牛a型口蹄疫廣譜多表位疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛A型口蹄疫廣譜多表位重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于獸用疫苗研究領(lǐng)域。本研究采用全新的反向疫苗學(xué)研究理念和策略，將國內(nèi)流行毒株與我國接壤國家最近流行的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位進(jìn)行合理的串聯(lián)后，與牛IgG重鏈恒定區(qū)偶聯(lián)，克隆入原核表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)重組抗原并采用Ni-NAT層析柱純化后，經(jīng)Bio-Rad蛋白定量試劑盒定量后單獨(dú)或與重組口蹄疫病毒3D蛋白配伍制備疫苗，動物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是多表位抗原單獨(dú)還是與3D蛋白配伍均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的保護(hù)性抗體，同時能夠保護(hù)免疫動物抵抗同源病毒的攻擊，因而本發(fā)明具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種牛A型口蹄疫疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明尤其涉及一種牛 A型口蹄疫廣譜多表位重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于獸用疫苗研究領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫作為主要經(jīng)濟(jì)畜種豬、牛和羊的重大動物疫病不僅嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康 發(fā)展，而且涉及動物源性食品安全以及其外貿(mào)出口。一旦發(fā)生疫情損失慘重，政治影響惡 劣。滅活疫苗在防控FMD疫情中發(fā)揮著十分重要的作用，但由于生產(chǎn)此類疫苗需要建設(shè)防 止病原體逃逸的高級別生物安全生產(chǎn)車間，區(qū)分疫苗免疫和自然感染動物（DIVA)。更為嚴(yán) 重的是病毒滅活不完全有引起疫苗毒株流行的危險(xiǎn)。為此，1991年后歐盟成員國停止使用 滅活疫苗，美國也禁止在其本國生產(chǎn)和使用滅活疫苗。
[0003] 我國國內(nèi)口蹄疫疫情十分復(fù)雜，更為擔(dān)憂的是與我國接壤的中亞，南亞，東亞等地 區(qū)屬于口蹄疫頻繁流行的地區(qū)，尤其是印度半島素有口蹄疫"病毒庫"之稱，這給我國口蹄 疫防控造成了嚴(yán)重的威脅和壓力，曾多次發(fā)生口蹄疫毒株通過邊境交叉放牧等多種原因傳 入我國引起疫情的事例。因此，為了防止國內(nèi)毒株復(fù)燃及國外毒株的傳入，除了加大疫情監(jiān) 控外，研制能防控國內(nèi)外來流行毒株的新型廣譜疫苗顯得尤為重要，為防止國內(nèi)口蹄疫復(fù) 燃以及外來流行毒株傳入提供優(yōu)質(zhì)安全高效的新型疫苗儲備。
[0004] 采用分子生物學(xué)，蛋白組學(xué)以及反向疫苗學(xué)等相關(guān)技術(shù)研發(fā)安全高效的FMD新 型疫苗已經(jīng)成為疫苗研制的熱點(diǎn)課題。目前，已經(jīng)有我國上海復(fù)旦大學(xué)鄭趙鑫教授研制 的豬〇型口蹄疫病毒重組疫苗申獲了專利，并獲得農(nóng)業(yè)部頒布的一一類新獸藥證書II， 但該產(chǎn)品至今沒有實(shí)現(xiàn)商品化。我們實(shí)驗(yàn)室通過新技術(shù)研制的牛和羊Asial型口蹄疫 重組多表位疫苗經(jīng)動物免疫效力試驗(yàn)證實(shí)具有良好的免疫原性，并申獲了相關(guān)技術(shù)的專 利，其發(fā)明名稱分別為"牛口蹄疫病毒Asial型重組多表位疫苗及其制備方法"（專利 號：ZL200910259363. 6)和"羊口蹄疫病毒Asial型多表位疫苗及其制備方法"（專利號： ZL200910224025. 9)〇
[0005] 如今，利用反向疫苗學(xué)技術(shù)研制新型疫苗已經(jīng)成為未來疫苗發(fā)展的趨勢。傳統(tǒng)滅 活疫苗生物安全的不確定性加速了研究口蹄疫新型疫苗的進(jìn)程。值得一提是，近年來通過 增加 T細(xì)胞表位，并輔以宿主自身免疫分子為載體蛋白以加強(qiáng)抗原遞呈能力、增加分子量、 促進(jìn)B細(xì)胞成熟分化等手段和策略明顯改善了疫苗的免疫原性。同時解決了多表位廣譜抗 原基因的多次串聯(lián)后表達(dá)效率低下等技術(shù)瓶頸，不僅能獲得大量高純度靶標(biāo)蛋白，而且也 能保證所表達(dá)靶標(biāo)蛋白的免疫原性，這為研制口蹄疫廣譜多表位疫苗，防止由于抗原譜單 一導(dǎo)致免疫失敗提供了很好的技術(shù)支持和理論依據(jù)。
[0006] 為此，本發(fā)明采用分子生物學(xué)技術(shù)以及先進(jìn)的設(shè)計(jì)理念，設(shè)計(jì)并合成了我國國內(nèi) 曾經(jīng)流行毒株與我國接壤國家分離的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位序列，設(shè) 計(jì)涵蓋國內(nèi)外近年來流行毒株的主要抗原表位，研制針對國內(nèi)外來流行毒株的廣譜多表位 疫苗，為防控國內(nèi)A型口蹄疫復(fù)燃及外來毒株傳入具有重要的意義，為我國防控A型口蹄疫 提供戰(zhàn)略儲備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種牛A型口蹄疫廣譜多表位重組抗原，該抗原涵蓋 了國內(nèi)流行毒株與我國接壤國家最近流行的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位；
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供所述重組抗原在制備牛A型口蹄疫廣譜疫苗中的應(yīng) 用；
[0009] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗，其含有本發(fā)明所 述的重組抗原。
[0010] 為了達(dá)到所述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明的一種牛A型口蹄疫廣譜多表位重組抗原，其特征在于所述的重組抗原是 將國內(nèi)流行毒株與我國接壤國家最近流行的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位 進(jìn)行合理的串聯(lián)后，與牛IgG重鏈恒定區(qū)偶聯(lián)后構(gòu)建得到，所述的重組抗原含有以下（a)或 (b)所示的氨基酸序列：
