專利名稱：曲霉屬菌株與內(nèi)切殼聚糖酶的編碼基因、制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的基因序列及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該內(nèi)切殼聚糖酶的重組質(zhì)粒和重組基因工程菌株。本發(fā)明的內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加及醫(yī)藥等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖(chitosan)，又名聚氨基葡萄糖、殼多糖、脫乙酰甲殼素、脫乙酰甲殼質(zhì)、可溶性幾丁質(zhì)、殼糖胺、甲殼多聚糖和聚甲殼糖等，化學(xué)名為聚β - (I — 4) -2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。殼聚糖是幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙 ?；玫降漠a(chǎn)物，一般幾丁質(zhì)的脫乙酰度超過50%時(shí)被認(rèn)為是殼聚糖。殼聚糖廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲外殼以及藻類和菌類的細(xì)胞壁中。由于其分子量較大，水溶性差，使其廣泛應(yīng)用受到了很大限制。但其降解產(chǎn)物，一系列殼寡糖和氨基葡萄糖具有獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗菌、降低膽固醇和促進(jìn)鈣的吸收，且易溶于水，是一種新興的功能性低聚糖，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，制備殼寡糖的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法。但化學(xué)條件苛刻，反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差，產(chǎn)物聚合度不易控制，污染嚴(yán)重，不易得到聚合度相對(duì)均一的低聚殼寡糖。物理法得到的產(chǎn)物聚合度也不易控制，其重復(fù)性也較差，所以溫和、高效、產(chǎn)物易控制和穩(wěn)定無污染的生物法逐漸引起了人們的關(guān)注。生物法制備殼寡糖是利用自然界中存在的生物，特別是微生物產(chǎn)生的各種殼聚糖酶來降解殼聚糖，如何獲得高產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株和聞酶活的殼聚糖酶的研究備受:關(guān)注。殼聚糖酶分布非常廣泛，目前已從細(xì)菌(如:Bacillus、Myxobacter>Enterobacter)、放線菌(如:Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(如:Aspergillus、Penicillium)、病毒(如chlorella virus PBCV_1、CVK_2)及植物的不同組織中檢測(cè)到殼聚糖酶的存在。目前殼聚糖酶的分類有兩種方式。一是根據(jù)酶對(duì)糖苷鍵的水解分類，根據(jù)酶的底物特異性將殼聚糖酶分為3類:第I類主要是可以水解GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN糖苷鍵的殼聚糖酶，如來自Bacillus pumilus BN-262和Streptomyces sp.N174的殼聚糖酶；第2類只能水解GIcN-GIcN鍵，產(chǎn)生這一類酶的菌株目前只有Bacillus sp.N0.7_M ;第3類既可水解GIcN-GIcN鍵，又可水解GlcN-GlcNAc鍵，產(chǎn)酶菌株包括S.gmeus HUT6037和B.circulansMH.Kl等。即殼聚糖酶1、I1、III類。二是根據(jù)酶的氨基酸序列分類，殼聚糖酶主要分布在糖苷水解酶家族5、8、46、75和80五個(gè)家族。其中細(xì)菌來源的殼聚糖酶主要屬于46家族，真菌來源的殼聚糖酶主要屬于75家族。兩族殼聚糖酶同源性差，而目前細(xì)菌來源的殼聚糖酶研究較多，對(duì)于真菌，尤其是來源于棒曲霉的殼聚糖酶研究較少。目前來源于棒曲霉的殼聚糖酶基因的克隆與表達(dá)未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)殼聚糖酶的曲霉屬菌株，其為棒曲霉W-2，分類命名:棒曲霉 Aspergillus clavatus,保藏編號(hào):CGMCC N0.7018。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種新型高效的內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2及其編碼基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備新型高效內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的方法。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有所述的內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2基因的基因工程表達(dá)體系。