一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，在培養(yǎng)皿底部裝一環(huán)形墊片，先將干細胞接種在環(huán)形區(qū)域內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后再將瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液加到該環(huán)形區(qū)域，溶液固化后，加CaCl2溶液鈣化，再加入殼聚糖溶液反應，在干細胞上形成一層瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠。在復合凝膠表面接種誘導細胞。本發(fā)明誘導細胞和干細胞共培養(yǎng)可模擬體內(nèi)細胞之間及細胞和可溶性因子之間的相互作用，多糖基的瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠則可模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)，其剛度和厚度可調(diào)控干細胞的定向分化，同時實現(xiàn)了干細胞和誘導細胞的隔離共培養(yǎng)，使得分化細胞容易收獲，將在再生醫(yī)學應用中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及再生醫(yī)學領域，是一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法。

【背景技術】
[0002]干細胞由于具有自我更新和向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪等多種類型細胞分化的能力，是再生醫(yī)學的理想種子細胞。但是由于干細胞自發(fā)分化具有不可控性，當干細胞植入體內(nèi)受損組織后，干細胞除了分化為所需要的細胞類型，參與組織修復，同時也分化為其它類型的細胞，甚至具有較高的致瘤性。對干細胞進行體外預分化，使之在移植之前預先分化為所需類型細胞或其前體細胞，能夠提高定向分化效率，減低干細胞在體內(nèi)向其它類型細胞分化的能力，從而提高修復效果，降低致瘤風險。
[0003]目前，體外誘導干細胞定向分化的方法包括生長因子組合/化學試劑誘導以及細胞共培養(yǎng)誘導。大量研究表明高劑量的生長因子組合或者化學試劑盡管能夠刺激干細胞產(chǎn)生目的細胞的表型，但是所獲得分化細胞缺乏長期的生理功能，并且容易引發(fā)細胞變異，因此此種方法存在有效性和安全性方面的問題。細胞共培養(yǎng)是使用具有目的細胞表型的誘導細胞和干細胞進行體外共培養(yǎng)，此種方法可以模擬體內(nèi)特異組織細胞微環(huán)境，所獲得的分化細胞具有接近體內(nèi)特異組織細胞的生理功能，具有臨床應用潛力。
[0004]體內(nèi)細胞微環(huán)境主要構成要素有細胞和細胞、細胞和細胞外基質(zhì)以及細胞和可溶性因子之間的相互作用。研究表明可溶性因子的種類和濃度、細胞外基質(zhì)的成分和剛度均對干細胞的定向分化均有重要的調(diào)控作用，因此體外細胞共培養(yǎng)體系的設計應考慮到這些要素對分化的協(xié)同影響。目前常用的共培養(yǎng)體系包括直接接觸共培養(yǎng)以及Transwell共培養(yǎng)體系。直接接觸共培養(yǎng)體系將誘導細胞和干細胞進行混合培養(yǎng)，盡管此體系較為接近體內(nèi)細胞微環(huán)境，但是誘導細胞和干細胞相互污染，不能應用于臨床。Transwell共培養(yǎng)體系盡管利用多孔平板膜將兩種細胞隔開，避免了細胞分離問題，體現(xiàn)了細胞和細胞之間、細胞和因子之間的相互作用，但是缺乏細胞外基質(zhì)成分和剛度的影響，并且不能調(diào)整可溶性因子在兩種細胞之間的濃度分布，因而限制了干細胞分化效率以及分化細胞功能水平的提高,并且此體系價格昂貴,使得實驗成本大大增加。
[0005]由于現(xiàn)有細胞共培養(yǎng)體系存在上述主要缺陷，嚴重限制了干細胞體外定向分化技術的進一步發(fā)展與應用，因此急需研發(fā)便捷實用的可多角度模擬體內(nèi)細胞微環(huán)境中細胞之間、細胞和細胞外基質(zhì)之間以及細胞和可溶性因子之間相互作用的體外細胞共培養(yǎng)新方法，以實現(xiàn)體外對干細胞體外定向預分化的調(diào)控，進一步促進干細胞在再生醫(yī)學領域的應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，即利用瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠實現(xiàn)誘導細胞和干細胞的非接觸共培養(yǎng)，通過改變平板復合凝膠的剛度和厚度可調(diào)控干細胞的定向分化，同時實現(xiàn)不同類型細胞之間的分離，以獲得純凈的分化細胞。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0008]在培養(yǎng)皿底部裝一環(huán)形墊片，先將干細胞接種在環(huán)形墊片所形成的環(huán)形區(qū)域之內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后再將瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液加到該環(huán)形區(qū)域，使混合溶液液面高度超過墊片厚度2_。之后于環(huán)形墊片上平鋪一個玻璃板，將玻璃板緊密壓在墊片之上，待環(huán)形墊片內(nèi)的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl2溶液進行鈣化，之后加入殼聚糖溶液進行反應，從而在干細胞之上形成了一層瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠。然后在平板復合凝膠表面接種誘導細胞，從而在同一個培養(yǎng)體系中實現(xiàn)了干細胞和誘導細胞的非接觸共培養(yǎng)，通過改變瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液中瓊脂糖的質(zhì)量濃度以及環(huán)形墊片的厚度可改變平板復合凝膠的剛度、厚度以及誘導細胞分泌的可溶性因子在復合凝膠中的濃度，進而調(diào)控干細胞的體外定向分化。
