專利名稱：一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測口蹄疫病毒的器具，特別是涉及一種快速鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth-disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動物的一種烈性傳染性疫病。FMDV具有多型性、易變性、宿主廣泛性、傳染力極強等特點，一旦發(fā)病即呈流行性、大爆發(fā)性。FMD的爆發(fā)和流行常給發(fā)病地區(qū)造成巨大損失，除動物死亡造成的直接經(jīng)濟損失外，還有動物患病期間肉和奶的生產(chǎn)停滯、病愈后肉和奶的產(chǎn)量長期下降 以及種用價值喪失等較大損失。更為嚴重的是，F(xiàn)MD是一種烈性傳染病，具有極強的傳染性，對于發(fā)病動物以及接觸病原的同群動物，必需進行嚴格隔離、封鎖、禁止動物移動和畜產(chǎn)品上市等。因此，F(xiàn)MD導致發(fā)病地區(qū)甚至發(fā)病國家的畜產(chǎn)品進出口貿(mào)易停止，除造成巨大的經(jīng)濟損失外，還產(chǎn)生一定的政治影響。疫苗接種是發(fā)展中國家控制FMD的主要策略，由于FMD固有的特點，目前國內(nèi)外的疫苗只能保護免疫動物不發(fā)生FMD，但是這種方法不能防止免疫動物再次發(fā)生FMDV的感染。在疫區(qū)的免疫動物群中，有一定數(shù)量的動物是病毒攜帶者，這些動物有可能持續(xù)向外排毒，在牛、羊體內(nèi)形成持續(xù)性感染的病毒可長期存在。這些隱性感染或帶毒的動物不但可能引發(fā)新的疫情，還為病毒變異和產(chǎn)生新毒株提供了環(huán)境。因此，F(xiàn)MDV疫苗免疫動物抗體水平以及如何區(qū)分免疫動物和病毒感染動物是控制FMDV的關(guān)鍵問題。目前使用的FMDV疫苗主要是滅活疫苗和合成肽疫苗。滅活疫苗免疫動物后，動物體內(nèi)不會有病毒增殖，疫苗生產(chǎn)中在病毒純化過程中已經(jīng)去除了絕大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP)，沒有了非結(jié)構(gòu)蛋白的表達，因而在免疫動物體內(nèi)就不會有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的產(chǎn)生，多肽疫苗本身就是FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VPl上的一個主要抗原表位，更沒有非結(jié)構(gòu)蛋白的存在。而FMDV感染的動物體內(nèi)，在病毒裝配過程中有大量非結(jié)構(gòu)蛋白的表達，刺激機體產(chǎn)生相應的非機構(gòu)蛋白抗體。結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測可以監(jiān)控動物的免疫狀態(tài)和抗體產(chǎn)生水平，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測技術(shù)為區(qū)分感染動物和免疫動物提供依據(jù)，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白檢測技術(shù)的結(jié)合可以達到一步檢測FMDV免疫抗體水平以及區(qū)分FMDV感染動物和疫苗免疫動物的目的。目前實驗室檢測FMDV抗體的方法有(I)病毒分離從患病動物的病料中分離出病毒，再對分離到的病毒進行培養(yǎng)鑒定做出診斷，確定是否FMDV感染。這種技術(shù)準確可靠，但敏感性差，而且有些樣品中存在補體活性，影響檢測效果，并且需要專門的實驗室。(2)病毒中和試驗利用病毒與特異性血清中和抗體的相互作用，從而使病毒失去對易感動物和敏感細胞的感染能力，這一方法必須使用活病毒，普通實驗室不能操作。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):主要有區(qū)分感染與免疫的非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA (I-ELISA)和檢測疫苗免疫動物的血清抗體水平的液相阻斷ELISA。ELISA方法測定時具有特異、敏感等優(yōu)勢，但操作復雜、費時、費力，需要特定的儀器設備和專業(yè)技術(shù)人員，很難在基層普及推廣。同時，液相阻斷ELISA方法需要滅活病毒的參與，因此，還存在病毒滅活不全或病毒逃逸等風險。此外，近年來隨著豬O型FMD合成肽疫苗的推廣應用，已經(jīng)逐步占據(jù)了主要市場，傳統(tǒng)的液相阻斷ELISA很難對多肽疫苗抗體做出準確的檢測結(jié)果。因此，研究一種簡便快速、一步可以檢測疫苗免疫和病毒感染的實時在線檢測技術(shù)，非常重要而迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體存在的缺陷，提供一種特異性強、敏感性高、簡便、快速鑒別口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體的免疫金標試紙條，該試紙條具有特異性強、敏感性高、使用簡便、成本低的優(yōu)點；
本發(fā)明還提供了鑒別口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體的免疫金標試紙條的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案 一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡，所述金標抗體纖維層上吸附有膠體金標記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標抗體纖維層用玻璃棉制成。所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧甲基纖維素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。所述纖維素膜層上含有一條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“ I I ”、“十十，，、“丁丁，，、“丄丄，，、“ I- ρ，、“~| H，，和“籲 ”中的任一種；纖維素膜層上含有兩條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“ I I I ”、“十十十”、“I -T丁”、“丄丄丄，，、“ [_，，、“_! ” 和“# # 籲”中的任一種。在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線。所述試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟
(1)大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的制備；
(2)膠體金標記的葡萄球菌蛋白A的制備以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，進而獲得膠體金標記的SPA ；
(3)羊抗或兔抗SPA的IgG抗體的制備
用所得的大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種分別在纖維素膜層上制成檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制成對照印跡；將膠體金標記的葡萄球菌蛋白A用于制備金標抗體纖維層，然后將支撐層、吸附層和保護層依次組裝成試紙條。所述試紙條的制備方法中，大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原的制備方法如下
根據(jù)O型FMDV VPl模板基因序列設計一對特異性引物上游引物5’ ATAGGATCCA
TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3 ’ 弓丨入酶切位點 Bamm，下游引物 5 ’ ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3 ’弓丨入酶切位點Hindi 11 ；以重組質(zhì)粒pMD18T_VPl為模板，進行PCR擴增，獲得VPl基因；PCR產(chǎn)物經(jīng)漢3ΜΠ和歷ii/III雙酶切消化克隆到PET-28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將重組菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600達到O. 6時，加入終濃度為O. 5mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，在37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀；
將得到的菌體重懸于20毫升緩沖液中，超聲破碎后離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次，將沉淀懸于20毫升懸浮液中洗滌I次，最后離心沉淀得到純化后的包涵體；將純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中，于4°C攪拌10小時，離心去除不溶物，得到變性蛋白；取90毫升變性蛋白裝入透析袋，并將透析袋放入I. 8升復性緩沖液中，4°C條件下攪拌透 析，每5小時換液一次,換液4次后用I. 8升PBS透析4次,前兩次透析12小時/次,后兩次透析6小時/次；收集透析袋內(nèi)的液體,經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘,棄去沉淀，將上清用O. 45微米濾膜過濾；用20KD的濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，于_20°C冷凍保存。所述試紙條的制備方法中，大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的制備方法如下
將重組質(zhì)粒PGEM-T-3ABC用SalI和BglII酶切消化，回收目的片段3ABC ;用XholI和BglII對表達載體pTriEX-4Neo進行消化，用T4 DNA Ligase連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，得到重組菌，將重組菌接種到LB培養(yǎng)液中，37°C、250 r/ min搖至0D600達O. 5 ;加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其濃度為O. 5mmol/L, 37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀；
將得到的菌體重懸于20毫升緩沖液中，超聲破碎后離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次，將沉淀懸于20毫升懸浮液中洗滌I次，最后離心沉淀得到純化后的包涵體；將純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中，于4°C攪拌10小時，離心去除不溶物，得到變性蛋白；取90毫升變性蛋白裝入透析袋，并將透析袋放入I. 8升復性緩沖液中，4°C條件下攪拌透析，每5小時換液一次,換液4次后,用I. 8升PBS透析4次,前兩次透析12小時/次,后兩次透析6小時/次；收集透析袋內(nèi)的液體,經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘,棄去沉淀，將上清用O. 45微米濾膜過濾；用20KD的濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，于_20°C冷凍保存。所述緩沖液的組成為10mmol /I,的 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl > 10 mmol/LEDTAUO %體積的甘油、2 mmol/L DTT ;所述洗液的組成為1 %體積的Triton_100、50mmol/L Tris-HCl> 100 mmol/L NaCl> 10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT ;所述懸浮液的組成為50 mmol/L Tris-HClUOO mmol/L NaClUO mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT。所述變性劑的組成為尿素8mol/L、NaCl 0. 5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA20mmol/L、SDS 2% ;所述復性緩沖液的組成為Tris_HCl 50mmol/L pH 8. 0、NaCl IOmmol/L、EDTA 10 mmol/L、DTT 2mmol/L、氧化型谷胱甘肽I mmol/L、還原型谷胱甘肽I mmol/L、PMSF 0. 5 mmol/L。