[0012] (a) SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列；或
[0013] (b)將SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失 或插入而獲得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0 :6所 /_J、1 〇
[0015] 編碼所述的重組抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a)、（b)或（c)所示的 核苷酸序列：
[0016] (a) SEQ ID N0 :5所示的核苷酸序列；或
[0017] (b)編碼SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或
[0018] (c)編碼具有多表位抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將 SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
[0019] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0020] 含有本發(fā)明所述的核苷酸序列的重組表達(dá)載體以及含有該載體的宿主細(xì)胞也在 本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。
[0021] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了本發(fā)明所述的多表位重組抗原在制備預(yù)防牛A型口蹄 疫廣譜疫苗中的應(yīng)用。及
[0022] 所述的核苷酸序列在制備預(yù)防牛A型口蹄疫廣譜疫苗中的應(yīng)用。
[0023] -種牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗，其特征在于含有本發(fā)明所述的多表位重組抗 原。
[0024] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，所述的多表位疫苗還含有口蹄疫病毒3D蛋白的 全長氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全長氨基酸序列如SEQ ID N0 :8所示。
[0025] 本發(fā)明采用全新的反向疫苗學(xué)研究理念和策略，將國內(nèi)流行毒株與我國接壤國家 最近流行的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位進(jìn)行合理的串聯(lián)后，與牛IgG免疫 刺激片斷（IgG重鏈恒定區(qū)）偶聯(lián)，克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒如pET-30a ( + )構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（BL21、BL21 (DE3)或BL21 (DE3) pLys系列等）表達(dá)重組抗原并采 用Ni-NAT層析柱純化后，經(jīng)Bio-Rad蛋白定量試劑盒定量后單獨(dú)或與重組口蹄疫病毒3D 蛋白配伍制備疫苗，動物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是多表位抗原單獨(dú)還是與3D蛋白配伍均 能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的保護(hù)性抗體，同時能夠保護(hù)免疫動物抵抗同源病毒的攻擊，本 發(fā)明具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為重組表位抗原單獨(dú)或與3D蛋白聯(lián)合免疫豚鼠效力試驗(yàn)結(jié)果；結(jié)果顯示，在 加強(qiáng)免疫后，抗原單獨(dú)或與3D蛋白聯(lián)合免疫豚鼠均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體，第 二次加強(qiáng)免疫后血清抗體效價(jià)進(jìn)一步升高，顯示出該抗原具有良好的免疫原性；
[0027] 圖2為重組抗原免疫牛實(shí)驗(yàn)結(jié)果；結(jié)果顯示，重組抗原能夠誘導(dǎo)宿主動物產(chǎn)生口 蹄疫特異性中和抗體，加強(qiáng)免疫后，保護(hù)性抗體水平進(jìn)一步升高。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0029] 實(shí)施例1牛A型口蹄疫多表位重組抗原的制備
[0030] 1、A型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息學(xué)分析：
[0031] 口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1是病毒的優(yōu)勢抗原，無論是分離純化的天然VP1蛋白還 是重組表達(dá)產(chǎn)物都能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，具有型特異性。A型口蹄疫病毒VP1基 因全長639個核苷酸，編碼一條213個氨基酸的蛋白，其主要抗原表位集中在140 - 160位 氨基酸和200 - 213位氨基酸區(qū)段。本研究用DNAStar生物軟件對國內(nèi)流行毒株A/WH/09、 A/XJKT/58和GSLX/62毒株與我國接壤一些國家最近分離的牛A型口蹄疫病毒代表毒株 (NCBI登錄號：FJ755067, HQ666886和AY59371)進(jìn)行序列分析，確定了優(yōu)勢抗原表位為 135 - 160位氨基酸，并確定以200 - 213位氨基酸為另外一個B抗原表位，同時添加了 VP1 區(qū)21 - 40位的保守氨基酸序列為T細(xì)胞表位。
[0032] 2、基因克隆及其蛋白表達(dá)，純化
[0033] 多表位基因的設(shè)計(jì)及其合成：為了防止在構(gòu)建基因時出現(xiàn)新表位，在相鄰兩表位 之間引入能保證各個表位結(jié)構(gòu)正確展示的間隔子序列GGGS。為了保證合成的基因正確以及 方便操作，本研究將基因分成2部分合成，將國內(nèi)流行毒株的表位串聯(lián)作為第一個基因 E1， 串聯(lián)順序?yàn)?21-40-135-160 (A/WH/09) -135-160 (XJKT58) - 200-213 (GSLX/62)，并 在基因的5' -端和3' -端分別引入特異性酶切位點(diǎn)如EcoR I和Hind III ;國外流行毒株的 表位串聯(lián)后作為第二個基因 E2,多表位基因的串聯(lián)順序?yàn)?1-28-135-160 (FJ755067) - 135-160 (HQ666886) -140-160 (AY59371) - 200-213 (FJ755067)，并在基因的 5'-端和 3' -端分別引入特異性酶切位點(diǎn)如BamH I和EcoR I，多表位重組抗原基因序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，多表位基因委托生工生物工程(上海） 股份有限公司合成。將合成的多表位基因和原核表達(dá)載體pET-30a ( + )分別用EcoR I和 Hind III、BamH I和EcoR I酶切，純化回收后插入用相應(yīng)酶線性化pET-30a ( + )載體，構(gòu)建 重組表達(dá)質(zhì)粒PE2E1，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)進(jìn)行陽性篩選，通過序列測定確定陽性重組子。