[0009]所述環(huán)形墊片包括金屬墊片或非金屬墊片，其厚度為10-3000 μ m。
[0010]所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、虹膜色素上皮細胞、羊膜上皮細胞、或造血干細胞，誘導細胞包括分離培養(yǎng)的體細胞或細胞系；
[0011]干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞；
[0012]調(diào)控干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導細胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、髓鞘細胞、或神經(jīng)組織來源的腫瘤細胞系；
[0013]調(diào)控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系；
[0014]調(diào)控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質(zhì)細胞、原代內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系；
[0015]調(diào)控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或胰島細胞；
[0016]調(diào)控干細胞向成骨細胞分化的誘導細胞包括原代成骨細胞或骨組織來源的腫瘤細胞系；
[0017]調(diào)控干細胞向軟骨細胞分化的誘導細胞包括原代軟骨細胞或軟骨細胞系；
[0018]調(diào)控干細胞向脂肪細胞分化的誘導細胞為原代脂肪細胞。
[0019]所述瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠為由瓊脂糖、海藻酸鈉和殼聚糖所制備；
[0020]瓊脂糖為I型，電內(nèi)滲值小于0.2 ；
[0021]海藻酸鈉的分子量為10-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)為
0.2-3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉；
[0022]殼聚糖分子量為2_200kDa，脫乙酰度為50_100%，所使用的溶液濃度為
0.02-0.5%(ff/V)。
[0023]所述瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液中瓊脂糖質(zhì)量濃度為0.1-6%(W/V)，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為0.1-3% (W/V)。
[0024]所使用的瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液、10mmol.IZ1CaCl2溶液以及殼聚糖溶液的體積比為1:10:5。
[0025]所述改變平板復合凝膠的剛度為通過改變瓊脂糖的質(zhì)量濃度來實現(xiàn)，其剛度為0.2kPa_80kPa。
[0026]所述改變平板復合凝膠的厚度為通過改變環(huán)形墊片的厚度來實現(xiàn)，其厚度為10-3000 μ mD
[0027]所述定向分化包括干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪組織的細胞定向分化。
[0028]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0029]1.操作簡單，成本低。本發(fā)明利用瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠作為干細胞和誘導細胞共培養(yǎng)的隔離手段，制備簡單，避免使用昂貴材料和工藝；
[0030]2.很好地模擬體內(nèi)特異組織分化微環(huán)境，提高干細胞分化效率。借助于誘導細胞和復合凝膠，本發(fā)明較好地模擬了體內(nèi)組織成熟細胞和干細胞之間，干細胞和可溶性因子之間以及細胞和細胞外基質(zhì)之間的相互作用，從而在體外實現(xiàn)了干細胞在近似體內(nèi)組織環(huán)境中的定向分化，除了分化效果的提高，還避免了有毒性化學誘導劑以及昂貴生長因子組合的使用，獲得的分化細胞具有近似體內(nèi)組織細胞的生物學功能；
[0031]3.通過改變平板復合凝膠的物理特性可調(diào)控干細胞定向分化，簡單方便。多糖基的平板復合凝膠較好地模擬了細胞外基質(zhì)，研究表明組織特異基質(zhì)剛度對于干細胞向特異組織類型細胞定向分化具有重要促進作用。本發(fā)明通過改變瓊脂糖質(zhì)量濃度可以改變復合凝膠的剛度，從而實現(xiàn)對干細胞的定向誘導。另外，干細胞的定向分化也受到微環(huán)境中組織細胞分泌的可控性因子的調(diào)控，本發(fā)明通過改變平板復合凝膠的厚度可改變誘導細胞分泌的可溶性因子在凝膠中的濃度，這直接改變了復合凝膠層下干細胞能夠接觸到的可溶性因子的濃度，從而實現(xiàn)對干細胞定向分化的進一步調(diào)控；
[0032]4.能夠實現(xiàn)誘導細胞和分化細胞的分離和收獲，保證應用的安全性。平板復合凝膠能夠將誘導細胞和干細胞進行隔離，并阻擋細胞穿透凝膠，避免了兩者的接觸，且共培養(yǎng)結束后，通過去除復合凝膠可收獲純凈的分化細胞；