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供新型高效內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2在殼聚糖降解中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2，來源于土壤中分離純化的曲霉屬菌株Aspergillus clavatus w_2,其氨基酸序列具有如下特征之一:I)序列表中SEQ ID N0.3從氨基端開始的第1_242或第18-242位氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID N0.3從氨基端開始的第1_242或18-242位氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加后，具有降解殼聚糖活性的蛋白質(zhì)；3)與序列表中SEQ ID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性達(dá)到90%及以上且具有降解殼聚糖活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的編碼基因(命名為csnW2)，具有下述核苷酸序列特征之一:I)具有序列表中SEQ ID N0.1的核糖核酸(RNA)序列和SEQ ID N0.2的脫氧核糖核酸(DNA)序列；2)編碼SEQ ID N0.3氨基酸序列的脫氧核糖核酸(DNA)序列；3)具有與序列表中SEQ ID N0.2所限定的脫氧核糖核酸(DNA)序列的同源性達(dá)到90%及以上，且能編碼降解殼聚糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸(DNA)序列。本發(fā)明的殼聚糖酶CsnW2的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列也可以根據(jù)預(yù)測(cè)的Csnff2的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列人工合成獲得。制備重組酶CsnW2的方法，是將編碼基因csnW2克隆入重組表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)的內(nèi)切殼聚糖酶。所述的重組表達(dá)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的表達(dá)載體可以是大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、枯草桿菌表達(dá)載體、乳酸菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體等。 用于重組表達(dá)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，可以是大腸桿菌宿主細(xì)胞(如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5 α 等)、酵母菌宿主細(xì)胞(如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis 等)、枯草桿菌宿主細(xì)胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主細(xì)胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細(xì)胞(如 Streptomyces spp.等)、絲狀真菌宿主細(xì)胞(如 Trichoderma viride, Trichodermareesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等)、昆蟲細(xì)胞(如 Bombyx mori,Antharaea eucalypti等)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0，幼小倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞BHK、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL等)。
本發(fā)明的CsnW2來源于土壤中分離純化的曲霉屬菌株Aspergillus clavatusw-2。其基因和氨基酸序列通過Race的方法克隆得到。具體方法:(I)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2其3’端mRNA序列的克隆。真菌18S及形態(tài)觀察初步鑒定菌株為棒曲霉。通過對(duì)同源性較近的菌株中殼聚糖酶的序列進(jìn)行同源比對(duì)。找出約7個(gè)氨基酸的保守序列；再對(duì)對(duì)應(yīng)的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)一條簡(jiǎn)并引物。提取棒曲霉w-2的總RNA，按照Takara RNA PCR Kit (Ver.3.0)說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化ToplO，經(jīng)PCR鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部測(cè)序，得到3’端mRNA序列。(2)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2其5’端mRNA序列的克隆:基于上述方法得到的3’端mRNA,設(shè)計(jì)兩條反向引物。按照 Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書進(jìn)行5’ RACE。經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化ToplO，經(jīng)PCR鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部測(cè)序，得到5’端mRNA序列。(3)將3’和5’ Race結(jié)果進(jìn)行拼接，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在NCBI上對(duì)開放閱讀框分析，進(jìn)而推導(dǎo)出內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的氨基酸序列。設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化ToplO，經(jīng)PCR鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部測(cè)序，得到全長(zhǎng)序列。上述內(nèi)切殼聚糖酶基因編碼區(qū)長(zhǎng)729bp，編碼了 262個(gè)氨基酸，分子量約29kD，屬于殼聚糖酶家族75。