[0034] 牛IgG重鏈恒定區(qū)基因（CIgG)的PCR擴(kuò)增：用primer5. 0引物軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增牛 I gG重鏈恒定區(qū)基因全長的特異性引物，正鏈引物：5-AAGACGGCCCCATCGGT-3，負(fù)鏈引物： 5-TTTACCCGGAGTCTTGGA-3,獲得包含IgG重鏈區(qū)的目的基因，牛IgG重鏈恒定區(qū)核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示，然后用帶有酶切位點(diǎn)的 特異性引物 Cattle IgG HC Hind III，5-aagcttgcGCCTCCACCACAGCCCCGAAA-3;Cattle IgG HC xho I 5-ctcgagcTTTACCCGCAGACTTAGAGGTGGAC-3 對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增、純化、回收，用 Hind III /xho I雙酶切后，插入相應(yīng)酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒ρΕ2Ε1構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ElE2CIgG，該質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及序列測定為陽性后-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 重組蛋白的表達(dá)及其生物活性鑒定：將陽性重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) (Novagen)，挑選單克隆接種LB培養(yǎng)液（Kan+)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式鑒定后，大規(guī)模 化表達(dá)重組蛋白，即從LAB平板上挑單菌落接種5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng) 箱220rmp過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物按1%加入新制備的無菌LB培養(yǎng)液中（kan+)，于37°C 培養(yǎng)箱220rmp培養(yǎng)至0D600 ~ 0. 4?0. 6時，于超凈臺無菌條件下加入0. 4mM的IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)4?6小時，2000rpm離心30min收獲培養(yǎng)物，按原培養(yǎng)物體積的20%加入蛋白裂解 液，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎處理（30min)，20000g離心20min收集沉淀（4°C )，棄上清。按 照Ni-NTA組氨酸純化柱（Novagen)說明書純化蛋白，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blotting分析，重組蛋白ElE2CIgG大小與預(yù)期相符，能與FMDV (A型）感染血清及辣根過 氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG發(fā)生免疫反應(yīng)，說明表達(dá)的重組蛋白具有生物活性。
[0036] 表達(dá)的重組蛋白即為本發(fā)明所述的牛A型口蹄疫廣譜多表位重組抗原，其氨基酸 序列如SEQ ID N0. 6所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。
[0037] 實(shí)施例2牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗的制備及免疫效力分析
[0038] 1、疫苗制備：
[0039] 純化蛋白（SEQ ID N0. 6所示，按照實(shí)施例1方法制備）經(jīng)Bio-Rad定量試劑盒定 量后稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋瑔为?dú)或與純化的3D蛋白片段(氨基酸序列如SEQ ID N0. 8所示，編 碼其的核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示）與重組抗原按1:2 (V/V)配置后，加入等體積的 油佐劑ISA206 (France)乳化成疫苗制劑。
[0040] 2、豚鼠免疫效力試驗(yàn)：
[0041] 用制備的疫苗，按每只豚鼠0. 2ml經(jīng)肌肉途徑接種豚鼠（20 μ g抗原或20 μ g抗原 +10 μ g3D蛋白)分別免疫5只豚鼠，免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是重組抗原單獨(dú)還是與3D蛋白 聯(lián)合免疫豚鼠均能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和高效價(jià)的FMDV保護(hù)性抗體，值得注意的是， 加強(qiáng)免疫后14天，血清特異性抗體效價(jià)和中和抗體效價(jià)明顯升高，提示具有良好的免疫效 果，經(jīng)第二次加強(qiáng)免疫后血清特異性中和抗體效價(jià)繼續(xù)升高（圖1)。用1000ID50的WH/09 毒株對免疫動物進(jìn)行攻擊，5/5獲得保護(hù)，提示不僅具有抗原譜寬，免疫效果好，而且能夠提 供完全保護(hù)，是一種十分具有發(fā)展前景的新型疫苗。
[0042] 3、牛體免疫效力試驗(yàn)
