一種甲基化dna檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測(cè)方法，該方法有以下步驟：提取DNA、設(shè)計(jì)并合成探針、雜交反應(yīng)、加入單克隆抗體反應(yīng)、加入偶聯(lián)單克隆抗體反應(yīng)、加入檢測(cè)試劑、測(cè)定并計(jì)算。本發(fā)明能夠有效排除非甲基化DNA的影響，因此本發(fā)明具有檢測(cè)特異性高、不容易被干擾、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有適用范圍大、方法簡(jiǎn)單、需要樣本量小、適用混合樣本等好處，在腫瘤早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。
【專利說明】—種甲基化DNA檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種甲基化DNA的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點(diǎn)的胞嘧啶(C)殘基的5’碳上被修飾了一個(gè)甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CG 二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動(dòng)物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。
[0003]DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升聞，可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機(jī)率就會(huì)提高，所以DNA甲基化在腫瘤早期檢測(cè)中的應(yīng)用十分引人注目。研究表明，表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因而檢測(cè)DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因，這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測(cè)可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)。
[0004]CpG島甲基化的檢測(cè)方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測(cè)法。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶/Southern法(methyIat1n-sensitive restrict1n Endonuclease/Southern, MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylat1n SpecificPCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測(cè)方法，是目前檢測(cè)DNA甲基化的常用方法，其靈敏度較高，但容易受干擾，特異性差，從而導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性率也很高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測(cè)方法，能夠有效地排除非甲基化DNA的影響，很好地解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)特異性低、容易被干擾、假陽(yáng)性高等缺點(diǎn)。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種甲基化DNA檢測(cè)方法，所述甲基DNA檢測(cè)方法包括如下步驟:
步驟I，提取待測(cè)樣品DNA;
步驟2，確定待測(cè)基因的檢測(cè)區(qū)域，在檢測(cè)區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補(bǔ)序列作為檢測(cè)探針的序列，使這一段序列長(zhǎng)18-120堿基；對(duì)所設(shè)計(jì)并合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記；
步驟3，用標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測(cè)探針與待測(cè)樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測(cè)試劑進(jìn)行反應(yīng)；
步驟8，終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算甲基化DNA的濃度和量。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟2中對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記是用生物素或具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟3的雜交反應(yīng)是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟3中標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟5中的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
[0011 ] 優(yōu)選的，所述步驟6中的偶聯(lián)單克隆抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟7中的HRP檢測(cè)試劑為HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
[0013]優(yōu)選的，所述待測(cè)樣品為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
[0014]優(yōu)選的，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液。
[0015]本發(fā)明在用特異性的檢測(cè)探針進(jìn)行雜交捕獲后，有效地消除全局性DNA甲基化(Global DNA me thy I at i on )的影響,使得僅有目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域的甲基化DNA得以保存,結(jié)合免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，特異性地定位檢測(cè)甲基化DNA分子的存在，使這一技術(shù)可以檢測(cè)到樣品中存在的極微量的甲基化DNA。
[0016]相比于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明能夠有效排除非甲基化DNA的影響，因此本發(fā)明具有檢測(cè)特異性高、不容易被干擾、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有適用范圍大、方法簡(jiǎn)單、需要樣本量小、適用混合樣本等好處，在腫瘤早期檢測(cè)、個(gè)性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明甲基化DNA檢測(cè)方法流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附后權(quán)利要求書限定的范圍。
[0019]實(shí)施例1，
步驟I，提取待測(cè)樣品DNA;
步驟2，確定待測(cè)基因的檢測(cè)區(qū)域，在檢測(cè)區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補(bǔ)序列作為檢測(cè)探針的序列，使這一段序列長(zhǎng)18-120堿基；對(duì)所設(shè)計(jì)并合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記；
步驟3，用標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測(cè)探針與待測(cè)樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測(cè)試劑進(jìn)行反應(yīng)；
步驟8，終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算甲基化DNA的濃度和量。
[0020]實(shí)施例2，
取正常人和已經(jīng)證實(shí)為結(jié)腸癌病人糞便5克，加入5倍體積IxTE并充分混合，用等體積氯仿抽提一次，用0.6倍的異丙醇沉淀獲得總DNA。以此DNA為待測(cè)樣品，在與實(shí)施例一相同的條件下，檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)用性。
[0021]其中與上述施例一相同的條件，指的是除以實(shí)際臨床樣品提取的DNA為待測(cè)樣品外，所有操作與上述施例一相同。
[0022]實(shí)施例二中的待測(cè)DNA樣品，可以為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。
[0023]所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液包括血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。
[0024]步驟I，提取待測(cè)樣品DNA ；
步驟2，確定待測(cè)基因的檢測(cè)區(qū)域，在檢測(cè)區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補(bǔ)序列作為檢測(cè)探針的序列，使這一段序列長(zhǎng)18-120堿基；對(duì)所設(shè)計(jì)并合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記；
步驟3，用標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測(cè)探針與待測(cè)樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測(cè)試劑進(jìn)行反應(yīng)；
步驟8，終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算甲基化DNA的濃度和量。
[0025]實(shí)施例3，
檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)
P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細(xì)胞具有的特征。P16基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的序列如下，有下劃線的部分為所選的要檢測(cè)的區(qū)域。
[0026]Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds,DQ325544.1
基因組 DNA 正鏈(sense strand)
5， -CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG-3，
設(shè)計(jì)的檢測(cè)探針:
5， -b1tin-TGCTCTCCCCCTCTCCGCAGCCGCCGAGCGCACGCGGTCCG-3，
上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實(shí)施例的例舉，對(duì)于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來(lái)予以實(shí)施。
[0027]以上為對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的描述，通過對(duì)所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述甲基化DNA檢測(cè)方法包括以下步驟: 步驟I，提取待測(cè)樣品DNA; 步驟2，確定待測(cè)基因的檢測(cè)區(qū)域，在檢測(cè)區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補(bǔ)序列作為檢測(cè)探針的序列，使這一段序列長(zhǎng)18-120堿基；對(duì)所設(shè)計(jì)并合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記； 步驟3，用標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，作梯度稀釋；用所述的檢測(cè)探針與待測(cè)樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)； 步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗漆; 步驟5，加入單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌； 步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進(jìn)行反應(yīng)并洗滌； 步驟7，加入HRP檢測(cè)試劑進(jìn)行反應(yīng)； 步驟8，終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算甲基化DNA的濃度和量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記是用生物素或具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3的雜交反應(yīng)是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟5中的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟6中的偶聯(lián)單克隆抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、PH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟7的HRP檢測(cè)試劑是HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的甲基化DNA檢測(cè)方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104046678SQ201310076396
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月11日
【發(fā)明者】孫喜元 申請(qǐng)人:蘇州承美生物科技有限公司