專利名稱：釀造慕薩萊思的高溫酵母、制備方法及制備的慕薩萊思的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物及發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種新疆慕薩萊思釀造的酵母菌、制備方法及其獲得的飲品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
慕薩萊思是西域最古老的葡萄酒，民間也稱作“穆薩萊斯”、“穆塞勒斯”、“姆塞來斯”、“木賽來斯”和“美賽來斯”、“慕薩萊思”、“穆塞萊斯”等。中國唐代詩句“葡萄美酒夜光杯，欲飲瑟琶馬上催”中的“葡萄美酒”指的就是穆塞萊斯。高昌王向唐朝進(jìn)貢的“西域瓊漿”也是穆塞萊斯?！捌咸血?dú)不用曲”(明朝李時珍《本草綱目》卷二十五)，慕薩萊思就是用葡萄汁自然發(fā)酵而成，不勾不兌，無任何“曲”類添加劑，因此被認(rèn)為是古代西域葡萄酒的“活化石”。民間歷來釀造慕薩萊思極為普遍，“村村舍舍煮酒忙，香氣氤氳漫農(nóng)家”。群眾飲慕薩萊思往往以酣為快，酣后意恣，高歌狂舞，盡興而怡然，再現(xiàn)了古代西域文化的遺風(fēng)，是古代西域文化的余緒。慕薩萊思已成為新疆特產(chǎn)，主產(chǎn)地在阿瓦提縣，在新疆的阿瓦提縣，幾乎家家戶戶都釀酒。同一個村莊里，即使有上百戶人家，也不會有一種相同的穆塞萊斯。這與釀酒人的年齡、性格、心情等有關(guān)，他們把自己的個性融人了穆塞萊斯中了，是一種釀造的味美醇香的葡萄酒，藥用價值高，富含人體所需的氨基酸、多種維生素、葡萄糖、鐵等營養(yǎng)成分和微量元素。慕薩萊思屬溫性，是一種純天然綠色飲品，至今沿襲著祖輩的釀造工藝，使得慕薩萊思以最老的方式保存了下來，堪稱刀郎文化的精髓與靈魂。慕薩萊思酒是新疆維吾爾民族利用鮮食或兼食性的葡萄取汁、熬煮、發(fā)酵而成的一種天然酒精飲料。慕薩萊思的釀造工藝與葡萄酒工藝有著很大的不同。其基本工藝為維吾爾人將葡萄榨汁，先將皮渣加水熬煮(水剛沒過皮渣)熬煮，之后過濾，濾液與壓榨汁混合后再熬煮，形成慕薩萊思起始發(fā)酵液，自然冷卻至室溫，裝入大缸進(jìn)行自然發(fā)酵而成。偶爾釀造者根據(jù)自己的需求會添加一些當(dāng)?shù)爻霎a(chǎn)的大蕓、白杏、桑椹、紅花、枸杞、鴿子、雪雞、鹿血，甚至是新疆的烤全羊。作為具有保健功效及豐富文化底蘊(yùn)的原生態(tài)飲品，慕薩萊思逐步成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成部分，慕薩萊思市場的迅速擴(kuò)大與人民對其消費(fèi)需求的迅速增長，傳統(tǒng)慕薩萊思逐步暴露出其產(chǎn)量不足，質(zhì)量層次不齊等先天性缺陷，已經(jīng)不能保證慕薩萊思的規(guī)模化持續(xù)發(fā)展，慕薩萊思的改革與創(chuàng)新為慕薩萊思進(jìn)一步發(fā)展的迫切任務(wù)。由于慕薩萊思的原生態(tài)性，也嚴(yán)重制約了慕薩萊思產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。在當(dāng)?shù)丶壹铱梢葬勗炷剿_萊思，但是釀造出的產(chǎn)品參差不齊，而且工藝還很落后，人才匱乏真正掌握能釀造高品質(zhì)的慕薩萊思的技師寥寥無幾，有的也只是掌握了祖輩的釀造經(jīng)驗(yàn)而已，對于規(guī)模化的科學(xué)生產(chǎn)卻不能適應(yīng)。由于慕薩萊思的釀造工藝不同于普通葡萄酒的工藝，所以對于慕薩萊思的釀造來說葡萄酒釀造師是一片陌生的領(lǐng)域。傳統(tǒng)慕薩萊思釀制的關(guān)鍵工序?yàn)榘局笈c發(fā)酵工序，其中發(fā)酵工序受到野生菌種、自然環(huán)境條件及發(fā)酵設(shè)備等因素的影響，是引起慕薩萊思質(zhì)量波動的重要因素，是限制慕薩萊思規(guī)模化生產(chǎn)的最主要因子。例如，在慕薩萊思完全自然發(fā)酵過程中，由于受到新疆早晚大幅度溫差波動，發(fā)酵過 程中大量生物熱等的影響，造成發(fā)酵醪品溫要么過高，高達(dá)37°C，要么過低，低達(dá)13°C，常常發(fā)生延遲啟發(fā)，停滯發(fā)酵，提前結(jié)束發(fā)酵等現(xiàn)象，使得發(fā)酵周期由15d到45d不等，同樣的熬煮發(fā)酵醪，但最終的慕薩萊思產(chǎn)品質(zhì)量如酒精、酸、澀、苦等有某單項感官特征突出到各種滋味與香味協(xié)調(diào)怡人的高品質(zhì)不等。