[0043] 用制備的疫苗，按每頭份2ml經(jīng)肌肉途徑接種免疫牛（500 μ g抗原或500 μ g抗 原+250 μ g3D蛋白）分別免疫5頭無口蹄疫特異性抗體及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體健康牛。結(jié)果顯 示，無論是重組抗原單獨(dú)還是與3D蛋白聯(lián)合免疫豚鼠均能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和高 效價(jià)的FMDV保護(hù)性抗體，加強(qiáng)免疫后14天，血清特異性抗體效價(jià)和中和抗體效價(jià)明顯升高 (圖2);免疫血清能夠中和多株A型毒株（WH/09, XJKT/58, GSLX/62和標(biāo)準(zhǔn)毒株)，中和抗體 效價(jià)為陽性（>1:64)，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，提示該疫苗具有良好的免疫效力和較好的廣譜性。接 種細(xì)胞未發(fā)生細(xì)胞病變（CPE)，提示抗原譜寬，免疫效果好。免疫動物注射部位沒有出現(xiàn)紅 腫、發(fā)熱等現(xiàn)象，也沒有出現(xiàn)接種不良反應(yīng)，食欲正常，精神狀態(tài)良好，提示本發(fā)明制備的牛 A型口蹄疫多表位疫苗具有良好的免疫原性，免疫豚鼠體后能夠產(chǎn)生高水平的保護(hù)性抗體， 接種后對免疫動物安全無害，是一種具有廣闊前景的新型疫苗，將對我國牛A型口蹄疫防 控提供物質(zhì)儲備和技術(shù)支撐，具有重要的意義。
[0001] 序列表 <11〇>屮B農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 <120>牛A型口蹄疫廣譜多表位重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用 <130> KLPI130187 <170> Fatentin 3.5 <210> 1 <211> 640 <212> DNA <213〉多袞位甫組抗原迤W序列（E1E2) <400> 1 ggatccgaqa cacaggttca gcgacgtcac ggtqgt.ggct ctaggtactc cacnactagt 60 cjgtggcagaa ggggcgacct ggggtctct.t gcggcgcggg tcgccgcaca gctacccagc 120 ggtgcrtggct ctaagtactc cgcggctagt gggcgcacac ggggcgacct gqgqcagctt 180 gca^cqcgcg tcgc jgccca act tcctgcc qgtgeTL^gcL ctay 'itcgay acqaqgcgaL 240 otggqgtccc tcgcqacgcq agtcqcgaca caaottcctg ctijqiq'；tqg ctctaqaca'j 3 00 a^qcagaaaa ttat Lgcccc tgcaaagcaa ctcctygaat t cqagacaca ^gttcagcg.^. 260 cqtcaccaca ctga-rgtcqg cttoatcata qacaggtttg tqijg^g^tqq ctctaagtac 420 tcLqcgcctg <jaacacggcq aggtgact to gggtclctcg cj^cgajacL 480 ct tcctqccg gtqqtqgctc taagtactc-r acaggta.atci cagcToa.^ao^ yq<|tqai：cta 540 gggtctcttg cgqcqagggt cgcaaa?cag cttcccgctij gt<fq -g^ctc Lc-uiacacnag €00 cagaaaatta ttgcccctgc aaagcagctc ctgcaagctt 640 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213〉多表位重組抗原基閃編碼氨基酸序列 <400> 2 i Cly Ser Glu Thr Gin Val Gin Arg Arg His Gly Gly Cly Ser Arg 16 Tyr Ser Thr Thr Gly Gly Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu 31 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gin Leu Pro Ser Gly Gly Cly Ser Lys 46 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Thr Arg Gly Asp Leu Gly Gin Leu 61 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly 76 Ser Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Thr Arg Val Ala Thr 91 Gin Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser Arg His Lys Gin Lys lie lie 106 Ala Pro Ala Lys Gin Leu Leu Glu Phe Glu Thr Gin Val Gin Arg 121 Arg His His Thr Asp Val Gly Phe He MET Asp Ai^g Phe Val Gly 136 Gly Gly Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu 151 Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gin Leu Pro Ala Gly Gly 166 Gly Sor Lys Tyr Sor Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Lou 181 Gly Scr Leu Ala Ala Arg Val Ala Lys Gin Lou Pro Ala Gly Gly 196 Gly Ser Arg His Lys Gin Lys He lie Ala Pro Ala Lys Gin Leu
[0002] 211 Leu Gin Ala <210 3 <211> 987 <212> DNA <213〉牛TgG flt鏈怛定區(qū)核昔酸序列 <400> 3 gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60 iccaccgz-qa ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgaciccggt gaccgtgacc 120 a at. cxjrj gi:gc c chga a Qa gc gqcg hq cs oa cctrtcc <3 g g o c g"h c c f. hcagt.cchcn ? β〇 gggctctaca ctctcagcag catggtgacc gtgcccggca gcacctcagg acagaccttc 240 acctqcaacq tagcccaccc ggccaqcagc accaaggtqg acaaggccgt tgaticccaca 300 tgcaaaccat caccctgtga ctgttgccca ccccctgagc ~ccccggagg acGctctgtc 360 二tcatct二cc caccgaaacc caaggacacc ctcacaatct cgggaacgcc cgaggtcacg 420 .