專利名稱：羧乙基海因酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了羧乙基海因酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-組氨酸的分解代謝途徑主要有以下5條:1、脫羧基成為組胺，進(jìn)一步氧化成為咪唑乙醛和咪唑乙酸；2、脫氨基成為尿刊酸，進(jìn)一步降解到谷氨酸，進(jìn)入谷氨酸代謝途徑；3、轉(zhuǎn)氨基作用形成咪唑丙酮酸，進(jìn)而還原為咪唑乳酸或咪唑乙酸；4、甲基化作用，形成1-或3-甲基組氨酸；5、與P -丙氨酸縮合反應(yīng)形成肌肽或鵝肌肽。其中第2條途徑是L-組氨酸代謝的最基礎(chǔ)途徑，從原核生物到真核生物的各個(gè)物種中都比較保守，由L-組氨酸經(jīng)脫氨、尿刊酸水解、一碳基團(tuán)轉(zhuǎn)移等階段得到L-谷氨酸，并由L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為a -酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)。對(duì)于細(xì)菌及哺乳動(dòng)物中由L-組氨酸至L-谷氨酸的降解途徑中涉及到的各種酶、中間產(chǎn)物、一些物種中編碼相關(guān)酶的基因定位、相關(guān)酶結(jié)構(gòu)解析已經(jīng)有了很多研究。但在所有的L-組氨酸代謝途徑圖中，均存在一個(gè)由L-組氨酸至L-谷氨酸的支路降解途徑。其標(biāo)明從4-咪唑酮-5-丙酸開(kāi)始，可以經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生L-海因-5-丙酸，進(jìn)而通過(guò)羧乙基海因酶和氨甲酰水解酶的作用水解成為L(zhǎng)-谷氨酸。相比于L-組氨酸一尿刊酸一4-咪唑酮5-丙酸一N-亞胺甲基谷氨酸一L-谷氨酸途徑，除了早期少數(shù)研究者進(jìn)行了一些初步的研究外，目前，這個(gè)支路途徑基本成為了一個(gè)“被遺忘的角落”。其中對(duì)于4-咪唑酮-5-丙酸氧化成為L(zhǎng)-海因-5-丙酸的步驟研究在20世紀(jì)50-60年代比較深入，而對(duì)于該支路途徑中兩步水解酶的分類、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和基因調(diào)控均是未知數(shù)。由于海因-5-丙酸在微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中檢測(cè)出了 L-氨甲酰谷氨酸的存在，因此，現(xiàn)有報(bào)道均認(rèn)為海因-5-丙酸在微生物細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)羧乙基海因酶(Carboxyethylhadantionase, CEHase, E.C.未分類)水解L_、D_或DL-海因-5-丙酸生成N-氨甲酰-L-谷氨酸，并進(jìn)一步在L-氨甲酰水解酶(L-Carbamoylase)的作用下水解產(chǎn)生L-谷氨酸。羧乙基海因酶雖然在催化反應(yīng)形式上與海因酶同屬一類，但由于多種原因，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)羧乙基海因酶的研究幾乎為空白。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供羧乙基海因酶生產(chǎn)菌株。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供羧乙基海因酶。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于表達(dá)羧乙基海因酶的重組載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供表達(dá)上述重組載體的宿主細(xì)胞及其該宿主細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供利用上述宿主細(xì)胞生產(chǎn)N-氨甲酰-L-谷氨酸的方法。技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種羧乙基海因酶生產(chǎn)菌，其分 類命名為糞產(chǎn)堿菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis),該菌株已于2013年5月13號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7585。其中，羧乙基海因酶生產(chǎn)菌株糞產(chǎn)堿菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)簡(jiǎn)寫(xiě)為 CW221。一種羧乙基海因酶，所述羧乙基海因酶來(lái)源于上述的羧乙基海因酶生產(chǎn)菌。所述的羧乙基海因酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的羧乙基海因酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。一種用于表達(dá)羧乙基海因酶的重組載體，其含有上述的核苷酸序列。所述重組載體為pET22b。一種宿主細(xì)胞，其含有上述的重組載體。所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。制備上述宿主細(xì)胞的方法，構(gòu)建上述的核苷酸序列的重組載體pET22b，并在大腸桿菌E.coli BL21中表達(dá)，獲得了產(chǎn)羧乙基海因酶的重組菌即宿主細(xì)胞。一種生產(chǎn)N-氨甲酰-L-谷氨酸的方法，以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞得到發(fā)酵液，經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取上清液加入羧乙基海因溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:羧乙基海因酶生產(chǎn)菌株糞產(chǎn)堿菌幾亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)的竣乙基海因酶的活性為0.064U/ml,純化后的酶活可以達(dá)到0.61U/ml，構(gòu)建的基因工程菌的酶活為3.06U/ml，重組菌發(fā)酵方法簡(jiǎn)單。對(duì)底物轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)以后對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到95%，4小時(shí)的轉(zhuǎn)化率為99.98%，在催化羧乙基海因 合成中都有較好的應(yīng)用前景。