又由于在市場利益的驅(qū)動下，人們隨意改變熬煮與發(fā)酵設(shè)備等，使得傳統(tǒng)慕薩萊思釀造工藝更加復(fù)雜化，對傳統(tǒng)慕薩萊思的發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響?，F(xiàn)有技術(shù)研究表明，環(huán)境因子對葡萄酒酵母多樣性的形成具有重要作用，慕薩萊思酵母菌多樣性及遺傳多樣性與慕薩萊思獨(dú)特的釀制環(huán)境有關(guān)，環(huán)塔里木盆地的極端內(nèi)陸氣候，其干旱、少雨、無霜期長等均有可能影響當(dāng)?shù)亟湍傅亩鄻有浴４送?，與采樣點(diǎn)之間在原料選擇，取汁方式，熬煮方式與時間，自然發(fā)酵容器、周期等工序上以及制作過程中衛(wèi)生防控相關(guān)聯(lián)。不同的取汁方法也可能導(dǎo)致葡萄汁中酵母菌數(shù)多樣性不同，這些都需要采用科學(xué)的技術(shù)手段加以研究和攻關(guān)。目前國內(nèi)，有對慕薩萊思釀制中野生優(yōu)勢菌的報道，但沒有適宜于地方慕薩萊思復(fù)雜釀制環(huán)境的優(yōu)良菌株及其配套釀制工藝的報道。針對目前慕薩萊思發(fā)展處于傳統(tǒng)加工與現(xiàn)代化生產(chǎn)交匯階段，傳統(tǒng)工藝革新是慕薩萊思發(fā)展的歷史性任務(wù)。依據(jù)慕薩萊思的釀制的科學(xué)原理，對慕薩萊思釀制核心技術(shù)，即自然發(fā)酵工序進(jìn)行科學(xué)分析，篩選研制適宜于慕薩萊思現(xiàn)代化生產(chǎn)優(yōu)良菌種和適合穩(wěn)定工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，同時又最大水平保留傳統(tǒng)慕薩萊思優(yōu)質(zhì)品質(zhì)特征的先進(jìn)工藝是對傳統(tǒng)慕薩萊思改進(jìn)的根本。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前國內(nèi)外沒有發(fā)酵性能優(yōu)良、耐受性好的慕薩萊思專用酵母，本發(fā)明提供一種耐受性好，發(fā)酵性能優(yōu)良的高溫酵母菌種、確定的生產(chǎn)慕薩萊思的工藝及其制備獲得的慕薩萊思。本發(fā)明從新疆阿克蘇地區(qū)、和田地區(qū)和喀什地區(qū)慕薩萊思產(chǎn)區(qū)不同慕薩萊思的自然發(fā)酵液中取樣，篩選出一批生長良好的酵母菌株，從中優(yōu)選出一株編號為GTGM-E2的高溫酵母菌株，經(jīng)鑒定為酵母菌，該菌株確定的發(fā)酵工藝能生產(chǎn)慕薩萊思。

本發(fā)明具體提供了一種耐受性好，發(fā)酵性能優(yōu)良的高溫酵母菌種，編號命名為GTGM-E2，參照J(rèn).A巴尼特和R.W佩恩編著的《酵母菌的特征和鑒定手冊》，依據(jù)Barnett等編著的《酵母菌:特征與鑒定》，張紀(jì)忠的《微生物分類學(xué)》及Cavazza (1992)等人及楊瑩(2007)等人的文獻(xiàn)報道，對GTGM-E2菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化學(xué)鑒定，GTGM-E2菌株于申請日前已保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101,保藏日期是2013年04月23日，保藏號是CGMCC N0.7513。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)。該酵母經(jīng)WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落特征為奶油色，帶或不帶淡淡的綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀；YPD固體培養(yǎng)菌落為乳白色，奶油狀，表面平滑，邊緣整齊；YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)無膜或蹼，試管底部具有白色緊實(shí)沉淀；細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，多端出芽，產(chǎn)孢子，孢子為圓形，孢子囊中有I個 