毒Preprosecapin相同功能的蛋白的、SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“大胡蜂蜂毒Secapin蛋白多肽”指具有大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白活性的SEQ ID No.6序列53-77的多肽。該術語還包括具有與大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白相同功能的、SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導突變體，在高或低的嚴謹度條件下能與大胡蜂蜂毒Preprosecapin DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽的可溶性片段。
發(fā)明還提供大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白或多肽的類似物，這些類似物與天然大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)大胡蜂蜂毒Preprosecapin的表達。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽編碼序列的8～100個，較佳地1～50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼大胡蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸分子。
本發(fā)明還包括檢測大胡蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于大胡蜂蜂毒Preprosecapin多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如Tn細胞、CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對大胡蜂蜂毒Preprosecapin或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的分子，也包括那些并不影響大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自大胡蜂的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備，例如，純化的大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達大胡蜂蜂毒Preprosecapin或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來制備抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷大胡蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗體以及不影響大胡蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術而獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.coli)中制備的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
在本發(fā)明的一個實施例中，大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以大胡蜂毒腺和毒囊總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’為正向向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’為反向引物，進行PCR。對擴增產(chǎn)物進行測序后得到SEQ ID No.5的全長cDNA序列。
大胡蜂蜂毒Preprosecapin為大胡蜂毒腺表達的蛋白，本發(fā)明的大胡蜂蜂毒Preprosecapin為研究大胡蜂蜂毒相關的分子機理提供了基礎。
下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1，大胡蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA的克隆和測定1.引物擴增以大胡蜂毒腺、毒囊總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ IDNo.1)為正向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)為反向引物，進行PCR。A/B的PCR條件為94℃ 1分鐘，隨之以94℃40秒鐘，54℃40秒鐘和72℃60秒鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，電泳檢測得到約250 bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴增產(chǎn)物A/B與pGEM-T Easy載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用堿法提取質(zhì)粒，用BigDye terminator v2.0。測序試劑盒(Epicentre Teclnologies)對抽提的質(zhì)粒進行測序，獲得cDNA序列，全長共234bp，詳細序列見SEQ ID No.5，其中開放讀框位于1～234位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導出大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的氨基酸序列，共77個氨基酸殘基(包括25個氨基酸的成熟肽、32個氨基酸的信號肽和20個氨基酸的前體肽)，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.6。
實施例2，同源比較用本發(fā)明的大胡蜂蜂毒Preprosecapin的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用Blast程序進行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin有顯著的同源性。用Blast軟件分析可以看出，它們蛋白的同源性為93％(見附表1)。因此，可以推測本發(fā)明的大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白為意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的同系物，并具有類似的功能。
1984，Vlask和Kreil將意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pstI和ClaI位點，用32P標記的cDNA探針篩選出陽性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亞隆到PUC8，對測序結(jié)果進行氨基酸序列推導，獲得了編碼意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的新基因。該cDNA所編碼的Preprosecapin成熟肽Secapin、信號肽和前原肽為77個氨基酸殘基。Secapin和另外的幾種蜂毒肽混合物，目前在醫(yī)學上應用于心血管、支氣管、腫瘤等輔助治療的生物活性物質(zhì)，也是一類抗菌抗輻射生物活性物質(zhì)。另外Secapin和另外的幾種蜂毒肽還是一類提高人免疫功能的生物活性物質(zhì)。本發(fā)明人的大胡蜂Preprosecapin基因為研究大胡蜂蜂毒過敏、免疫的分子機理，為開發(fā)利用大胡蜂蜂毒資源提供了新的依據(jù)。
實施例3，大胡蜂蜂毒Preprosecapin成熟肽Secapin在真核細胞(Tn細胞株，即粉紋野蛾細胞株)中的表達在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產(chǎn)物作為插入片段。
PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ ID No.1)，該引物含有Xhol I限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是起始密碼子開始的大胡蜂蜂毒Preprosecapin編碼序列的24個核苷酸；3’端引物序列為5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)，該引物含有Hind III限制性內(nèi)切酶的酶切位點，翻譯終止子和大胡蜂蜂毒Preprosecapin的部分編碼序列。