畢赤酵母重組表達(dá)獲得的CsnW2，以殼聚糖為底物時(shí)，在40°C _60°C、pH3.5-5.0的條件下具有較高活性。本發(fā)明提供的殼聚糖酶CsnW2可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加和醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有較大的生產(chǎn)潛力和 經(jīng)濟(jì)價(jià)值。序列表SEQ ID N0.1 AUGCGCUAUCUUGCAACUGCUGCCGUUUUGGCUGGAGCAGGCCUGGCCUCGGCCUAUAGUGUCCCAGCCAACCUACAGCAAAUCUAUAACAAACACAAGACCGGAACAUGCCAGAACAAGCUGCAAGACGGUUUUUCCGAUGGCAUCAGCGGCCCCGGCACCUCCGCCUACUGCGGCGACAUCCAGGGGGCGAUCUUCCUUCUAGCUCCGCCAAUGGCGGCCA⑶AUGAUAACAUGGACAUUGACUGCGAUGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACUGUGCGAAUGAUCCCUCCGGCCAGAGCAUGACGGC⑶UCAUGGAUACGGUGAAGCAAUACGGCAUUUCGGAUCUGGACGCCAACAUCCACCCGUACGUGGUGUUUGGUAACUCGGGCAGCUCGCCG
ACCUUUGAUCCUCAGCA⑶AUGGAAUGCAGCC⑶UAAGCGUGAUGGCUGUGGUGUGCAAUAAUCAGCUGUUCUAUGGUGUCUGGG⑶GACACCAACG⑶GAUAUCGCUACUGGGGAGGCUUCCAUCUCGCUGGCCAAAU 腳⑶ UUCCCCAAUGAUG ⑶ A
UCACCG ⑶ GACAAUGGCCAUGACCAGGACGA 腳 ACUCUACAUUGGGUUUACGGGGCAGGAUACUGUCCCCGGUGCUAGUGCUGCCUGGACUGCUAGCGACACUUCAACCUUUGAGGAGA⑶AUCAAGG ⑶ CUCG ⑶ GAUCGCCU 腳 UGCUAAGCUUAGCGCUUAASEQ ID N0.2ATGCGCTATCTTGCAACTGCTGCCGTTTTGGCTGGAGCAGGCCTGGCCTCGGCCTATAGTGTCCCAGCCAACCTACAGCAAATCTATAACAAACACAAGACCGGAACATGCCAGAACAAGCTGCAAGACGGTTTTTCCGATGGCATCAGCGGCCCCGGCACCTCCGCCTACTGCGGCGACATCCAGGGGGCGATCTTCCTTCATAGCTCCGCCAATGGCGGCCAGTATGATAACATGGACATTGACTGCGATGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACTGTGCGAATGATCCCTCCGGCCAGAGCATGACGGCGTTCATGGATACGGTGAAGCAATACGGCATTTCGGATCTGGACGCCAACATCCACCCGTACGTGGTGTTTGGTAACTCGGGCAGCTCGCCGACCTTTGATCCTCAGCAGTATGGAATGCAGCCGTTAAGCGTGATGGCTGTGGTGTGCAATAATCAGCTGTTCTATGGTGTCTGGGGTGACACCAACGGTGATATCGCTACTGGGGAGGCTTCCATCTCGCTGGCCAAATTGTGTTTCCCCAATGATGGTATCACCGGTGACAATGGCCATGACCAGGACGATGTACTCTACATTGGGTTTACGGGGCAGGATACTGTCCCCGGTGCTAGTGCTGCCTGGACTGCTAGCGACACTTCAACCTTTGAGGAGAGTATCAAGGGTCTCGGTGATCGCCTTGTTGCTAAGCTTAGCGCTTAASEQ ID N0.3MRYLATAAVLAGAGLASAYSVPANLQQIYNKHKTGTCQNKLQDGFSDGISGPGTSAYC⑶IQGAIFLHSSANGGQYDNMDIDCDGANNS
GGDCANDPSGQSMTAFMDTVKQYGISDLDANIHPYVVFGNSGSSPTFDPQQYGMQPLSVMAVVCNNQLFYGVWGDTNGDIATGEASISLAKLCFPNDGITCDNGHDQDDVLYIGFTGQDTVPGASAAWTASDTSTFEESIKGLGDRLVAKLSA


圖1:重組內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2表達(dá)及純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是:M:蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)物(marker),條帶自上至下大小為170kD, 130kD,IOOkD, 70kD, 55kD, 40kD, 35kD, 25kD ;泳道 1:發(fā)酵液上清，上樣量 20 μ 1，泳道 2:1OOmmol 的咪唑洗脫收集液，上樣量20 μ I。圖2:ρΗ值對(duì)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的活性影響曲線。圖3:溫度對(duì)內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的活性影響曲線。 圖4:殼聚糖酶CsnW2降解殼聚糖所得產(chǎn)物的HPLC圖
曲霉屬的菌株,其為棒曲霉W-2,分類命名:棒曲霉Aspergillus clavatus,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明制備該新型殼聚糖酶的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該新殼聚糖酶的基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體上，獲得可異源表達(dá)該酶的畢赤酵母重組菌株，用該菌株異源表達(dá)制備的殼聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40°C _60°C下有較高活性，具有降解殼聚糖制備殼寡糖的功能。實(shí)施例1曲霉屬菌株Aspergillus clavatus W-2的培養(yǎng)及生產(chǎn)殼聚糖酶所米用的菌種為棒曲霉，挑取Aspergillus clavatus W-2 菌株(CGMCC N0.7018)的單克隆接種到30ml液體培養(yǎng)基中，接著放入溫度為30°C、轉(zhuǎn)數(shù)為150rpmin的搖床培養(yǎng)4