4個孢子，利用賴氨酸培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，不生長；可發(fā)酵葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麥芽糖，蔗糖，可同化的碳源為:葡萄糖，半乳糖，甲基葡萄糖甙，乳酸，乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、N—乙酰氨基葡萄糖、蜜二糖、木糖醇、丙三醇、山梨醇、赤鮮醇、環(huán)乙糖胺及肌醇檸檬酸測試均顯示陰性，不能利用硝酸鉀，脲酶試驗(yàn)、DBB實(shí)驗(yàn)、抗0.01%及0.1%放線菌酮實(shí)驗(yàn)及無維生素生長實(shí)驗(yàn)均為陰性；通過上述結(jié)果及經(jīng)過26S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將編號為GTGM-E2菌株鑒定為酵母屬 iSscchaxomycGS)中的釀酒酵母 iSscchaxomycGS cerevisiae)。同時，本發(fā)明在提供GTGM-E2酵母菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提供了一種慕薩萊思的生產(chǎn)工藝，具體步驟如下:
(I)酒母制備:將釀酒酵母 i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 在YPD固態(tài)培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物，接入24Brix的葡萄熬煮汁中，28°C培養(yǎng)24h，備用。(2)原料揀選與沖洗:人工將石子等異物及霉?fàn)€、青果等從葡萄原料中揀選出，揀選干凈的葡萄利用自來水將泥沙沖洗干凈。(3)榨汁:利用破碎機(jī)將上述步驟(2)揀選與沖洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋壓榨機(jī)進(jìn)行壓榨，將葡萄汁泵入緩沖池，進(jìn)行靜止沉淀，而后打入蒸煮鍋。(4)熬煮:將步驟(3)榨出的葡萄皮渣中加入以淹沒皮渣為宜的水量，熬煮2h 6h，熬煮好的皮渣水進(jìn)行過濾，過濾后的皮渣水與壓榨后的葡萄汁以1:3 1:8 (v:v)的比例打入蒸汽鍋進(jìn)行煮沸熬煮，定期檢測糖度終了糖度為22Brix 25Brix。(5)冷卻:關(guān)閉蒸汽，用冷卻水將步驟(4)熬煮汁進(jìn)行冷卻，冷卻到35°C進(jìn)行打入發(fā)酵容器中。(6)發(fā)酵:將步驟(I)制備新鮮的酒母，按總發(fā)酵液的1%(ν/ν)接種量接入冷卻后的葡萄熬煮汁，接種溫度為32°C 35°C，環(huán)境溫度20°C _30°C進(jìn)行發(fā)酵，品溫為25°C 370C，適宜溫度為28°C，定期檢測糖度，直至糖度不再降低為止。
(7)后熟，殺菌及灌裝:發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行后熟，后熟溫度不得超過25°C，酒與酒渣放置4(T45d，將上清液導(dǎo)入干凈容器中，在灌裝前進(jìn)行65°C 75°C殺菌30min，冷卻并將溫度降至室溫，而后進(jìn)行灌裝；若不及時灌裝，將容器裝滿，在灌裝前的殺菌條件同上。本發(fā)明中選用的酵母菌分離培養(yǎng)基如下:
YPD液體培養(yǎng)基(g /L):葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,溶于蒸懼水并定溶至1000 mL, pH值自然。YPD固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂，121°C高壓滅菌20 min ；WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(g /L):酵母浸粉4 g,蛋白胨5 g,葡萄糖50 g,磷酸二氫鉀0.55 g,氯化鉀0.425 g,氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.025 g，硫酸錳0.025 g，瓊脂20 g，溴甲酚綠22mg, pH 6.5,121。。滅菌 20 min。菌株釀酒酵母(feccAaro焊Ce1Scerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 保藏用保護(hù)劑:甘油