(ji g I q;_：- ： ,<j<j 丨i cjac ccccj^qiji aql I ;：l m:\ y α I Lc;<j I (jcjac 480 gacgtggagq taaAcacagc cacgacgaag ccgagagagg agcagttcaa cagcacctac 540 cgcgtggr-ca gcgccctgcg catccagcac caggactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600 tiqcaaqa^cc acaacqaaqa cctcccqqcc cccatcqtaa qciaccatctc cacfqatcaaa S6.0 gggccggccc gcigagccgca ggtgt.atgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720 agcacggrca gcctcacct；j catggtcacc aacttctacc cagactacat cgccgtggaqc 780 ^.ggcagagaa acaggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgacccc gccccagctg 340 gccgccgaca gctcc.tactt cctgtacagc aagctcagag "igqacacrgaa cagGtggcaci 900 qaaqqaqacq cctacacqtq tqtqqtqatq cacqaqqccc rqcacaa-zca ctacacqcaq 960 aagtccacct ctaagtctgc gggtaaa 907 <210> 1 <211> 329 <212> PRT <213〉牛IgG重鏈恒定區(qū)基因編碼氨基酸序列 <400> 4 1 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys ￥al Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cjs 16 Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Len Val Ser 31 Ser Tyr MET I }ro Glu l^o Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala 46 Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 61 Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser MET ￥al Thr Val Pro Gly Ser Thr 76 Ser Gly Gin Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 91 Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro 106 Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val 121 Phe He Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr He Ser Gly 136 Thr Pro Giu Val Thr Cys Yal Val Val Asp Val Gly His Asp Asp 151 Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Yal Glu Ya.l Asn 166 Tlir Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thx- Tyx- 181 Arg Val Val Ser Ala. Leii Arg He Gin Ilis Gin Asp 丁rp Thr Gly
[0003] 196 ΓΠy Lys C!1u Phe Lys Cys Lys Val His Asn (llu ΓΠy ?烈l Pro Λ1 a 211 Pro lie Val Arg Thr lie Ser Arg He Lys Gly Pro Ala Arg Glu 226 Pro Gin Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gin Glu Glu Leu Ser Lys 241 Ser Thr VaL Ser Leu Thr Cys MET Val Thr Ser Phe Tyi" Pro Asp 256 Tyr lie Ala Val Glu Trp Gin Arg Asn Gly Gin Pro Glu Ser Glu 271 Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gin Leu Ala Ala Asp Ser Ser 286 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gin 301 Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Cys Val Val MET His Glu Ala Leu His 316 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys <210> 5 <211> 1635 <212> DNA <213〉多表位基因（E1E2)與牛IgG連接基因序列 <400> 5 ggatccxfaga cacagg~t.ca gcgacgtcac ggtggtggct ct.agqtactc cacaactggt 60 cjqtgqc.aqF.a gqg^ccaccf gggt:ct.c-11. qeggctcgcr;gcaca gc^acccagc ? 20 ggtggtggct ctaagtactc egeggetagt gggcgcacac gggcicgacct ggggcagc~t 180 qcggcgGgcg tcgccqccca acttcctgcc ggtggtggct ctgqttcgag aegaggegat 240 ctc/ggcrtccc tcgcgacgcg aqtcqcgaca cdactt丨::ctg ctggtggtgg ct(:iidig?