天后，將培養(yǎng)液離心收集上清培養(yǎng)基。使用的液體培養(yǎng)基配方為(g/L):殼聚糖5.0g、酵母浸粉0.5g、NaCl0.5g、MgS04.7Η201.44g、CaC120.lg、KC10.5g、K2HP042.0g、KH2P041.0g，pH 值為 7.0，余量為水。酶活力單位(U)定義:每分鐘催化殼聚糖產(chǎn)生I μ mol還原糖所需要的酶量。根據(jù)DNS法測(cè)得Aspergillus clavatus ff-2菌株的液體培養(yǎng)基上清中酶活為0.53U/ml。實(shí)施例2Aspergillus clavatus ff-2 菌株總 RNA 的提取將菌株進(jìn)行4天 培養(yǎng)，用紗布過濾，將菌體直接放入液氮保存。從中取約40mg菌體，在液氮下研磨三次。之后加Iml Trizol試劑，待融解后移入1.5ml離心管。向體系中加入200ul氯仿,劇烈震蕩，靜置5min, 12000rpm離心15min。小心取上清到新離心管中，加入等體積的異丙醇，靜置5min, 12000rpm離心lOmin。倒掉上清，向沉淀中加體積濃度為75%的乙醇lml，7500rpm離心5min。最后將沉淀用無核糖核酶活性的水20_50ul融解。放-80°C保存待用。實(shí)施例3csnW2基因3’端mRNA序列的克隆按寶生物工程(大連)有限公司3’ -Full RACE Core Set Ver.2.0 (TakaraCode:D314)說明書中操作步驟，以其中的3’ RACEAdaptor為引物，Aspergillusclavatus ff-2菌株總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以3’ RACE OuterPrimer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)為引物進(jìn)行第一輪 PCR，其反應(yīng)條件為:94°C 3min,30 個(gè)循環(huán)(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 1.2min),72°C IOmin ;#3’RACE Inner Primer (CGCGGATCCTACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)和SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)為引物進(jìn)行第二輪 PCR，反應(yīng)條件為:94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 1.2min),72°C IOmin0 將兩輪 PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入ToplO，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)施例4csnW2基因5’端mRNA序列的克隆按照Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書要求，對(duì)Aspergillus clavatus W-2菌株總RNA的進(jìn)行前處理；以3’端序列為參照，設(shè)計(jì)兩條弓丨物，5RACE Outer sp Wl (GGACACGAACGTATCAAATCGACTA)和 5RACE Inner sp Wl(TCCTGCCCCGTAAACCCAA);以5RACE Outer sp Wl為引物，前處理總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以5RACE0uter sp Wl和試劑盒中UPMlOX引物，以上述cDNA第一條鏈為模板進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)條件為:94°C 3min，25個(gè)循環(huán)(94°C 30sec，68°C 30sec,72°C 1.5min)，72°C IOmin ;以 5RACE Inner sp Wl 和UPMlOX為引物，以一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)條件為:94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 1.5min),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶與pMD19_T載體(Takara:D102A)連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pMD19-T_csnW2，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(ToplO)，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)施例5csnW2基因在大腸桿菌中的重組表達(dá)以上述實(shí)施例4中的重組質(zhì)粒pMD19-T_csnW2為模板，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對(duì)如下:正向引物 Nde1-SignalP-F (GCCCATATGTATAGTGTCCCAGCCAACC)，反向引物Xho1-SignalP+ATG-R (AATGAGCTCCACGAACGTATCAATCGACTA),正向引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶Ned I位點(diǎn)，反向引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點(diǎn)。