(I)本發(fā)明中選用的釀酒酵母鑒定培養(yǎng)基及試劑=YPD固液態(tài)培養(yǎng)基同上；WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基同上；Gorodkowa培養(yǎng)基:葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，瓊脂2%，，pH值自然，121°C滅菌20 min ;賴氨酸培養(yǎng)基，IL中含有:D_葡萄糖10g，L-組氨酸lmg，DL-蛋氨酸2 mg, DL-色氨酸2mg,對-氨基苯甲酸200 Kg,生物素20 Kg,葉酸2 Kg,肌醇IOmg,煙酸400 Kg,泛酸2mg,鹽酸批卩多醇400 Pg,核黃素200 Kg,鹽酸硫胺素400 Pg,硼酸500 Pg,結(jié)晶氯化銅40 Pg，碘化鉀100 Pg，結(jié)晶氯化鐵200 Pg，結(jié)晶硫酸錳400 Pg，結(jié)晶鑰酸鈉200Kg，結(jié)晶硫酸鋅400 Pg,磷酸二氫鉀850 mg,磷酸氫二鉀150 mg,結(jié)晶硫酸鎂500 mg,氯化鈉100 mg，結(jié)晶氯化鈣100 mg，賴氨酸鹽酸鹽2.5 g，瓊脂20 g，pH值自然，121°C滅菌20min ；
(2)生理生化鑒定培養(yǎng)基:糖發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5%酵母浸出物，121°C滅菌20min ;碳源基礎(chǔ)養(yǎng)基:(NH4) 2S04 0.5%, KH2P040.1%，MgS04.7H20 0.05%,酵母膏 0.02%,水洗瓊脂 2%,115°C滅菌15min ;氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基:每升含有碳源(D-葡萄糖)10g,氨基酸(L-組氨酸Img,DL-蛋氨酸2mg, DL-色氨酸2mg),生長因子(對一氨基苯甲酸200ug,生物素20ug,葉酸2ug,肌醇IOug,煙酸400ug,泛酸2mg,鹽酸批卩多醇400ug,核黃素200ug,鹽酸硫胺素400ug),微量元素(H3BO3 500ug, CuSO4.5H02 40ug)，鹽類(KI IOOug, FeCl3.6H02 2 00ug, MnSO4.4H02400ug，Na2MoSO4.2H02 2 00ug, ZnSO4.7H02 400ug),同化氮源，選擇硝酸鉀；脲素培養(yǎng)基:蛋白胨0.1%，磷酸二氫鉀0.2%，氯化鈉0.5%，酚紅0.0012%,瓊脂2%，PH6.8滅菌后加入經(jīng)過濾除菌尿素溶液，是尿素的最終濃度達(dá)到2% ;抗放線菌酮培養(yǎng)基:每升中含有氨基酸(L-組氨酸IOug, DL-蛋氨酸20ug, DL-色氨酸20ug),3.5g硫酸銨以及0.01%和0.1%的放線菌酮，其余成分同氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基；無維生素生長測試培養(yǎng)基:每升中含有氨基酸(L-組氨酸IOug, DL-蛋氨酸20ug, DL-色氨酸20ug), 5g硫酸銨,不含生生長因子,其余同氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基。序列分析試劑:Tris(Amresco), SDS (Amresco), EDTANa2 (Amresco), DNA MarkerDL2000 (廣東東盛生物科技有限公司)，TE緩沖液，瓊脂糖(西班牙)，2 X Tag PCR MasterMix購自諾維森(北京)生物科技有限公司；TAE緩沖液(50X貯存液pH8.5，242 g Tris堿，57.1 mL 冰醋酸，37.2 g Na2EDTA.2Η20，加 ddH20 至 I L，用時稀釋到 IX)，通過 26SrDNA 引物測序，具體采用 26S rDNA 引物:NLl (5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')；NL4 (5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')，序列具體參見序列附表。