本發(fā)明的積極有益效果
I、聯(lián)合檢測，高效實用本發(fā)明的試紙條首次利用原核表達的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測線，達到了一步檢測口蹄疫病毒感染抗體和疫苗免疫抗體的目的。其中結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測能夠監(jiān)控動物的免疫狀態(tài)和抗體水平，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測技術(shù)為區(qū)分感染動物和免疫動物提供依據(jù)，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白檢測技術(shù)的結(jié)合達到了一步檢測FMDV免疫抗體水平以及區(qū)分FMDV感染動物和疫苗免疫動物的目的。因此本發(fā)明的試紙條檢測效率高，具有重要的實際應用價值。2、檢測特異性強、敏感性高本發(fā)明試紙條以膠體金標記的SPA為基礎制備而成，金標SPA中的金顆粒與抗原或SPA分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的特異性影響很小，也不影響SPA與抗體的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合，且具有較高的標記率。因此，本發(fā)明的試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到2納克的相應抗體蛋白?！?、操作簡便、快速本發(fā)明的試紙條檢測過程中無需附加其它儀器和試劑，只要將其測試端插入待檢血清中30秒左右，等5分鐘左右即可判定檢測結(jié)果。4、結(jié)果顯示直觀、準確試紙條以顯示棕紅色的檢測印跡和對照印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜層上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示在被檢血清中既無FMDV感染抗體也無FMDV疫苗免疫抗體，即被檢動物無FMDV感染也無FMDV免疫或免疫不合格；若在纖維素膜層上顯示一條棕紅色對照印跡C和兩條棕紅色檢測印跡P、J，則表示被檢動物有FMDV感染；若在纖維素膜層上顯示一條棕紅色對照印跡C和一條棕紅色檢測印跡P，則表示在被檢血清中含有FMDV疫苗免疫抗體；結(jié)果判定直觀、準確、簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性的誤判。5、生產(chǎn)系統(tǒng)可靠本發(fā)明中的檢測印跡采用大腸桿菌表達系統(tǒng)作為生產(chǎn)系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)的研究較為深入，已經(jīng)過反復驗證，作為生產(chǎn)系統(tǒng)時培養(yǎng)條件簡單、基因操作容易，從構(gòu)建到產(chǎn)物純化周期較短，成本低，產(chǎn)量高，適合于工業(yè)化應用。6、投資少，成本低使用本發(fā)明試紙條不需要另配其它儀器、設備和試劑，節(jié)省大量儀器、設備和附加試劑費用；一條試紙條一次可以檢測一種或兩種抗體，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進行實時在線檢測，無需支付專家診斷費及相關(guān)費用，可節(jié)省檢測成本，降低檢測費用。7、應用范圍廣，便于推廣本發(fā)明的試紙條操作簡單成“一步式”、“傻瓜式”，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟、社會效益。


圖I本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意 圖2本發(fā)明試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式以下實施例是為了進一步說明本發(fā)明，并不表示對本發(fā)明的限制。文中如沒有特別說明，其中的百分含量均為質(zhì)量百分含量。要制備一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，先制備大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原，以及抗SPA的IgG抗體，然后制備金標抗體纖維層、檢測印跡和對照印跡。I、羊抗或兔抗SPA的IgG抗體的制備
以每公斤體重50微克SPA的用量，經(jīng)皮下和肌肉注射陰性健康羊(或家兔)3 4次，末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在I :2000以上，心臟采血或頸動脈放血,收集其高免血清。取I份血清加2份PBS液混勻，加等體積的飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內(nèi)2小時，在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄上清液；以適量PBS液溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內(nèi)2小時，在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，棄上清液，以少量PBS液溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS液過夜透析，換液2 3次，在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以飽和硫酸銨法提取的羊(或兔)抗SPA的IgG抗體，用于制備對照印跡。 2、大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的制備
