一種走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]走馬胎(Ari/isia gigantifolia Stapf)又名大葉紫金牛、走馬風(fēng)、豆收，為紫金?？谱辖鹋僦参铩Ｈ晁幱?，民間有“兩腳行不開，不離走馬胎”之說，具有活血化瘀、祛風(fēng)濕、壯筋骨、止血生肌等功效，治療風(fēng)濕筋骨疼痛、跌打損傷、產(chǎn)后血瘀、癰疽潰瘍等癥。近年來，隨著對走馬胎化學(xué)成分和藥理研究的不斷深入，還含有顯著的抗惡性腫瘤、抗血栓、抗炎、抗氧化等療效的生物活性成分。走馬胎的藥用價值不斷被挖掘，應(yīng)用也越來越廣，市場需求量不斷增加。
[0003]走馬胎為常綠小灌木，根莖粗壯，主要分布在廣西、廣東、江西等地，多生于海拔1300 m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮濕處。目前，走馬胎藥材主要來源于野生資源，需要生長三年以上，周期長，且產(chǎn)量不高。在走馬胎野生分布區(qū)，藥農(nóng)長期的采而不種，造成野生自然資源過度采挖，使得走馬胎分布點(diǎn)越來越少，資源日漸匱乏。
[0004]隨著走馬胎供需矛盾日益尖銳，人工栽培勢在必行。然而苗木供應(yīng)緊張制約了走馬胎的人工栽培。目前，走馬胎的繁殖方式為扦插繁殖和種子繁殖，都難以提供大量種苗。主要由于以下兩方面的原因:扦插繁殖存在母本數(shù)量少和繁殖系數(shù)低等問題；而種子繁殖則存在野生資源分散、成熟時間不一致造成種子采集困難等問題，且種子萌芽需要的時間長。植物組織培養(yǎng)具有不受時間和地點(diǎn)限制、繁殖系數(shù)高、可保持母本優(yōu)良性狀等特點(diǎn)，在植物種苗繁育上廣泛應(yīng)用。在走馬胎組織培養(yǎng)研究過程中，由于走馬胎為木本植物，取嫩芽為外植體時存在滅菌難等問題，而通過滅菌的種子在培養(yǎng)基上萌芽獲得無菌植株，以其芽繁殖芽進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，存在增殖系數(shù)低、繼代時間長等問題，造成培養(yǎng)成本高，嚴(yán)重阻礙了走馬胎組培苗在人工栽培中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法，通過走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)、分化成芽來提高走馬胎出芽數(shù)量，該方法操作簡單、穩(wěn)定高效，并能大大降低組培苗的培養(yǎng)成本。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:
一種走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法，包括以下步驟:
(I)在超凈工作臺上，將走馬胎種子用75%乙醇溶液滅菌I min，無菌水清洗I次，再用0.1%升汞(HgCL2)溶液滅菌10 min，無菌水清洗5次，放到滅菌過的濾紙上吸干水分，接入MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30?50 d，種子萌芽，得到無菌植株；將無菌植株的莖段和芽接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)35?45 d，誘導(dǎo)率為100% ；
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂5g/L, pH 值為 5.8 ;
(2)在超凈工作臺上，將走馬胎的莖段和芽誘導(dǎo)得到愈傷組織切分成0.2cmX0.2 cm小塊，接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，增殖系數(shù)為3.7?6.2 ;
所述增殖培養(yǎng)基為:MS+2, 4-D0.5 ?2.0 mg/L+6-BA0.1 ?0.5 mg/L+TDZ0.5 ?2.0 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 5 g/L, pH 值為 5.8 ;
(3)在超凈工作臺上，取出步驟(2)中得到的愈傷組織切分成0.5 cmX0.5 cm小塊，接入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，分化率為100%，分化系數(shù)為4.2?13.7 ;
所述分化培養(yǎng)基為:MS+ZT0.5 ?3.0 mg/L+IBA0.1 ?0.5 mg/L + TDZ0.5 ?2.0 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 5 g/L, pH 值為 5.8 ;
(4)將步驟(3)中得到的芽切分成單芽，接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30?40d，芽長到2?5 cm ；
所述壯芽培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂5 g/L，pH值為
5.8 ；