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了利用高溫菌株GTGM-E2發(fā)酵制備得到的慕薩萊思，具備優(yōu)良品質(zhì)的慕薩萊思廣品。(I)理化指標(biāo):酒精度:10 13% (V/V)；總糖:< 6 g/L ；總酸:6 9g/L。(2)感官指標(biāo):色澤:具有慕`薩萊思的典型色澤特征，棕褐色，色澤幽暗，均勻渾濁；氣味:具有突出的焦糖香味，酒香馥郁、純凈，典型性強(qiáng)；口感:口感豐滿，協(xié)調(diào)性好，余味悠長，典型性強(qiáng)。本發(fā)明提供慕薩萊思理化指標(biāo)測試采用的方法:總糖的測定:GB/T 15038-2006直接滴定法；酒精度的測定:GB/T 15038-2006酒精計法；總酸:GB/T 15038-2006電位滴定法；還原糖:GB/T 15038-2006直接滴定法，這些方法都是本領(lǐng)域常見的方法。通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果:
(I)本發(fā)明提供一株發(fā)酵性能良好，耐受性好的高溫釀酒酵母iSaccharotnycescerevisiae)CGMCC N0.7513，彌補(bǔ)了目前慕薩萊思專用酵母缺乏的現(xiàn)狀，特別是
適合高溫發(fā)酵的慕薩萊思專用酵母。(2)本發(fā)明對傳統(tǒng)慕薩萊思產(chǎn)業(yè)、釀制工藝、品質(zhì)特征等具體掌握基礎(chǔ)上，進(jìn)行大規(guī)模的慕薩萊思酵母分離與篩選，并對篩選株進(jìn)行工廠化慕薩萊思發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得優(yōu)勢優(yōu)良釀酒酵母菌，完成適宜于高端慕薩萊思的高溫純種發(fā)酵工藝的研制。獲得了優(yōu)良的慕薩萊思產(chǎn)品，其色澤幽暗，為慕薩萊思特有的純正棕褐色，渾濁均勻，具有突出的焦糖香味，酒香馥郁、純凈，口感豐富，具有良好的協(xié)調(diào)性，余味悠長，豐富了目前我國果酒產(chǎn)品市場。


圖1顯示為慕薩萊思高溫發(fā)酵工藝流程圖。圖2 顯示為釀酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 菌落形態(tài)圖，圖中，上半部分圖為YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，下半部分圖為WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。圖 3 顯示為釀酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 細(xì)胞形態(tài)及孢子形態(tài)圖，圖中，上半部分圖為細(xì)胞形態(tài)，下半部分圖為孢子形態(tài)。圖 4 顯示為釀酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹圖。圖5顯示為慕薩萊思傳統(tǒng)自然發(fā)酵降糖Logisic曲線擬合圖。圖 6 顯示為采用釀酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513高溫發(fā)酵制備慕薩萊思Logisic降糖曲線擬合圖。圖7顯不為慕薩萊思米用自然發(fā)酵與釀酒酵母cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC N0.7513高溫發(fā)酵時降糖(Brix)速率圖。
具體實(shí)施例方式主要儀器與設(shè)備:PL202電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HPX_9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-40BI高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-9420電·熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HHW.21.600電熱恒溫水浴箱，北京永光明醫(yī)療儀器廠；fcycler96孔PCR反應(yīng)儀，Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GEL Doc2000凝膠成像分析儀，Bio-Rad公司；HPX-9272 