(I)豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl在大腸桿菌中的表達及純化
根據(jù)O型FMDV VPl樽板基因序列設計一對特異件引物上游引物為5’ATAGGATCCATGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’ 引入酶切位點下游引物為 5，ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位點歷ii/III。以含VPl基因的重組質(zhì)粒pMD18T_VPl為模板，經(jīng)PCR擴增獲得VPl基因。其中PCR反應體系為模板pMD18T -VPl 0.5微升，上游引物0.8微升，下游引物O. 8微升，Ex Taqase預混酶25微升，雙蒸水22. 9微升。擴增程序94 °C預變性4分鐘，循環(huán)一次；94°C變性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸I分鐘，共循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘。PCR擴增所得的VPl基因經(jīng)漢3ΜΠ和歷ii/III雙酶切消化克隆到PET_28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，將重組菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、氨芐青霉素mg/L)中培養(yǎng)至0D600達到O. 6時，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其終濃度為O. 5mmol/L, 37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀。將菌體重懸于20毫升緩沖液中(緩沖液成分10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,150mmol/L NaClUO mmol/L EDTAUO % 甘油、2 mmol/L DTT、0. 5 mmol/L PMSF)超聲破碎后，離心收集沉淀，用洗液(洗液成分1 %體積的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaClUO mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT)洗滌包涵體5次；然后將沉淀于20毫升懸浮液中洗漆 I 次(懸浮液成分50 mmol /T, Tris-HCl pH 8·0、100 mmol/L NaCl> 10 mmoI /L EDTA、2 mmol/L DTT)，最后離心沉淀即為純化后的包涵體。將純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中(變性劑成分尿素8mol/L、NaCl0. 5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 20mmol/L、2% 的 SDS)，于 4°C 攪拌約 10 小時，溶解變性，離心去除不溶物，得到變性蛋白；將90毫升變性蛋白裝入透析袋中，放入I. 8升復性緩沖液(緩沖液成分50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、10mmol/L NaCl> 10 mmol/L EDTA、2mmol/L DTTU mmol/L氧化性谷胱甘肽、I mmol/L還原性谷胱甘肽、0. 5 mmol/L PMSF)中，4°C下磁力攪拌透析，每5小時換液一次,換液4次后用I. 8升PBS透析4次,前兩次12小時/次，后兩次6小時/次。收集透析袋內(nèi)液體，10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去沉淀，將上清液用O. 45微米濾膜過濾；然后用20KD濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，_20°C凍存，用于制備檢測印跡。(2)豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC在大腸桿菌中的表達及純化
將含3ABC基因的重組質(zhì)粒pGEM-T-3ABC用SalI和BglII酶切消化，回收目的基因片段3ABC。用XholI和BglII對表達載體pTriEx-4Ne0進行消化，使其產(chǎn)生兩個與目的片段相同的粘性末端；用T4 DNA Ligase連接兩粘性末端，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，將30微升重組菌接種到30毫升含有羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、羧芐青霉素50mg/L)中，37°C、250轉(zhuǎn)/分鐘搖至0D600達O. 5 ;加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其終濃度為O. 5mmol/L，于37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀。 將菌體重懸于20毫升緩沖液中(緩沖液成分10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,150mmol/L NaClUO mmol/L EDTAUO % 甘油、2 mmol/L DTT、0. 5 mmol/L PMSF)超聲破碎后，離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次(洗液成分1 %體積的Triton-100、50 mmol/LTris-HCl pH 8. OUOO mmol/L NaClUO mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT);然后將沉淀于 20毫升懸浮液中洗漆I次(懸浮液成分50 mmol/L Tris-HCl pH 8. 