(5)將步驟(4)中得到的壯芽的基部切掉，接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)45?55d，得到走馬胎組培苗；
所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA2.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 5 g/L, pH值為5.8。
[0007]所述愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照時間為12 h/d，光照強(qiáng)度為2000 Lx0
[0008]所述培養(yǎng)基中，2，4-D為2，4- 二氯苯氧乙酸，6_BA為芐氨基嘌呤，TDZ為噻重氮苯基脲，ZT為玉米素，IBA為吲哚-3- 丁酸，NAA為a-萘乙酸，試劑均為分析純，水為超純水。
[0009]所述培養(yǎng)基中附加TDZ對走馬胎愈傷組織增殖和分化具有促進(jìn)作用，在研究細(xì)胞分裂素(6-BA、KT、ZT)對走馬胎愈傷組織分化影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ZT效果顯著。
[0010]所述增殖系數(shù)為增殖后的體積與增殖前的體積的比值。
[0011]所述分化率是分化出芽的愈傷組織塊數(shù)與總的愈傷組織塊數(shù)比值；所述分化系數(shù)是愈傷組織分化出的芽數(shù)與愈傷組織塊數(shù)的比值。
[0012]本發(fā)明走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法，采用走馬胎種子無菌播種獲得無菌植株，以無菌植株的莖段和芽進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織為植物器官、組織脫分化的分生細(xì)胞經(jīng)持續(xù)分裂增生成細(xì)胞團(tuán)，是植物快繁的新手段。通過愈傷組織分化成芽的途徑可以快速獲得大量芽，從而彌補(bǔ)一些植物組織培養(yǎng)階段的叢生芽增殖系數(shù)低的缺陷。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):采用本發(fā)明方法可以在愈傷組織分化階段快速增加走馬胎的芽數(shù)，可在短時間內(nèi)獲得大量走馬胎組培苗，從而降低培養(yǎng)成本，節(jié)約能耗。而且本方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，可工廠化生產(chǎn)走馬胎的種苗，為走馬胎可持續(xù)利用和保護(hù)生態(tài)環(huán)境多樣性奠定基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
一種走馬胎愈傷組織誘導(dǎo)及組培苗快繁方法，包括以下步驟:
(I)在超凈工作臺上，將走馬胎種子用75%乙醇溶液滅菌I min，無菌水清洗I次，再用0.1%升汞(HgCL2)溶液滅菌10 min，無菌水清洗5次，放到滅菌過的濾紙上吸干水分，接入MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，種子萌芽，得到無菌植株；將無菌植株的莖段和芽接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，誘導(dǎo)率為100% ；
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂5g/L, pH 值為 5.8 ;
(2)在超凈工作臺上，將走馬胎的莖段和芽誘導(dǎo)得到愈傷組織切分成0.2 cmX0.2 cm小塊，接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，增殖系數(shù)為3.7，愈傷組織為青色致密組織；
所述增殖培養(yǎng)基為:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 5 g/L, pH 值為 5.8 ;
(3)在超凈工作臺上，取出步驟(2)中得到的愈傷組織切分成0.5 cmX0.5 cm小塊，接入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，分化率為100%，分化系數(shù)為4.2，芽較壯，葉色翠綠；
所述分化培養(yǎng)基為:MS+ZT0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 5g/L, pH 值為 5.8 ;
(4)將步驟(3)中得到的芽切分成單芽，接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，芽長到2?5 cm；
所述壯芽培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂5 g/L，pH值為
5.8 ；
(5)將步驟(4)中得到的壯芽的基部切掉，接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)45d，得到走馬胎組培苗；