DNA聚合酶(DRR200A)購(gòu)自寶生物公司，PCR反應(yīng)體系按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性30sec-50°C退火30sec_72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。將PCR產(chǎn)物用Ned I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產(chǎn)物。將購(gòu)于美國(guó)Novagen公司的產(chǎn)物pET_23b載體用Ned I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體。Ned I和Xho I均購(gòu)于寶生物公司，酶與底物反應(yīng)的體系、溫度和時(shí)間均按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切pET_23b載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(ToplO)菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨節(jié)西林的Luria-Bertani培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，酵母粉0.5%，瓊脂2%)固體平板上，37°C培養(yǎng)12h，挑取單克?。粚慰寺〗尤牒?0 μ g/ml氨節(jié)西林的液 體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用上述正向引物Nde1-SignalP-F和反向引物Xho1-SignalP+ATG-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒送去上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明，在pET-23b的Ned I和Xho I酶切位點(diǎn)之間插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正確，所以進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購(gòu)自美國(guó)Novagen公司),然后按照該公司提供的操作步驟進(jìn)行殼聚糖酶CsnW2誘導(dǎo)表達(dá)及純化。實(shí)施例6csnW2基因在畢赤酵母X33中的重組表達(dá)以實(shí)施例4中的重組質(zhì)粒pMD19-T_csnW2為模板，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對(duì)如下:正向引物 Xho 1-S i g-F: (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC )，反向引物Xbal-Sig+His-R: (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)，正向引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點(diǎn)，反向引物下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶Xba I位點(diǎn)。DNA聚合酶(DRR200A)購(gòu)自寶生物公司，PCR反應(yīng)體系按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性30sec-5(TC退火30sec_72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0將PCR產(chǎn)物用Xho I和XbaI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產(chǎn)物。將購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司的產(chǎn)物pPICZ a A載體用Xho I和Xba I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體。Xho I和Xba I均購(gòu)于寶生物公司，酶與底物反應(yīng)的體系、溫度和時(shí)間均按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切pPICZ a A載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨節(jié)西林的Luria-Bertani培養(yǎng)基固體平板上，37°C培養(yǎng)12h，挑取單克??；將單克隆接入含有50 μ g/ml氨芐西林的液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用正向引物Xho1-Sig-F (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC)和反向引物 Xbal-Sig+His-R (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證，結(jié)果得到大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒送去上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明，在pPICZ a A的Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)之間插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正確，所以進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。將上述重組質(zhì)粒用 SacI進(jìn)行線性化,然后按照Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)入X33和篩選，得到高拷貝的轉(zhuǎn)化株。