-cac 300 aagcagaaaa ttattgccc.c tgcaaagcaa ctcctggaat tcgagacaca ggttcagcqa 36U cgtcaccaca ctgacgrcgg cttcatcatg gacaggt~tg tgggt.ggtgg ct.ctaagtac 420 tctgcgcctg caacacggcg aggtgacttg gggtctctcg eggegagget cgccgcacag 480 gt-ggi-gTjct.c： taa cagghaa tg c:a ggcaga eg eta 54 0 ggatetettg cggcgagggt cgcaaaacag cttcccactg gtggtggctc tagacacaag 600 cagaaaatta ttgcccctgc aaagcagctc otgcaagctt gcgcctccac cacagccccg 660 aaay LcLa<jc cLcLyaqLLc l.Lqc Lqcqqu qacaaqLcca ycLccaccq L yaccclyyqc 720 tgcctggtct ccagctacat. gcccqagccg gt.gaccgrga cctgqaactc gggt.gcccrg aagagcggcg tgcacacctt cccggccqftc cttcagtcct ccgggctcta cactctcaqo 840 aqcatqqtqa ccqtqcccqq caqcacctca qqacaqacct tcacctqcaa cqtaqcccac 900 ccq<：ic-cacjca gcaccaagqt i^gacaaqg.r.t gttgatccca catgcaaacc atcaccctgt 9Gij qactgttcTcc caccccctga gctccccgga qgaccctetg tcttcatctt cccaccgaaa 1020 cccaaggaca ccctcacaat. ctc<^ggaacg cccgaggrca cgtgtgtggt ggtgcfacg~g 10^0 ggccacgatg accccgaggt gaagttctcc tggtt.cqzgg acgacgtgga ggtaaacaca 1140 gc ca 〇ija or; a aefoe ga ga qa ijg a q o a g h h c aacagcacr:t'. n ccgcg'hci'gh r. a g c: g o c c ~ g 1 200 cgcatccagc accaggactg gactggagga aaggagtzca agtgcaaggt ccacaacgaa 1260 ggcctcccgg Gcccca~cgt gaggaccatc tccaggatca aaggaccggc ccgggagccg 1320 cac^qtqtatq tcct jacccc accccaggaa gagctcagca aaagca<^qgt cagcctcacc 1380 tgcatgqtca ccagct^cta c-ccagactac atcgccctgg aqtggc.agaci aaacgcigcag 1440 cctgagtcgg aggacaagt.a cggcacgacc ccgccccagc tggccgccga cagctcctac 1500 ttcctgtaca qcaagctcag ggtggacagg aacagctggc aggaaggaga cgcctacacg 1560 tgtgt ggt ga tgeaegagge cctgcacaat: cactacacgc agaagtccac ctctaagtct 1620 gcqggtaa^c tegag 1635 <210> 6
[0004] <211> 545 <212> PRT <213>多表位基因 (E1E2)與牛IgG連接基因序列編碼的氨基酸序列 <400> 6 1 Gly Ser Glu Thr Gin Val Gin Arg Arg His Gly Gly Gly Ser Arg 16 Tyr Ser Thi' Thr Gly Gly Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu 31 Ala Ala Arg Vai Ala Ala Gin Leu Pro Ser Gly Gly Giy Ser Lys 46 'i'yr Ser Aia Aia Ser Gly Arg Thr Arg Giy Asp Leu Giy (Un Leu B1 Aia Aia Arg Vai Aia Ala Gin Lem Pro Aia Giy G丄y Giy Ser Giy 76 Ser -Axg Arg Giy Asp Leu Giy Ser Leu Aia Thr Arg Vai_ A上a Thr 91 Gin leu Pro iUa Giy iUy Giy Ser Arg Uis Ly.s G丄n l^ys JJe 1 ie 106 Aia Pro Ala Lys Gin Leu Leu (Uu Hie Giu Thr Gin Vai iUn Arg 121 Arg His His I'hr Asp Val (τ?γ Phe lie MHT Asp Arg I Jhe Va! GIy 136 Gly Gly Ser Lys Tyr Ser Ala. Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp f^eu 151 Gly Ser Leu Ala Ala. Arg I ；eu Ala. Ala, Gin Leu Pro Ala Gly (rly 166 G1 y Ser Lys Tyr Ser Thr G1 y Asn A1 a y Arg Arg G1 y Asp Leii ?81 Gly Rer Leu Ala Ala. Arg Val Ala. I.ys Gin i,en Pro Ala Gly Gly 19B Gly Ser Arg His i.ys Gin Lys Tie Tie Ala. Pro Ala i,ys Gin f^eu 211 Leu Gin Ala Cys Ala. Ser Thr Thr Ala Pro i,ys Val Tyr Pro ?,θιι 226 Ser Ser Cys Cys Gly Asp f.ys Ser Ser Ser Thr Val Thr T.eu Gly 241 Cys Leu Val Ser Ser Tyr \fET Pro Gin F Jro Val Thr ￥al Thr Trp 256 Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Fro Ala Val 271 l.eu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser MET Yal Thr Val 286 Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gin Thr Pile Thr Cy.s Asn Val Ala His 301 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp F Jro Thr Cys 316 I^ys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Fro Glu Leu Pro Gly 331 Gly Pro vSer Val Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 346 Thr lie Ser Gly Thr Pro Glu Yal Thr Cys Val Val Val Asp Val 361 Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Yal Asp Asp 376 Val Glu Val Asn Thi' Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 391 Asn Ser Thr Tyr Arg Yal Val Ser Ala Leu Arg lie Gin His Gin 406 Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu 421 Gly Leu Pro Ala Pro lie Val Arg Thr lie Ser Arg lie Lys Gly 436 Pro Ala Arg Glu Pro Gin Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gin Glu 451 Glu Leu vSer Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys MET Val Thr Ser 466 Phe Tyr Pro Asp Tyr lie Ala Yal Glu Trp Gin Arg Asn Gly Gin 48i Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gin Leu Ala- 496 Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg 511 Asn Ser Trp Gin Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Cys Val Val MET His 526 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Thr Ser Ser 541 Ala Gly Lys Leu Glu <210> 7 <211> 1410
[0005] <212> DNA <213〉Π 蹄疫病毒3D全長篇因的核tT'酸序列 <400> 7 ggattgatag ttgacaccag aga~gttgag gagcgcgtgc atgtcatgcg caaaaccaag 60 ctcgcaccca ctgtggcaca cggcgtgtct aaccctgaat tcgggcctgc cgccttgtcc 120 aacaaagacc cgcgcctgga tgaaggagr-t gtcctcgatg aagccatctt ctccaaacac 180 aagggagaca caaagatgtc tgaggaggac aaagcgctgt cccgccgctg cgctgccgac 240 tacgcgtcgc gtctgcacag cgtgctgggt ac.ggcaaacg ccccactgag catctacgag 300 gcaatraagg gcgtcgacgg actugacgcc atggaaccag acaccgcgcc tggtcttccc 360 tgggczctcc aggggaaacg ccg:.ggtgcg ctcattgact tcgagsacgg cactgtcgga 420 cccgaggtta aagczqzczz agagctca~g gagaaaagag agtacaagtt tgcacgccaa 480 accttcctga aggacgaga~ tcgcc：cga~g gaaaaggtac gtgccggcag gactcgcatt 540 gtcgacgcct tgcc~gttga acacattc~t tacaccagga tgatgattgg cagattctgt 600 gctcaaatgc actcaaacaa cggaccgcaa atcggctcgg cggttggttg caatcctgat 660 gttgai:tggc aaagatttgg cacacattct gcccagtaca gaaacgtgtg ggatgtggac 720 tattcggcct ttgaugccaa ccactgcagt gacgcaatga acatcatgtt tgaggaggtg 780 ttcaacacgg acttcggttz ccacccaaac gczgagtgga tcctgaaaac tctcgtgaac 840 actgaacacg ccta~gagaa caaacgca~c ac~gttgagg gcgggargcc atctggttgt 900 tccgcaacaa gcatcatcaa cacaatttug aacaatatct acgtgctcta cgccttgcgt 960 agacactatg agggagttga gctggacact tacaccatga tctcttacgg agacgacatc 1020 gtggtrgcaa gtgaucacga tctggactut gaggccctca agcctcactt caaatccctt 1080 ggtcaaacca tcaczccagc cgacaaaagc gacaaaggtt ttgttcttgg tcactccatc 1140 accgargtca ctttcctcaa aagacact'ct cacatggatt acggaactgg gttttacaaa 1200 cctgtgatgg cttcgaagac cctcgaggct atcctctcct ttgcacgccg tgggaccata 1260 caggagaagt tgatctccgz ggcaggac~c gccgtccact ctggacctga cgagtaccgg 1320 cgtctctttg agccuttcca gggcctctut gagattccaa gctacagatc actttacctg 1380 cgttgggtga acgccgtgtg cgg:gacgca 1410 <210> 8 <211> 470 <212> PRT <213〉Π 蹄疫病毒3D全長旌因編碼的氨基酸序列（3DC.) <4D0> 8 Gly Leu lie Yal Asp Thr Arg Asp Yal Glu Glu Arg Yal His Val 15 MET Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Pho 30 Asn Pro Glu Phc Gly Pro Ala Ala Leu Scr Asn Lys Asp Pro Arg 45 Leu Asp Glu Gly Yal Val Leu Asp Glu Ala lie Phe Ser Lys His 60 Lys Gly Asp Thr Lys ΜΕ? Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Arg 75 Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Yal Leu Gly 90 Thr Asn Aia Pro Leu Ser lie I'yr (]丄u i丄e Lys Giy Vai 10& Asp Gly Leu Asp Ala MKT Glu Pro Asp Thr Ala I'ro Gly I.eu Pro 120