引物上限制性內(nèi)切酶酶切位點對應于Tn細胞表達載體pBacFastHTb上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gmr)，一個噬菌體復制起點(Ori)、一個病毒復制起點(SV40)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)，一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用XholI和Hind III消化pBacFastHTa載體及插入片段，隨后用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化E.coli TG I菌株，在含有Ampr和Gmr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，補加Ampr和Gmr的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，測序驗證大胡蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA片段已正確插入了載體。隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac菌株，在含有Ampr、Gmr、四環(huán)素的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Ampr、Gmr、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)Sepharose 2B柱純化，回收質(zhì)粒-70℃保存。2B柱純化，回收質(zhì)粒-70℃保存。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tn細胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞及細胞上清，含重組病毒粒子的細胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2-3周的TC-100連續(xù)傳代培養(yǎng)，收集細胞，用超聲裂解法破碎細胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液為平衡液及洗脫液，蛋白液用經(jīng)預平衡的Ni2+Sepharose 6B柱過柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去雜蛋白，專一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液進行洗脫。然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用10％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為2.8KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。實施例4，大胡蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的成熟肽Secapin在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以SEQ ID No.5中的核苷酸1～234位的核苷酸雜交PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GGATCCTTACATTATTGATGTTCCT-3’(SEQ ID No.5)，該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的酶切位點，大胡蜂蜂毒Preprosecapin編碼的成熟肽序列的18個核苷酸；3’端引物序列為5’-CGGGAATTAAGGCACTATGACTCT-3’(SEQ ID No.6)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點，翻譯終止子和大胡蜂蜂毒Preprosecapin的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pGEX-4T-3上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(Ori)、一個IPTG可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)，一個凝血酶識別位點，一個谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融和蛋白標記物以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pGEX-4T-3載體并保持開放讀框在凝血酶識別位點起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化商品名為JM105的E.coli菌株，JM105含有多拷貝的重組質(zhì)粒，其表達lacIq阻遏物并攜帶抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證大胡蜂蜂毒Secapin的cDNA片段，該序列為SEQ ID No.5序列的160～234，與已正確插入了載體。
在補加Ampr(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶10的稀釋率稀釋，然后接種到大體積LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.6-1.0時，加IPTG(“異丙基硫代-β-D半乳糖苷”)至終濃度為1.0mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-5小時，離心收集細胞沉淀，重懸于1/20體積比的PBS中，通過超聲波裂解細胞，加入TritonX-100到終濃度1％30min溶解蛋白。低溫離心粗提物(10000g)5min，上清物用谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)純化單元從溶液中純化溶解的谷光甘肽-大胡蜂蜂毒Secapin融合蛋白，并將大胡蜂蜂毒Secapin從融和蛋白上切割下來。大胡蜂蜂毒Secapin蛋白用15％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達該蛋白的分子量大小為約2.8KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的核苷酸序列；所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ No.6所示的序列；該序列具有SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列。
3.一種分離的大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白，其特征在于，它具有SEQ IDNo.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，該多肽具有SEQ IDNo.6序列。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
5.一種宿主細胞，其特征在于，它是用權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
6.一種具有大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物活性多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白多肽表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中表達的載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白的重組細胞；(c)在適合表達大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白基因產(chǎn)物活性多肽鎮(zhèn)靜肽。
7.一種抗體，其特征在于，它是能與權(quán)利要求3所述的大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體蛋白特異性結(jié)合的抗體。
8.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8～100個連續(xù)核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子；其特征在于是指能與大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體基因產(chǎn)物或片斷結(jié)合但不識別和結(jié)合與其它不相關抗原分子的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子，其特征在于，它具有大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體多肽編碼序列中15～20個連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大胡蜂蜂毒鎮(zhèn)靜肽前體(Preprosecapin)基因序列及其編碼的多肽和該基因經(jīng)過翻譯后加工產(chǎn)物鎮(zhèn)靜肽(Secapin)的制備方法。該cDNA序列編碼的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的一個同系物，它與SEQ ID No.5中從核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性。所述序列編碼—具有SEQ ID No.6所示序列的多肽。此外，還提出了含大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因的載體、宿主細胞，與大胡蜂蜂毒Preprosecapin基因相關的抗體，具有蛋白活性大胡蜂蜂毒Secapin的多肽、相關抗體的制備方法。本發(fā)明為進一步研究Secapin相關的多肽活性分子機理，開發(fā)與Secapin相關的生物醫(yī)藥、診斷試劑及生物試劑打下了基礎。
文檔編號C07H21/04GK1400309SQ02110749
公開日2003年3月5日 申請日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者張素方, 張傳溪, 施婉君, 程家安, 沈立榮 申請人:浙江大學