圖1為菌株幾產(chǎn)喊菌幾亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)的竣乙基海因酶的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道I =Marker ;泳道2:60% 80%硫銨沉淀；泳道3:DEAE-Sepharose純化后酶液；泳道4, 5:15Q純化后酶液。圖2為羧乙基海因酶的PCR電泳圖，其中泳道I和2:羧乙基海因酶基因PCR片段；泳道 3:MarkerDL2000o圖3為羧乙基海因酶基因工程菌的構(gòu)建圖。圖4為重組菌表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1:蛋白Marker泳道2:E.coliBL21 條帶，泳道 3-6:E.coliBL21 (DE3)/amd-his-pET_22b 表達(dá)的蛋白
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干變型和改進(jìn)，這些也應(yīng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明產(chǎn)羧乙基海因酶天然菌株的篩選過(guò)程。培養(yǎng)基:A.肉湯培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaC15，瓊脂20，pH=7.2B.富集培養(yǎng)基(g/L):羧乙基海因5、葡萄糖3、蛋白胨3、磷酸二氫鉀5、硫酸鎂
0.5、硫酸亞鐵 0.055、硫酸猛 0.0045，pH7.0
C.篩選培養(yǎng)基(g/L):在富集培養(yǎng)基中加入20g L—1的瓊脂粉D.種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，蛋白胨15，氯化鈉3，酵母膏5，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0.25，pH=7.0-7.2E.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，氯化鈉3，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0.25，氯化鈷0.05，羧乙基海因2，pH=7.0所有培養(yǎng)基均用去離子水配制，0.1MPa, 121°C滅菌15分鐘，冷卻后備用。初篩方法如下:取采集到的土樣5g，放入富集培養(yǎng)基50mL，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)3d ；靜置5min后，吸取5mL上部液體到新的富集培養(yǎng)基50mL，并相應(yīng)加倍羧乙基海因加入量，繼續(xù)培養(yǎng)3d。如此重復(fù)上述步驟2 3次。富集后的培養(yǎng)液靜置IOmin后，吸取ImL上部液體，進(jìn)行梯度稀釋，選取10_3 - 10_5部分ImL到篩選培養(yǎng)基，用涂布棒涂開(kāi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)好的平板取出，在背面劃分區(qū)域，用牙簽挑出單菌落部分，轉(zhuǎn)入新的肉湯培養(yǎng)基編號(hào)；同時(shí)，用牙簽挑出單菌落部分 接入種子培養(yǎng)基(搖管)，培養(yǎng)Id后在肉湯培養(yǎng)基平板上劃線分離。該方法獲得具有羧乙基海因酶酶活力的菌株30株，其中24h肉湯培養(yǎng)基菌落直徑超過(guò)Imm的菌株僅有5株。為了進(jìn)一步檢查菌株分泌羧乙基海因酶的能力，將初篩中選取的5株含羧乙基海因酶活力的菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，每個(gè)菌種3瓶(250mL瓶)，35°C，180rpm,培養(yǎng)24h ;培養(yǎng)結(jié)束后，取ImL發(fā)酵液，加入配制好的底物溶液中，轉(zhuǎn)化2h，最后篩選得到I株羧乙基海因酶活力較高的菌株CW221。羧乙基海因酶活力檢測(cè)方法:取25mL發(fā)酵液，離心(8000rpm，15min)，用生理鹽水洗漆I次，再次離心(8000rpm, 15min)取菌體；菌體加入配制好的20mL2g/L的羧乙基海因溶液，37°C，轉(zhuǎn)化lh，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，加入120g/L三氯乙酸水溶液停止反應(yīng)；離心(8000rpm，15min)，吸取ImL上清液，加入ImL對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色液，震蕩混勻后，于438nm處測(cè)定光吸收值。一個(gè)酶活單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，Imin內(nèi)生成IymolN-氨甲酰-L-谷氨酸所需的酶量；酶的比活力(U/mL)定義為每毫升發(fā)酵液所含的酶活單位數(shù)。其中羧乙基海因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室自制，其制備方法為D，L-谷氨酸(0.2mol，29.4g)(購(gòu)于上海源聚生物科技有限公司)、氰酸鈉(0.24mol, 15.6g)和氫氧化鈉(0.2mol，8g)溶于IOOmL水，70°C攪拌溶解，反應(yīng)2h，生成中間產(chǎn)物N-氨甲酰_D，L-谷氨酸，緩慢滴加50mL濃鹽酸，酸化至pH=l，升溫到100°C，加熱回流反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束，趁熱過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入燒杯中靜置，冷卻，有大量固體析出，過(guò)濾，粗產(chǎn)物用水重結(jié)晶，得到羧乙基海因。實(shí)施例2:本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明羧乙基海因酶生產(chǎn)菌CW221的生物學(xué)性質(zhì)鑒定。羧乙基海因酶生產(chǎn)菌CW221的生物學(xué)性質(zhì):高倍鏡觀察，細(xì)胞主要呈橢圓形，短桿狀，長(zhǎng)寬比約在2-3左右，也有近似球形的細(xì)胞，細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則，為單獨(dú)存在，無(wú)成串或成群細(xì)胞存在。革蘭氏陰性菌；在固體培養(yǎng)基平板上24h生長(zhǎng)菌落呈圓形，直徑約1mm，表面光滑、乳白色、不透明，邊緣不平整，中間略有突起；在斜面劃線培養(yǎng)，菌落延劃線生長(zhǎng)，邊緣不平整有小刺；在搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液呈乳白色，不透明。生理生化特性表明，該菌為專性好氧，不能利用葡萄糖作為碳源、VP實(shí)驗(yàn)和MR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，不水解淀粉，不能液化明膠，可氧化葡萄糖酸鹽，不能還原硝酸鹽。