[0033]5.應用范圍廣。本發(fā)明方法可促進干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪等組織細胞分化，具有廣泛的臨床應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化體系的示意圖:培養(yǎng)容器1，瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠2，誘導細胞3，干細胞4，環(huán)形墊片5 ；
[0035]圖2為細胞共培養(yǎng)促進人間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)前體細胞定向分化的明場照片:圖2A為平板復合凝膠下面生長的人臍帶來源間充質(zhì)干細胞；圖2B為平板復合凝膠上粘附的人神經(jīng)母細胞瘤細胞；
[0036]圖3為相同厚度條件下不同瓊脂糖濃度的復合凝膠的剛度；
[0037]圖4為細胞共培養(yǎng)誘導間充質(zhì)干細胞體外定向分化為神經(jīng)前體細胞:圖4A為Nestin基因表達;圖4B為Nestin陽性細胞百分比；
[0038]圖5為熒光標記BSA在不同厚度復合凝膠中平均熒光強度的比較；
[0039]圖6為細胞共培養(yǎng)誘導人胚胎干細胞體外定向分化為心肌祖細胞:圖6A為GATA基因表達；圖6B為NKX2.5基因表達。

【具體實施方式】
[0040]實施例1:細胞共培養(yǎng)促進人間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)前體細胞定向分化
[0041]將第4代人臍帶間充質(zhì)干細胞以2X104cellS/cm2的密度接種在內(nèi)徑為35mm的環(huán)形墊片內(nèi)部區(qū)域，墊片厚度為300 μ m，添加含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。
[0042]將瓊脂糖粉末加入到水中，于121攝氏度高壓20min，得到瓊脂糖儲存溶液3%(W/V，g/ml)。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)粉末溶解于生理鹽水中，得到1.5%(W/V，g/ml)的溶液。用水稀釋預熱的3%(W/V，g/ml)瓊脂糖儲存溶液和1.5%(ff/V, g/ml)海藻酸鈉溶液，配制瓊脂糖終濃度分別為0.35,0.7和1.4%(ff/V, g/ml)的混合液，海藻酸鈉終濃度均為0.2%(W/V，g/ml)。將混合溶液快速加到環(huán)形區(qū)域中，并快速鋪上一張玻璃板，緊壓在環(huán)形墊片上，2min后，輕輕揭去玻璃片。之后，加入1ml10mmol.L-1CaCl2溶液,反應30min,再加入0.05%(ff/V, g/ml)的殼聚糖(分子量6萬，脫乙酰度90%)溶液，反應成膜lOmin，并使用培養(yǎng)液洗滌3次，從而得到了厚度為300 μ m,不同剛度的復合凝膠。之后，將SHSY5Y細胞以2X 104cellS/cm2的密度接種凝膠表面，添加培養(yǎng)液，進行共培養(yǎng)，同時以未分化干細胞作為對照組。
[0043]共培養(yǎng)3天之后，將粘附有SHSY5Y細胞的凝膠輕輕移除，利用流變儀檢測去掉誘導細胞后凝膠的剛度。另外，用PBS沖洗培養(yǎng)皿底部的干細胞，用胰酶收集培養(yǎng)皿底部的分化細胞，用real-time PCR和熒光染色分析所獲得分化細胞的神經(jīng)前體細胞標志Nestin基因表達以及Nestin陽性細胞的百分比。實驗結果見圖2-4，結果顯示，在凝膠厚度相同的條件下，復合凝膠的剛度隨瓊脂糖質(zhì)量濃度的增大而增大，并且共培養(yǎng)體系促進了神經(jīng)標記物Nestin的表達，其中剛度最低的復合凝膠共培養(yǎng)組誘導效果最顯著。
[0044]實施例2:細胞共培養(yǎng)促進人胚胎干細胞向心肌祖細胞定向分化
[0045]將第32代人胚胎干細胞系H9細胞接種在內(nèi)徑為35mm的環(huán)形墊片內(nèi)部區(qū)域，墊片厚度分別為100、500以及1000 μ m，添加含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。
[0046]將瓊脂糖粉末加入到水中，121度高壓20min，得到瓊脂糖儲存溶液3%(W/V，g/ml)。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)粉末溶解于生理鹽水中，得到1.5%(W/V，g/ml)的溶液。用水稀釋預熱的3%(W/V，g/ml)瓊脂糖儲存溶液和
1.5%(ff/V, g/ml)海藻酸鈉溶液，配制瓊脂糖終濃度分別為0.7 (ff/V, g/ml)，海藻酸鈉終濃度為0.4%(W/V，g/ml)的混合溶液。將混合溶液快速加到環(huán)形區(qū)域中，并快速鋪上一張玻璃板，緊壓在環(huán)形墊片上，2min后,輕輕揭去玻璃片。之后,加入1ml10mmol.L4CaCl2溶液，反應30min，再加入0.05%(ff/V, g/ml)的殼聚糖(分子量6萬，脫乙酰度90%)溶液，反應成膜lOmin，并使用培養(yǎng)液洗滌3次，從而得到了具有相同剛度，厚度分別為100、500以及100ym的復合凝膠。之后，將C2C12細胞以2X 104cellS/cm2的密度接種在凝膠表面，添加培養(yǎng)液，進行共培養(yǎng)，同時以未分化干細胞作為對照組。
[0047]利用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光標記BSA在不同厚度復合凝膠中的平均熒光強度。共培養(yǎng)10天之后，將粘附有C2C12細胞的凝膠輕輕挑出，用PBS沖洗培養(yǎng)皿底部的干細胞，用胰酶收集培養(yǎng)皿底部的分化細胞，用real-timePCR和熒光染色分析所獲得分化細胞的心肌祖細胞標志Gata4和NKX2.5基因表達。實驗結果見圖5和6，結果顯示，在相同凝膠剛度條件下，最小厚度復合凝膠中BSA的平均濃度水平最高，并且其誘導干細胞出現(xiàn)心肌相關標記物的表達水平也最聞，即干細胞心肌分化效率最聞。