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；Biolog,美國BioTek Instruments公司；游標(biāo)卡尺，上海工量具有限公司；WHB 96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；1000 ml移液槍，上海艾本德生物技術(shù)國際貿(mào)易有限公司；HPX-9272 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；C21-RT2103電磁爐、EG720FF1-NR微波爐，廣東美的生活電器制造有限公司；G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸發(fā)儀，日本Eyela公司。BL3100電子天平，德國Sartorius公司；SCW-CA_650桌上型垂直流潔凈工作臺，蘇州宏瑞凈化科技有限公司。G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸發(fā)儀，日本Eyela公司。BL3100電子天平，德國Sartorius公司。手持糖度計，上海天壘儀器儀表有限公司；酒精計，上海醫(yī)聯(lián)控溫儀器廠。PHS-3B型pH計，上海紅益儀器儀表有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；25 L發(fā)酵罐(工廠)及陶瓷發(fā)酵罐(作坊),市售。選用的原料為和田紅葡萄，產(chǎn)自于新疆南疆環(huán)塔里木盆地地區(qū)。本發(fā)明中選用的所有菌種和原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)條件和方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％—般為重量之比，個別不同之處另作說明。實(shí)施例一:菌種的篩選、分離、純化和鑒定 菌株分離方法
1.酵母分離源的采集:2010年9 10月采集于南疆地區(qū)8個具有典型慕薩萊思釀造工藝作坊和工廠49份樣液。樣液包括新壓榨的含有皮渣的或不含皮渣的葡萄汁、正在熬煮的葡萄汁、O d (起始發(fā)酵液，即冷卻后的葡萄熬煮汁)發(fā)酵液以及來自大小不等(50 -500L)的瓷壇或不銹鋼發(fā)酵罐(20 t)中不同時期發(fā)酵液。采樣用廠家專用酉取工具將樣液取出立即裝入塑料瓶中(樣液潤洗3次)再用潤洗過(樣液潤洗3次)的注射器吸IOmL樣液至已滅菌帶塞的20 mL小玻璃瓶中，蓋好瓶塞用封口膜密封放入4 °C保溫瓶中，12 h內(nèi)將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并與滅囷甘油1:1混合，放入_20 C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.菌種分離與純化方法:將所采樣品做10的稀釋梯度，取其適宜的3個連續(xù)稀釋梯度，各取0.1mL，涂布于WL與YPD固體培養(yǎng)基，于恒溫養(yǎng)箱中28 °C培養(yǎng)2 3 d，挑取單菌落，在YPD固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后，進(jìn)行甘油管_20°C保藏備用。未發(fā)酵的樣品分離菌株控制在15 20株/樣，發(fā)酵期的樣品分離株控制2(Γ40株/樣。菌種的分離鑒定方法
1.酵母菌的形態(tài)學(xué)鑒定:菌落形態(tài)觀察:將酵母在YPD及WL固體培養(yǎng)基上劃線，28°C培養(yǎng)2 3 d，觀察其菌落形態(tài)；細(xì)胞形態(tài)觀察:YPD液態(tài)接種28°C培養(yǎng)2天，顯微鏡觀察；孢子形態(tài)觀察:G0r0dk0wa培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7天，采用孔雀綠一蕃紅染色法將孢子進(jìn)行孢子染色，顯微鏡觀察。液體培養(yǎng)特征觀察:將菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2 3 d，觀察是否發(fā)酵、培養(yǎng)液是否混濁，是否形成環(huán)或島等膜蹼，沉淀量多少及松緊狀況。2.