0、100 mmol/L NaCl> 10mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT),最后離心沉淀即為純化后的包涵體。將洗滌純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中(變性劑成分尿素8mol/L、NaCl 0. 5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 20mmol/L、2% SDS)，于 4°C 攪拌約 10 小時，溶解變性，離心去除不溶物，得到變性蛋白；將90毫升變性蛋白裝入透析袋中，放入I. 8升復性緩沖液(緩沖液成分50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0U0mmol/L NaClUO mmol/L EDTA,2mmol/L DTT> I mmol/L氧化性谷胱甘肽、I mmol/L還原性谷胱甘肽、0. 5 mmol/L PMSF)中，4°C下磁力攪拌透析，每5小時換液一次，換液4次后用I. 8升PBS透析4次，前兩次12小時/次，后兩次6小時/次。收集透析袋內(nèi)液體，10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去沉淀，將上清用0. 45微米濾膜過濾；用20KD濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，_20°C凍存，用于制備檢測印跡。3、金標SPA玻璃棉的制備
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠在50 100毫升沸騰的0. 01 0. 05%氯金酸水溶液中加入2 4毫升0. 5 2%的檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15納米左右的膠體金；以0. lmol/L的K2CO3調(diào)膠體金pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的標記比將待標記的SPA加入pH8. 5 9. 5的金溶膠中，標記10分鐘后加入20%的PEG10000至其最終濃度為0. 05%, 4°C >1500 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000轉(zhuǎn)/分鐘離心I小時，棄上清液，獲得膠體金標記的SPA ;將1:100 500稀釋的膠體金標記SPA吸附于精制玻璃棉中，4°C低溫真空干燥，制備出金標SPA玻璃棉。4、本發(fā)明試紙條的檢測原理
將試紙條測試端插入待測血清，待檢血清通過虹吸帶動待檢抗體及金標SPA玻璃棉中的金標SPA —起向纖維素膜層擴散，最終滲入手柄端的吸水材料層，擴散過程中待檢抗體與金標SPA相結(jié)合，該結(jié)合物進而與纖維素膜上的表達原檢測印跡結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡P和/或J ;而羊(兔)抗SPA的IgG抗體可與金標SPA結(jié)合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢血清中沒有FMDV病毒抗體和疫苗抗體，試紙條只顯示一條棕紅色對照印跡C ;如果血清中含有抗FMDV病毒抗體和/或疫苗抗體，則分別與其金標SPA結(jié)合，再與纖維素膜上的相應抗原檢測印跡P和/或J結(jié)合，顯示棕紅色檢測印跡，為陽性標記；如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。5、本發(fā)明試紙條的檢測方法
(I)檢測樣品的制備無菌取被檢動物的血液，并分離血清，以生理鹽水作1: 200倍的稀釋血清，得到待測樣品。(2)檢測步驟將試紙條測試端插入待檢測血清中，插入深度不超過標記線，約30秒后取出試紙條，水平放置I 5分鐘，觀察檢測結(jié)果。(3)結(jié)果判斷如果在試紙條纖維素膜層上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示檢測結(jié)果呈陰性，說明在被檢血清中未檢測出FMDV病毒抗體和FMDV疫苗抗體，即被檢動物無FMDV病毒感染和FMDV疫苗免疫；如果試紙條上的纖維素膜層上出現(xiàn)棕紅色的對照印跡·C和檢測印跡P，表示檢測結(jié)果呈陽性，即在待檢血清中檢測出FMDV疫苗抗體，即被檢動物已進行FMDV疫苗免疫；如果檢測印跡P、J同時出現(xiàn)，表示在待檢血清中檢測出FMDV病毒感染抗體，即被檢動物已感染或攜帶FMDV病毒；如果纖維素膜帶上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。以下實施例用于進一步說明本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)。實施例一一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，參見圖I、圖2，圖中支撐層I用硬質(zhì)塑膠薄片條制成，樣品吸附纖維層2用玻璃棉制成，金標抗體纖維層3用吸附有膠體金標記SPA的玻璃棉制成，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜制成，吸水材料層5用吸水濾紙制成；將樣品吸附纖維層2、金標抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5從左端(測試端)至右依次粘貼在支撐層I的硬質(zhì)塑膠薄片條上，彼此之間交界處的纖維互相交叉滲透；纖維素膜層4上有用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC兩種抗原液印制的檢測印跡分別為6-P和6-J，7為用羊(或兔)抗SPA的IgG溶液印制的對照印跡，檢測印跡、對照印跡形成的組合印跡帶為“ I I I”。8-1為覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面的白色保護膜，在兩層交界處對應保護膜8-1位置上偏向于樣品吸附纖維層2 —側(cè)O. 5cm處印有標記線9，標記線9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)的保護膜8-2。實施例二 試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