用該公司提供的操作步驟進(jìn)行殼聚糖酶CsnW2誘導(dǎo)表達(dá)及純化，結(jié)果如圖1所示，純化后的殼聚糖酶CsnW2在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預(yù)測(cè)的分子量相吻合。實(shí)施例7殼聚糖酶CsnW2的酶學(xué)性質(zhì)分析(I) pH和溫度對(duì)酶活性的影響將質(zhì)量為Ig的殼聚糖(脫乙酰度90%)底物溶于IOOml不同pH值的50mM醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH范圍為3.6-6.0),配制成質(zhì)量濃度為1%底物，并與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積比)的比例混合后，在40°C反應(yīng)30分鐘，按前述的DNS法測(cè)酶活力。結(jié)果顯示CsnW2在pH4.0時(shí)達(dá)到最大活力，表明CsnW2的最適反應(yīng)pH為4.0 (如圖2)在最適pH下，將質(zhì)量濃度為1%殼聚糖底物與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積t匕)的比例混合，分別在不同溫度(30°C -70°C)反應(yīng)30分鐘，按前述的DNS法測(cè)酶活力。結(jié)果顯示CsnW2在50°C時(shí)達(dá)到最大活力，表明CsnW2的最適反應(yīng)溫度為50°C (如圖3)。在最適pH和最適溫度下，將質(zhì)量濃度為1%殼聚糖底物與純化的CsnW2酶液按1000:1 (體積比)的比例混合后反應(yīng)30分鐘，按前述的DNS法測(cè)酶活力。用購(gòu)于北京索萊寶公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定CsnW2酶液的蛋白含量，結(jié)果表明重組CsnW2對(duì)殼聚糖的比活為1852U/g。(2) pH和溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響將在不同溫度(30°C -70°C )下熱處理30分鐘后的CsnW2酶液與質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:1(體積比)的比例混合，然后在最適溫度下測(cè)定剩余酶活，以不經(jīng)過熱處理的酶液酶活定義為100%相對(duì)活力(relativie activity),結(jié)果表明CsnW2在低于40°C的溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性。將在30°C，不同的pH (PH3-10)預(yù)孵育24h后的CsnW2酶液與質(zhì)量濃度為1%殼聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:2(體積比)的比例混合，然后在最適溫度下測(cè)定剩余酶活，以不經(jīng)過pH處理的酶液酶活定義為100%相對(duì)活力(relativie activity),結(jié)果顯示在pH4
10的范圍內(nèi)，Csnff2酶活仍保持60%以上，表明CsnW2對(duì)pH值耐受范圍較廣。(3) Csnff2的底物偏好性將純化的CsnW2分別與質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖、膠體幾丁質(zhì)和羧甲基纖維素三種不同底物按1000:1 (體積比)的比例混合，然后在50°C，pH5.0條件下反應(yīng)30分鐘，按前述DNS法測(cè)反應(yīng)液中是否有還原糖產(chǎn)生來確定其活性。結(jié)果表明以羧甲基纖維素為底物沒有明顯的活性。實(shí)施例8金屬離子對(duì)CsnW2活性的影響向質(zhì)量濃度為1%殼聚糖底物(pH4.0)中添加終濃度IOmM的不同的金屬離子，如:Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Co2+，Mn2+，F(xiàn)e3+，Cu2+or Ag+ (AgN03)，然后與純化的 CsnW2 酶液按1000:1 (體積比)的比例混合，并在40°C反應(yīng)30分鐘，按前述的DNS法測(cè)酶活力。對(duì)照組為不加任何金屬離子時(shí)CsnW2的活性(設(shè)定為100%)。結(jié)果顯示Mg2+和Mn2+能增加CsnW2活性(約1-2倍)；Fe3+, Cu2+和Ag+對(duì)酶活呈現(xiàn)抑制作用。實(shí)施例9CsnW2降解殼聚糖所得產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)分析將質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖(ρΗ4.0)與純化的CsnW2按1000:1 (體積比)的比例混合，然后在50°C下反應(yīng)，選取不同酶解時(shí)間(111，211，511，1011)的產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析。高效液相色譜采用離子交換色譜柱:CarboPac PAl (DIONEX, ColumnN0.35391，4X250mm, 1.D.with particle size of10 μ m);檢測(cè)器:Coulochem
II(ESA, USA);柱溫:30 °C ;流動(dòng)相:90mM NaOH ;流速:0.4mL/min。其中酶解10小時(shí)的高效液相色譜圖如圖4所示。色譜圖顯示CsnW2降解殼聚糖10小時(shí)的產(chǎn)物中有一系列不同聚合度的殼寡糖，該結(jié)果充分證明了 CsnW2屬于內(nèi)切殼聚糖酶。因此，內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2可被用于殼寡糖的制備以及與殼聚糖降解相關(guān)的領(lǐng)域，包括化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加 、醫(yī)藥及海藻遺傳工程等。
