專利名稱：一種紫金牛葉桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及微生物及其復(fù)合菌劑，具體來(lái)說(shuō)是一種處理油田壓裂返排液的微生物復(fù)合菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
:通常油田提高油氣井增產(chǎn)的主要措施是采用油氣井的壓裂液作業(yè)，然而在壓裂作業(yè)的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的油田壓裂返排液，壓裂液返排液組成比較復(fù)雜。由于壓裂液含有大量的高分子有機(jī)化合物，導(dǎo)致壓裂液COD值濃度較高，處理技術(shù)難度較大。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)油田壓裂返排液的處理方法主要有以下幾點(diǎn):I)焚燒:主要是通過(guò)高溫氧化將高濃度有機(jī)廢液進(jìn)行分解，使有機(jī)物轉(zhuǎn)化成水和二氧化碳等無(wú)機(jī)產(chǎn)物，此方法對(duì)環(huán)境條件要求較高，耗能較大，應(yīng)用起來(lái)較為困難。2)儲(chǔ)備池:在采油作業(yè)后，將壓裂液儲(chǔ)存在廢液池中，此方法雖然能夠暫時(shí)將廢液進(jìn)行擱置，卻無(wú)法從根本上對(duì)壓裂液進(jìn)行處理，且由于敞口放置，同時(shí)也存在著二次污染的問(wèn)題。3)回注:目前大部分油田都采用回注法將作業(yè)廢水從注水站打入底層，該方法可節(jié)約成本，并避免造成二次污染。在油田壓裂返排液處理中，環(huán)境微生物技術(shù)是最具有發(fā)展前景的技術(shù)，也是未來(lái)環(huán)境治理的主導(dǎo)技術(shù)，微生物處理技術(shù)具有低運(yùn)行成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。與物理化學(xué)方法相比，生物處理法可通過(guò)在特定環(huán)境下對(duì)微生物進(jìn)行篩選純化，選育出能夠適應(yīng)特定環(huán)境下的微生物菌株，通過(guò)馴化培養(yǎng)，使微生物對(duì)生存環(huán)境適應(yīng)性不斷提高，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)壓裂液返排液中高分子有機(jī)污染物的生物降解處理。通過(guò)中國(guó)專利數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)用微生物復(fù)合菌劑對(duì)油田壓裂液返排液進(jìn)生物降解的類似處理方法
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種處理油田壓裂返排液的微生物復(fù)合菌劑，所述的這種處理油田壓裂返排液的微生物復(fù)合菌劑要解決現(xiàn)有技術(shù)中的處理油田壓裂返排液的方法降解困難、同時(shí)伴隨二次污染的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種枝孢霉菌,其分類命名為Cladosporium sp.,保藏號(hào)為CGMCCNo:5782o
本發(fā)明還提供了一種紫金牛葉桿菌，其分類命名為Phyllobacteriummyrsinacearum,保藏號(hào)為 CGMCC No:5783。本發(fā)明還提供了一種處理油田壓裂返排液的微生物復(fù)合菌劑，所述的復(fù)合菌劑中含有胍膠、KH2P04、K2HP04、MgS04、CaCl2、NaCl和水，在IL所述的水中，含有0.1g 5g的胍膠、0.05g Ig 的 KH2PO4、0.05g 2g 的 K2HPO4、0.0lg 0.1g 的 MgSO4、0.0lg 0.5g 的 CaCl2和0.0lg 0.2g的NaCl，在所述的菌劑中，還加入有保藏號(hào)為CGMCC No:5782和CGMCC No:5783的菌株，所述的CGMCC No:5782的菌株的接種體積為IL水的2.50% 12.5%，所述的CGMCCNo:5783的菌株的接種體積為IL水的0.833% 7.5%。本發(fā)明還提供了一種制備上述處理油田壓裂返排液的微生物復(fù)合菌劑的方法，其中，將保藏號(hào)為CGMCC No:5782的枝孢霉菌菌株和保藏號(hào)為CGMCC No:5783的紫金牛葉桿菌菌株分別放入兩個(gè)培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基由水組成，每升水中含有0.1g 5g 的胍膠、0.05g Ig 的 ΚΗ2Ρ04、0.05g 2g 的 K2HP04、0.0lg 0.1g 的 MgSO4'0.0lg 0.5g的CaCl2和0.0lg 0.2g的NaCl，培養(yǎng)時(shí)間為3 10天，培養(yǎng)溫度為5 30°C，然后再向裝有上述培養(yǎng)基的兩個(gè)反應(yīng)器中按照體積百分比5% 15%的接種量分別接種上述兩個(gè)菌種，連續(xù)培養(yǎng)8 48h，得到液體菌液，然后將含有枝孢霉菌的液體菌液和含有紫金牛葉桿菌的液體菌液按照 體積比為I 5:1的比例進(jìn)行復(fù)配，得到微生物復(fù)合菌劑。