一種虎紋蛙抗菌肽及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種虎紋蛙抗菌肽及其編碼基因與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著傳統(tǒng)抗生素抗藥性的產(chǎn)生，人們開(kāi)始日益關(guān)注抗菌肽的研究。抗菌肽 是具有抗菌活性的一類(lèi)短肽，廣泛存在于生物界，是先天免疫的重要防御物質(zhì)，具有廣譜抗 菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲(chóng)及抗腫瘤等生物活性，且不易產(chǎn)生耐藥性，作用機(jī)制具有抗生 素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，能夠殺滅已產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，并能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而不破壞 正常細(xì)胞。兩棲類(lèi)動(dòng)物的皮膚在自然進(jìn)化過(guò)程中形成了抵御病原微生物感染的三套防御 系統(tǒng)，而皮膚抗菌肽是其先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。兩棲類(lèi)作為一類(lèi)古老的生物，它 們的后天獲得性免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物相比極為脆弱，它們?cè)陂L(zhǎng)期的進(jìn)化歷程中演化形成了 一套非常有效的抵御微生物侵襲的防御系統(tǒng)，其中蛙皮抗菌肽是其先天防御系統(tǒng)的主要成 分，具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。
[0003] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色鏈球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、 綠膿桿菌變形桿菌、草綠色鏈球菌、乙型溶血鏈球菌等40多個(gè)屬均有抑制效果，部分抗菌 肽對(duì)真菌有殺傷或殺滅作用。來(lái)源于非洲爪蟾的抗菌肽magainin以及來(lái)源于中國(guó)大蹼鈴 蟾的抗菌肽maximin在微摩爾濃度水平就對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示不同程度的殺傷作用。來(lái)源于日 本馬氏蟹血淋巴的抗polyphemusins和tachyplesin，在濃度5iig/mL時(shí)就對(duì)艾滋病病毒顯 示出一定的抑制作用。來(lái)源于中國(guó)大暖鈴蟾皮膚的抗菌maximin3在濃度為1.5iig/mL時(shí) 對(duì)抗艾滋病病毒的選擇系數(shù)為7. 6。這是首次報(bào)道的兩棲類(lèi)動(dòng)物來(lái)源的抗艾滋病病毒抗菌 肽。另外，從南美葉泡蛙皮膚得到的抗菌肽dermas印tin對(duì)疤疹病毒也顯示強(qiáng)烈的抑制作 用。來(lái)源于蜜蜂的蜂毒肽melitin具有強(qiáng)烈的紅細(xì)胞溶解活性；來(lái)源于兩棲類(lèi)動(dòng)物的抗菌 肽，如中國(guó)大暖鈴蟾的抗菌肽maximinH和東方鈴蟾的抗菌肽bombinH也顯示了強(qiáng)烈的紅 細(xì)胞溶解活性。maximinH在50iig/mL時(shí)就可以導(dǎo)致兔紅細(xì)胞100%的溶解。從兩棲類(lèi)動(dòng) 物Pseudisparadoxa得到的抗菌肽pseudin對(duì)控制蝌M尾部形態(tài)變化的細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié) 作用。Pseudin在結(jié)構(gòu)上與一種細(xì)胞凋亡因子DEFY的一段區(qū)域顯示出很高的相似性。
[0004] 利用虎紋蛙資源進(jìn)行虎紋蛙抗菌肽基因的CDNA克隆、序列分析的研究，如果能從 虎紋蛙皮膚中獲得具有重要價(jià)值的生物活性物質(zhì)，必將拓寬虎紋蛙的開(kāi)發(fā)、利用新途徑，具 有重要的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)喚起人們對(duì)兩棲類(lèi)皮膚生物活性肽，尤其是我國(guó)特色物種的特殊 分子多樣性的關(guān)注，及重視它們?cè)谏飳W(xué)、生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和天然藥物開(kāi)發(fā)中的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種虎紋蛙抗菌肽。
[0006] 本發(fā)明的之一目的在于提供上述虎紋蛙抗菌肽的編碼基因。
[0007] 本發(fā)明的之一目的提供上述虎紋蛙抗菌肽在做為制備病原微生物感染疾病的治 療藥物方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供虎紋蛙抗菌肽的編碼基因在治療病原微生物感染疾 病方面的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種虎紋蛙抗菌肽，其序列如SEQIDNO:2所示。其中，本 發(fā)明中的虎紋蛙抗菌肽（Frogl-蛋白）是中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物虎紋蛙基因編碼的一種單鏈多 肽，分子量1367. 673Da，等電點(diǎn)6. 04。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述虎紋蛙抗菌肽的編碼基因，其序列如SEQIDNO:1所示。 該編碼基因的全氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其中，所述虎紋蛙抗菌肽為該編碼基因的 第177?213位核苷酸。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述虎紋蛙抗菌肽在做為制備病原微生物感染疾病的治療 藥物方面的應(yīng)用，以及虎紋蛙抗菌肽的編碼基因在治療病原微生物感染疾病方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種虎紋蛙抗菌肽及其編碼基因與應(yīng)用，通過(guò) 對(duì)虎紋蛙抗菌肽總RNA提取、RNA濃度測(cè)定、RNA反轉(zhuǎn)錄、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增篩選虎紋蛙抗 菌肽、RACE擴(kuò)增虎紋蛙抗菌肽基因3'端和5'端的引物設(shè)計(jì)等，獲得虎紋蛙抗菌肽基因極 其編碼的虎紋蛙抗菌肽。其中，虎紋蛙抗菌肽基因擴(kuò)增引物為：