權(quán)利要求
1.曲霉屬的菌株，其為棒曲霉W-2,分類命名:棒曲霉Aspergillusclavatus,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
2.—種來源于權(quán)利要求1所述菌株(Aspergillus clavatus)的內(nèi)切殼聚糖酶基因csnW2，其核苷酸序列具有如下特征之一: 1)具有序列表中SEQID N0.1的核糖核酸(RNA)序列或SEQ ID N0.2的脫氧核糖核酸(DNA)序列； 2)編碼SEQID N0.3氨基酸序列的脫氧核糖核酸(DNA)序列； 3)具有與序列表中SEQID N0.2所限定的脫氧核糖核酸(DNA)序列的同源性達(dá)到90%及以上，且能編碼降解殼聚糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸(DNA)序列。
3.按照權(quán)利要求2所述的內(nèi)切殼聚糖酶基因編碼的內(nèi)切殼聚糖酶，其編碼的氨基酸序列具有如下特征之一: 1)序列表中SEQID N0.3從氨基端開始的第1_262或第18-262位氨基酸殘基序列； 2)將序列表中的SEQID N0.3從氨基端開始的第1-262或18-262位氨基酸殘基序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代、缺失、添加中的一種或二種以上后，具有降解殼聚糖活性的蛋白質(zhì)； 3)與序列表中SEQID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性達(dá)到90%及以上且具有降解殼聚糖活性的蛋白質(zhì)。
4.一種制備如權(quán)利要求3所述的內(nèi)切殼聚糖酶的方法，其特征在于:是將權(quán)利要求2所述的內(nèi)切殼聚糖酶基因克隆入重組表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)的內(nèi)切殼聚糖酶； 所述的重組表達(dá)內(nèi)切殼聚糖酶的表達(dá)載體，是指大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、枯草桿菌表達(dá)載體、乳酸菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體； 所述的重組表達(dá)內(nèi)切殼聚糖酶的宿主細(xì)胞，是指大腸桿菌宿主細(xì)胞(如Escherichiacoli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5 α 等)、酵母菌宿主細(xì)胞(如Saccharomyces cerevisiae>Pichia pastoris>Kluyveromyces Iactis 等)、枯草桿菌宿主細(xì)胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主細(xì)胞(如Lacticacid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細(xì)胞(如Streptomyces spp.等)、絲狀真菌宿主細(xì)胞(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillusnidulans等)、昆蟲細(xì)胞(如Bombyx mori, Antharaea eucalypti等)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0，幼小倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞BHK、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL等)中的一種。
5.一種如權(quán)利要求3所述的內(nèi)切殼聚糖酶在殼聚糖降解中的應(yīng)用，其特征在于:具有如下用途之一或二種以上； 1)用于斷裂殼聚糖或幾丁質(zhì)的糖苷鍵，獲得殼寡糖或幾丁寡糖； 2)用于降解蝦蟹殼或昆蟲外殼中的幾丁質(zhì)和殼聚糖組分，抽提色素或其中的蛋白，色素和其中的蛋白可以應(yīng)用于食品及其他研究。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2與其他殼聚糖酶、脫乙酰酶及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白混合后，用于協(xié)同斷裂殼聚糖糖苷鍵方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2的基因序列及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的內(nèi)切殼聚糖酶CsnW2來源土壤新分離菌株Aspergillus clavatus。本發(fā)明還提供了一種制備該新型殼聚糖酶的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該新殼聚糖酶的基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體上，獲得可異源表達(dá)該酶的畢赤酵母重組菌株，用該菌株異源表達(dá)制備的殼聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40℃-60℃下有較高活性，具有降解殼聚糖制備殼寡糖的功能。本發(fā)明提供的殼聚糖酶CsnW2可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加和醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有較大的生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P19/26GK103215192SQ20131007471
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者杜昱光, 張建平, 曹海龍, 岳敏, 黃李淑馨, 李曙光, 趙勇, 劉航 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所