本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)基，由水組成，每升水中含有0.1g 5g的胍膠、0.05g Ig 的 ΚΗ2Ρ04、0.05g 28的1(2冊(cè)04、0.0lg 0.1g 的 MgS04、0.0lg 0.5g 的 CaCljP 0.0lg 0.2g 的 NaCl。本發(fā)明中的枝孢霉菌,其分類命名為Cladosporium sp.,屬于真菌界、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、暗色孢科、枝孢屬。該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)(中科院微生物研究所)，保藏日期為2012年2月21號(hào)，保藏號(hào)為 CGMCC No:5782o本發(fā)明中的紫金牛葉桿菌，其分類命名為Phyllobacterium myrsinacearum,該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)(中科院微生物研究所)，保藏日期為2012年2月21號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC No:5783。本發(fā)明的枝孢霉菌和紫金牛葉桿菌是以壓裂返排液中對(duì)COD影響最大的胍膠為食物，通過(guò)振蕩培養(yǎng)，能夠?qū)毫逊蹬乓褐械碾夷z以食物的形式進(jìn)行消耗，降低壓裂返排液中的胍膠的含量，從而降低了壓裂返排液的COD值。本發(fā)明和已有技術(shù)相比較，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的微生物菌劑及其制備方法是利用現(xiàn)在微生物技術(shù)，針對(duì)壓裂液返排液中的高分子有機(jī)成分，選育出具有高效降解能力的微生物復(fù)合菌群，通過(guò)微生物在壓裂液返排液中的生長(zhǎng)繁殖和馴化，使微生物不斷適應(yīng)油田廢水的生長(zhǎng)環(huán)境，最終達(dá)到降解壓裂液返排液化學(xué)需氧量的目的，本發(fā)明能夠有效的用于壓裂液返排液中高分子、有機(jī)物的降解，降解率高，水質(zhì)清澈，降低了對(duì)水體環(huán)境和土壤環(huán)境的二次污染，具有較好的應(yīng)用前景。


:圖1中A是枝孢霉IS383區(qū)的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，B是標(biāo)準(zhǔn)marker。圖2中A是紫金牛葉桿菌S1197區(qū)的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，B是標(biāo)準(zhǔn)marker。
具體實(shí)施方式
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下面實(shí)施例采用的設(shè)備主要是:PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(加拿大BBI公司)；3730測(cè)序列分析儀(美國(guó)ABI公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)；YXJ_2離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius公司);U_3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Hitachi公司)；移液器(范圍 100-1000 μ I, 20-200 μ 1,0.5-10 μ I)(加拿大 BBI 公司)。實(shí)施例1:枝孢霉菌和紫金牛葉桿菌的分離純化以油田壓裂液返排液為取樣源，按照逐級(jí)稀釋要求將壓裂液返排液以KT1 10,進(jìn)行稀釋，涂布于含有3%高分子有機(jī)化合物胍膠的固體培養(yǎng)基上，與溫度30°C條件下培養(yǎng)5天。在上述平板上挑取單菌落經(jīng)過(guò)平板劃線分離純化后得到兩株具有優(yōu)良性狀的菌株 EBl 和 EB2。實(shí)施例2菌株EBl的測(cè)序和鑒定一、基因組提取及電泳檢測(cè)(一)、基因組提取過(guò)程:按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)描述的方法進(jìn)行提取。抽提步驟如下描述:1.