[0013]CaSPI-F: 5 ' -ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT-3 '，
[0014]CaSPI-R: 5 ' -ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3 '。
[0015] 所獲陽(yáng)性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定，虎紋蛙抗菌肽編碼基因如SEQID NO:1所示，虎紋蛙抗菌肽如SEQIDNO:2所示，虎紋蛙抗菌肽是一種單鏈多肽，分子量 1367. 673Da，等電點(diǎn)6. 04?；⒓y蛙抗菌肽編碼基因的全氨基酸序列如SEQIDNO:3所示， 其中，所述虎紋蛙抗菌肽為該編碼基因的第177?213位核苷酸。
[0016] 虎紋蛙抗菌肽基因作為基因工程制備虎紋蛙抗菌肽的應(yīng)用。
[0017] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明由虎紋蛙抗菌 肽編碼基因利用生物信息學(xué)方法推導(dǎo)其成熟抗菌肽氨基酸一級(jí)序列，人工合成的虎紋蛙抗 菌肽具有顯著的抗菌作用；本發(fā)明虎紋蛙抗菌肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系 廣、抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中3 'RACEPCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1虎紋蛙抗菌肽基因的克隆
[0021] 1、虎紋蛙皮膚黏液總RNA提取
[0022] 提取所用離心管、槍頭、槍盒等均經(jīng)0. 1%DEPC水浸泡過(guò)夜并高壓滅菌處理，所用 研缽、玻璃勻漿器、鑷子及剪刀均經(jīng)180°C高溫處理2. 5h。
[0023] 具體操作步驟為：
[0024] 取虎紋蛙皮膚黏液樣品約IOOmg加入液氮研磨成粉末，倒入玻璃勻漿器中
[0025] 丨加入ImlTrizolReagent進(jìn)一步研磨樣品
[0026] 將勻漿樣品轉(zhuǎn)移至I. 5mlEP管（DEPC管）15?30°C放置5min
[0027] 丨加入 200111氯仿，劇烈振蕩3!^11，41：，12000\8離心15111111
[0028] 吸取上清至新離心管并加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置IOmin
[0029] 丨 4°C，12000Xg離心IOmin
[0030] 棄上清并加入Iml75 %的乙醇清洗沉淀
[0031] I4°C，7500Xg離心IOmin
[0032] 棄上清，室溫放置干燥，加DEPC水20?50ill溶解，_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 2、RNA濃度測(cè)定：
[0034] 取Iill上述溶于DEPC水的總RNA置于Nanodrop2000c測(cè)定RNA濃度。根據(jù)所 測(cè)RNA濃度調(diào)整反轉(zhuǎn)錄時(shí)所加RNA模板用量為Iiig。
[0035] 3、RNA反轉(zhuǎn)錄：
[0036] 按照如下配制cDNA合成反應(yīng)體系并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種虎紋蛙抗菌肽，其特征在于，其序列如SEQ ID NO :2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的虎紋蛙抗菌肽的編碼基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO :1所 /Jn 〇
3. 權(quán)利要求1所述的虎紋蛙抗菌肽在做為制備病原微生物感染疾病的治療藥物方面 的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求2所述的虎紋蛙抗菌肽的編碼基因在治療病原微生物感染疾病方面的應(yīng) 用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種虎紋蛙抗菌肽及其編碼基因與應(yīng)用，該虎紋蛙抗菌肽的序列如SEQ？ID？NO：2所示，其編碼基因SEQ？ID？NO：1所示；該虎紋蛙抗菌肽及其編碼基因可用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物。本發(fā)明虎紋蛙抗菌肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系廣、抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-12, C07K7-08, A61K38-10, A61P31-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104558121
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410852075
【發(fā)明人】梁化亮, 胡炎, 楊書(shū)婷, 王立, 王海燕, 施夢(mèng)倩, 曾慶瑞, 蒯強(qiáng)
【申請(qǐng)人】常熟理工學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日