CW221菌株的Biolog鑒定結(jié)果是:幾產(chǎn)喊菌幾亞種(Alcaligenes faecalissubsp.faecalis), Proability (可能性):100%, Sim (相似度值):0.574。即 16s rDNA 序列的PCR產(chǎn)物為1426bp，該16s rDNA序列在GenBank中登錄號(hào)為GQ222232。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)與已知序列(同源性>99%)比較，結(jié)果顯示CW221菌株與Alcaligenes (產(chǎn)堿桿菌屬)同源性可達(dá)99%。綜合兩項(xiàng)鑒定結(jié)果，該菌可以被鑒定到屬，其屬于產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes),命名為幾產(chǎn)喊菌幾亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)。實(shí)施例3:本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明羧乙基海因酶的純化步驟。緩沖液A:0.02mol/L Tris-HCl, pH9.0，稱取發(fā)酵菌體15g (發(fā)酵方法詳見(jiàn)實(shí)施例1中篩選過(guò)程的發(fā)酵方法)溶于60ml的緩沖液A，配制成菌懸液。經(jīng)超聲破碎(超聲時(shí)間3s，間歇時(shí)間5s，功率400W，保護(hù)溫度25°C，全程IOmin,重復(fù)3次)后，于4°C下10000r/min離心30min，收集上清液。經(jīng)20%，40%, 60%，80%飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀。離心收集沉淀，溶解于緩沖液A，并將其轉(zhuǎn)入透析袋，相同緩沖液4°C透析，再經(jīng)聚乙二醇-20000濃縮。取濃縮樣品上DEAES^harose F.F陰離子交換柱，用緩沖液A與lmol/L NaCl做線性梯度洗脫,流速2ml/min收集濃縮活性峰。檢測(cè)蛋白濃度和酶活后，選取有活性的酶液透析后上SourCe15Q強(qiáng)陰離子交換柱，收集濃縮活性峰。采用SDS-PAGE測(cè)定純化后的酶蛋白質(zhì)的分子量。通過(guò)SDS-PAGE電泳(圖1 )，發(fā)現(xiàn)羧乙基海因酶已經(jīng)達(dá)到電泳純，單個(gè)亞基的分子量為50kDa，純化倍數(shù)為11.929和回收率19.63%。匯總見(jiàn)表I。表I羧乙基海因酶純化總結(jié)注:蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。表I
權(quán)利要求
1.一種羧乙基海因酶生產(chǎn)菌，其特征在于，其分類命名為糞產(chǎn)堿菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis),該菌株已于2013年5月13號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7585。
2.一種羧乙基海因酶，其特征在于，所述羧乙基海因酶來(lái)源于權(quán)利要求1所述的羧乙基海因酶生產(chǎn)菌。
3.權(quán)利要求2所述的羧乙基海因酶，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.權(quán)利要求2所述的羧乙基海因酶，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
5.一種用于表達(dá)羧乙基海因酶的重組載體，其含有權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pET22b。
7.—種宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求5或6任一項(xiàng)所述的重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
9.制備權(quán)利要求7或8任一項(xiàng)所述宿主細(xì)胞的方法，其特征在于，構(gòu)建包含權(quán)利要求3所述的核苷酸序列的重組載體pET22b，并在大腸桿菌E.coli BL21中表達(dá)，獲得了產(chǎn)羧乙基海因酶的重組菌即宿主細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)N-氨甲酰-L-谷氨酸的方法,其特征在于，以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)權(quán)利要求7或8任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞得到發(fā)酵液，經(jīng)細(xì)胞破碎，離心取上清液加入羧乙基海因溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn) 化反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明一種羧乙基海因酶生產(chǎn)菌，其特征在于，其分類命名為糞產(chǎn)堿菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)，該菌株已于2013年5月13號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.7585。本發(fā)明還公開(kāi)了羧乙基海因酶生產(chǎn)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株糞產(chǎn)堿菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)的羧乙基海因酶的活性為0.064U/ml，純化后的酶活可以達(dá)到0.61U/ml，構(gòu)建的基因工程菌的酶活為3.06U/ml，重組菌發(fā)酵方法簡(jiǎn)單。對(duì)底物轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)以后對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到95%，4小時(shí)的轉(zhuǎn)化率為99.98%，在催化羧乙基海因合成中都有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103243054SQ201310198458
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者曹飛, 薄薇, 周佳棟, 姚琴, 李曉婉, 文斌斌, 湯智群 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)