取50-100mg新鮮真菌或20mg干燥子實(shí)體或菌絲,液氮中充分研磨成粉末。依次加入700 μ 165°C預(yù) 熱的FPCB Solution和7 μ I β-巰基乙醇，充分混勻，65° C溫浴25min，間或混勻。2.12, OOOrpm離心IOmin,將上清轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml離心管中，加入700 μ I氯仿，充分混勻，12, OOOrpm離心5min。3.吸取上清至一干凈的1.5ml離心管中，加入40 μ I RNase A (20mg/ml),充分混勻，室溫放置IOmin。4.依次加入1/2體積BD Buffer和1/2體積無(wú)水乙醇，充分混勻。5.將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置2min，10, OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液。6.將吸附柱放回收集管中，加入500 μ I Pff Solution, 10，OOOrpm離心lmin,倒掉
收集管中廢液。7.將吸附柱放回收集管中，加入500 μ I Wash Solution, 10，OOOrpm離心lmin,倒
掉收集管中廢液。8.將吸附柱放回收集管中，10，OOOrpm離心2min。9.將吸附柱放入干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50 μ I預(yù)熱(60°C)的Elution Buffer,靜置5min, 10, OOOrpm離心lmin,將所得到的DNA溶液置于_20°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。(二)、將得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增1.PCR 體系建立(50ul):Template (基因組) IOpmolPrimer up (IOuM)Iul
Primer down (IOuM)IuldNTP mix(IOMm each)Iul10*Taq reaction Buffer 5ulTaq(5u/ul)0.25ul加水至50ul2.PCR程序設(shè)定預(yù)變性98°C 5mim;循環(huán)95°C 35S, 55°C 35S, 72°C 40s, 35 個(gè)循環(huán)，延伸8min3.PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1A所示。4.DNA瓊脂糖切膠純化由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割DNA目的條帶，純化方式按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒描述方法進(jìn)行操作。(I)從瓊脂糖凝膠中回收DNAa)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開(kāi)，然后用干凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA的瓊脂塊，放入1.5ml離心管中。b)稱量凝膠的重量，以Img=Iul換算凝膠的體積。c)按照凝膠濃度,按下表提供的參數(shù)加入相應(yīng)比例的Binding Buffer II
權(quán)利要求
1.一種 紫金牛葉桿菌，其保藏號(hào)為CGMCC No:5783ο
全文摘要
本發(fā)明提供了一種紫金牛葉桿菌，保藏號(hào)為CGMCC No5783。將保藏號(hào)為CGMCC No5782的枝孢霉菌和本發(fā)明的菌株分別放入兩個(gè)培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，然后再向裝有上述特定培養(yǎng)基的兩個(gè)反應(yīng)器中按體積百分比5%～15%的接種量分別接種上述兩個(gè)菌種，連續(xù)培養(yǎng)8～48h，得到液體菌液，然后將培養(yǎng)好的液體菌液進(jìn)行復(fù)配，得到微生物復(fù)合菌劑。通過(guò)微生物在壓裂液返排液中的生長(zhǎng)繁殖和馴化，使微生物不斷適應(yīng)油田廢水的生長(zhǎng)環(huán)境，最終達(dá)到降解壓裂液返排液化學(xué)需氧量的目的，本發(fā)明能夠有效的用于壓裂液返排液中高分子、有機(jī)物的降解，降解率高，水質(zhì)清澈，降低了對(duì)水體環(huán)境和土壤環(huán)境的二次污染。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103205386SQ20131014093
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者李松棠, 王婷婷, 陳宏宇, 張方元, 單煜巽 申請(qǐng)人:安潔士石油技術(shù)(上海)有限公司