金標抗體纖維層3用吸附有膠體金標記SPA的玻璃棉制成，用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原液印制的檢測印跡6-P，用羊(兔)抗SPA的IgG溶液印制的對照印跡C，兩種印跡排列形成的組合印跡帶7為“ I I ”。實施例三試紙條結(jié)構(gòu)與實施例二基本相同，不同之處在于
金標抗體纖維層3用吸附有膠體金標記SPA的玻璃棉制成，用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原液印制的檢測印跡6-J，7為用羊(兔)抗SPA的IgG溶液印制的對照印跡，檢測印跡和對照印跡組合排列為“· ”。實施例四試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“ \ \ \ ”。實施例五試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維制成，纖維素膜層4采用羧甲基纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“ 籲”。實施例六試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維膜制成，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維素膜制成。實施例七試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于 支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“/ / /”。實施例八試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維素制成，纖維素膜層4采用羧甲基纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“十十十”。實施例九試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維素制成，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“I -T I”。實施例十試紙條結(jié)構(gòu)與實施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維素膜制成，纖維素膜層4采用纖維素膜制成，檢測印跡和對照印跡平行排列組合為“卜卜P’或H H ”。實施例i^一 本發(fā)明試紙條的敏感性和特異性試驗
敏感性取O型FMDV多肽疫苗和滅活疫苗免疫后第30天的豬血清各I份，分別做I:200、I:400、I:800、I:1600、I:3200、I:6400、I:12800、I:25600、I:51200、I:102400 倍稀釋，共10個稀釋度，取每個稀釋度的血清150μ 1，用實施例一的試紙條測定，5分鐘后測定結(jié)果，用TSR3000讀條儀讀值，評價試紙條的敏感性。結(jié)果表明，試紙條對O型FMDV多肽疫苗和多肽苗免疫后第30天豬血清的靈敏度均可達到1:12800。特異性該試紙條與豬瘟、豬乙型腦、豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)等抗體陽性血清均無交叉反應，特異性為100%。
權(quán)利要求
1.一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡，其特征是所述金標抗體纖維層上吸附有膠體金標記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標抗體纖維層用玻璃棉制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、纖維素 膜、羧甲基纖維素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層上含有一條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“ I I ”、“十十”、“丁丁”、“丄丄，，、“ I- ρ，、“·| H ”和“· ”中的任一種；纖維素膜層上含有兩條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“ I I I ”、“十十十，，、“丁丁 丁，，、“丄丄丄，，、“ I- I- —，，、“— H H，，和“· · ”中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項所述的試紙條，其特征是在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線。
6.權(quán)利要求I所述試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟 (1)大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的制備； (2)膠體金標記的葡萄球菌蛋白A的制備以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，進而獲得膠體金標記的SPA ； (3)羊抗或兔抗SPA的IgG抗體的制備 用所得的大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種分別在纖維素膜層上制成檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制成對照印跡；將膠體金標記的葡萄球菌蛋白A用于制備金標抗體纖維層，然后將支撐層、吸附層和保護層依次組裝成試紙條。