【權利要求】
1.一種細胞共培養(yǎng)誘導干細胞體外定向分化的方法，其特征在于:在培養(yǎng)皿底部裝一環(huán)形墊片，先將干細胞接種在環(huán)形墊片所形成的環(huán)形區(qū)域之內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后再將瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液加到該環(huán)形區(qū)域，使混合溶液液面高度超過墊片厚度大于或等于2mm ;之后于環(huán)形墊片上平鋪一個玻璃板，將玻璃板緊密壓在墊片之上，待環(huán)形墊片內(nèi)的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl2溶液進行鈣化，之后加入殼聚糖溶液進行反應，從而在干細胞之上形成了一層瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠；然后在平板復合凝膠表面接種誘導細胞，從而在同一個培養(yǎng)體系中實現(xiàn)了干細胞和誘導細胞的非接觸共培養(yǎng)，通過改變瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液中瓊脂糖的質(zhì)量濃度以及環(huán)形墊片的厚度可改變平板復合凝膠的剛度、厚度以及誘導細胞分泌的可溶性因子在復合凝膠中的濃度，進而調(diào)控干細胞的體外定向分化。
2.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述環(huán)形墊片包括金屬墊片或非金屬墊片，其厚度為10-3000 μ m。
3.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、虹膜色素上皮細胞、羊膜上皮細胞、或造血干細胞，誘導細胞包括分離培養(yǎng)的體細胞或細胞系； 干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞； 調(diào)控干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導細胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、髓鞘細胞、或神經(jīng) 組織來源的腫瘤細胞系； 調(diào)控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系； 調(diào)控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質(zhì)細胞、原代內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系； 調(diào)控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或β_胰島細胞； 調(diào)控干細胞向成骨細胞分化的誘導細胞包括原代成骨細胞或骨組織來源的腫瘤細胞系; 調(diào)控干細胞向軟骨細胞分化的誘導細胞包括原代軟骨細胞或軟骨細胞系； 調(diào)控干細胞向脂肪細胞分化的誘導細胞為原代脂肪細胞。
4.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述瓊脂糖/海藻酸鈉/殼聚糖平板復合凝膠為由瓊脂糖、海藻酸鈉和殼聚糖所制備; 瓊脂糖為I型，電內(nèi)滲值小于0.2 ； 海藻酸鈉的分子量為10-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)為0.2-3,且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉； 殼聚糖分子量為2-200kDa，脫乙酰度為50-100%，所使用的溶液濃度為0.02-0.5%(ff/V)。
5.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液中瓊脂糖質(zhì)量濃度為0.1_6%(W/V)，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為 0.1-3% (W/V)。
6.按照權利要求1、4或5所述的培養(yǎng)方法,其特征在于: 所使用的瓊脂糖/海藻酸鈉混合溶液、10mmol.L^1CaCl2溶液以及殼聚糖溶液的體積比為 1:10:5。
7.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述改變平板復合凝膠的剛度為通過改變瓊脂糖的質(zhì)量濃度來實現(xiàn)，其剛度為0.2kPa_80kPa。
8.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述改變平板復合凝膠的厚度為通過改變環(huán)形墊片的厚度來實現(xiàn)，其厚度為10-3000 μ m。
9.按照權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述定向分化包括干細胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨、或脂肪組織的細胞定向分化 。
【文檔編號】C12N5/0789GK104046589SQ201310076563
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權日:2013年3月11日
【發(fā)明者】馬小軍, 劉洋, 連建春, 孫廣煒, 賀欣 申請人:中國科學院大連化學物理研究所