[0006] Trp Ala Leu Gin Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu lie Asp Phe Glu 135 Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Lys Ala Ala Leu Glu Leu MET 150 Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gin Thr Phe Leu Lys Asp 165 Glu lie Arg Pro MET Glu Lys Val Arg Ala Gly Arg Thr Arg lie 180 Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His lie Leu Tyr Thr Arg MET MET 195 lie Gly Arg Phe Cys Ala Gin MET His Ser Asn Asn Gly Pro Gin 210 lie Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gin Arg 225 Phe Gly Thr His Phe Ala Gin Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp 240 Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala MET Asn lie 255 MET Phe Glu Glu Val Phe Asn Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn 270 Ala Glu Trp lie Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr 285 Glu Asn Lys Arg lie Thr Val Glu Gly Gly MET Pro Ser Gly Cys 300 Ser Ala Thr Ser lie He Asn Thr lie Leu Asn Asn He Tyr Val 315 Leu Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr 330 Tyr Thr MET lie Ser Tyr Gly Asp Asp lie Val Val Ala Ser Asp 345 His Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu 360 Gly Gin Thr lie Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val 375 Leu Gly His Ser lie Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His Phe 390 His MET Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys Pro Val MET Ala Ser 405 Lys Thr Leu Glu Ala lie Leu Ser Phe Ala Arg Arg Gly Thr lie 420 Gin Glu Lys Leu lie Ser Val Ala Gly Leu Ala Val His Ser Gly 435 Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gin Gly Leu Phe 450 Glu lie Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn Ala 465 Val Cys Gly Asp Ala
【權(quán)利要求】
1. 一種牛A型口蹄疫廣譜多表位重組抗原，其特征在于所述的重組抗原是將國內(nèi)流行 毒株與我國接壤國家最近流行的牛A型口蹄疫病毒代表毒株的主要抗原表位進(jìn)行合理的 串聯(lián)后，與牛IgG重鏈恒定區(qū)偶聯(lián)后構(gòu)建得到，所述的重組抗原含有以下（a)或（b)所示的 氨基酸序列： (a) SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列；或 (b) 將SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插 入而獲得的仍具有多表位抗原功能的蛋白衍生物。
2. 如權(quán)利要求1所述的重組抗原，其特征在于所述的重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。
3. 編碼權(quán)利要求1所述的重組抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下（a)、(b)或（c) 所示的核苷酸序列： (a) SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；或 (b) 編碼SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或 (c) 編碼具有多表位抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
4. 如權(quán)利要求3所示的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所 /_J、1 〇
5. -種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列。
6. -種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
7. 權(quán)利要求1或2所述的多表位重組抗原在制備預(yù)防牛A型口蹄疫廣譜疫苗中的應(yīng) 用。
8. 權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列在制備預(yù)防牛A型口蹄疫廣譜疫苗中的應(yīng)用。
9. 一種牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述 的多表位重組抗原。
10. 如權(quán)利要求8所述的牛A型口蹄疫廣譜多表位疫苗，其特征在于還含有口蹄疫病 毒3D蛋白的全長氨基酸序列，所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全長氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
【文檔編號】C12N15/62GK104119441SQ201310144390
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】?；菔|, 邵軍軍, 林彤, 叢國正, 獨(dú)軍政, 高閃電 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所