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試紙條的制備方法，其特征是其中大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原的制備方法如下 根據(jù)O型FMDV VPl模板基因序列設計一對特異性引物上游引物5’ ATAGGATCCA TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3 ’ 弓丨入酶切位點 Bamm，下游引物 5 ’ ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3 ’弓丨入酶切位點Hindi 11 ；以重組質(zhì)粒pMD18T_VPl為模板，進行PCR擴增，獲得VPl基因；PCR產(chǎn)物經(jīng)漢3ΜΠ和歷ii/III雙酶切消化克隆到PET-28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將重組菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600達到O. 6時，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其濃度為O. 5mmol/L,在37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀； 將得到的菌體重懸于20毫升緩沖液中，超聲破碎后離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次，將沉淀懸于20毫升懸浮液中洗滌I次，最后離心沉淀得到純化后的包涵體；將純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中，于4°C攪拌10小時，離心去除不溶物，得到變性蛋白；取90毫升 變性蛋白裝入透析袋，并將透析袋放入I. 8升復性緩沖液中，4°C條件下攪拌透析，每5小時換液一次,換液4次后用I. 8升PBS透析4次,前兩次透析12小時/次,后兩次透析6小時/次；收集透析袋內(nèi)的液體,經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘,棄去沉淀，將上清用O. 45微米濾膜過濾；用20KD的濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，于_20°C冷凍保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述試紙條的制備方法，其特征是大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的制備方法如下 將重組質(zhì)粒PGEM-T-3ABC用SalI和BglII酶切消化，回收目的片段3ABC ;用XholI和BglII對表達載體pTriEX-4Neo進行消化，用T4 DNA Ligase連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，得到重組菌，將重組菌接種到LB培養(yǎng)液中，37°C、250 r/ min搖至0D600達O. 5 ;加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其濃度為O. 5mmol/L, 37°C誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀； 將得到的菌體重懸于20毫升緩沖液中，超聲破碎后離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次，將沉淀懸于20毫升懸浮液中洗滌I次，最后離心沉淀得到純化后的包涵體；將純化后的包涵體溶于pH為8. O的變性劑中，于4°C攪拌10小時，離心去除不溶物，得到變性蛋白；取90毫升變性蛋白裝入透析袋，并將透析袋放入I. 8升復性緩沖液中，4°C條件下攪拌透析，每5小時換液一次,換液4次后,用I. 8升PBS透析4次,前兩次透析12小時/次,后兩次透析6小時/次；收集透析袋內(nèi)的液體,經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心10分鐘,棄去沉淀，將上清用O. 45微米濾膜過濾；用20KD的濃縮管濃縮，3000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心30分鐘，收集濃縮蛋白，于_20°C冷凍保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述試紙條的制備方法，其特征是所述緩沖液的組成為10 mmol /I,的 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl> 10 mmol/L EDTA、10 % 體積的甘油、2 mmol/LDTT ;所述洗液的組成為1 % 體積的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT ;所述懸浮液的組成為50 mmol/L Tris-HCl> 100 mmol/LNaClUO mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述試紙條的制備方法，其特征是所述變性劑的組成為尿素 8mol/L、NaCl 0. 5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 20mmol/L、SDS 2% ;所述復性緩沖液的組成為Tris-HCl 50mmol/L pH 8. O,NaCl IOmmoI/L,EDTA 10 mmol/L,DTT 2mmol/L、氧化型谷胱甘肽I mmol/L、還原型谷胱甘肽I mmol/L、PMSF 0.5 mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條及其制備方法，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡，金標抗體纖維層上吸附有膠體金標記的葡萄球菌蛋白A，檢測印跡用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體溶液印制。本發(fā)明的試紙條特異性強，靈敏度高，簡便，直觀，準確，適用范圍廣，成本低，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地實時檢測，易于推廣應用。
文檔編號G01N33/68GK102818898SQ201210281588
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者張改平, 楊蘇珍, 盧清俠, 職愛民, 楊繼飛, 喬松林, 鄧瑞廣 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院