賴氨酸選擇性培養(yǎng)鑒定:菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基活化24h后，按照1%的接種量接種到2 mL的無菌水中進(jìn)行饑餓處理，7d后，劃線接種到賴氨酸培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)5d后觀察是否有酵母生長，培養(yǎng)48h后沒有菌落出現(xiàn)的繼續(xù)培養(yǎng)，直到15d后仍無菌落生長的說明可能是釀酒酵母。測試結(jié)果為在賴氨酸培養(yǎng)基上不生長者為釀酒酵母。通過上述酵母菌分離與形態(tài)學(xué)試驗(yàn)鑒定獲知。

49份樣液共分離到699株酵母菌，見表1，根據(jù)酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)和顏色，可將阿瓦提縣不同發(fā)酵工藝慕薩萊思樣液中分離到的699株酵母菌聚為20個培養(yǎng)類型，其中482株WL培養(yǎng)菌落特征為將奶油色，帶或不帶淡淡的綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，YPD固體培養(yǎng)菌落為乳白色，奶油狀，表面平滑，邊緣整齊，YPD液態(tài)培養(yǎng)無膜或蹼，試管底部具有白色緊實(shí)沉淀；繼而將這些菌株利用賴氨酸培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)鑒定，每株菌做三個重復(fù)，篩選不能生長的酵母有436株。對436株典型菌株進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及孢子形態(tài)觀察復(fù)檢，進(jìn)一步確認(rèn)其分類地位。通過上述形態(tài)鑒定及賴氨酸選擇培養(yǎng)，將699分離株中436株初步鑒定為釀酒酵母，其中包括編號為GTGM-E2菌株，其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)參見附圖2、附圖3。生理生化鑒定:
依據(jù)形態(tài)及賴氨酸選擇性培養(yǎng)基初步確定編號為GTGM-E2的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵、碳氮源同化，抗防線菌酮，無維生素生長，尿素分解，重氮基藍(lán)B等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行生理生化鑒定。糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn):在糖發(fā)酵培養(yǎng)基分別加入葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麥芽糖，蔗糖利用杜氏管發(fā)酵法在28°C，培養(yǎng)I周，其間每天觀察并記錄杜氏管內(nèi)氣體積存與否及其積存量，檢測是否對測試糖具有發(fā)酵力。碳源同化實(shí)驗(yàn):生長普法，在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，測試葡萄糖，半乳糖，乳糖，鹿糖，麥芽糖，纖維二糖，甲基葡萄糖甙，木糖，阿拉伯糖，海藻糖，松三糖，棉子糖，N —乙酰氨基葡萄糖，蜜二糖，木糖醇，丙三醇，山梨醇，赤鮮醇，環(huán)乙糖胺，肌醇，乳酸，檸檬酸，28°C培養(yǎng)2 3天后觀察記錄結(jié)果，檢測其是否生長。硝酸鹽同化實(shí)驗(yàn):生長普法，在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入硝酸鉀，28°C，2 3天后觀察記錄結(jié)果，檢測其是否生長。脲酶試驗(yàn):把脲素液體培養(yǎng)基用無菌操作，以0.5mL為一份分別放進(jìn)許多試管中，并且深度冷凍儲存六周。取一環(huán)生長I天或2天的酵母菌培養(yǎng)物，接種在上述培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)。每半小時檢查一次試管顏色的變化，紅色表示脲酶活性.所有呈陽性反應(yīng)的酵母菌在4小時之內(nèi)都能變成紅色。重氮基藍(lán)B (DBB)試驗(yàn):把培養(yǎng)在YPD固體培養(yǎng)基上至少10天的菌種，放在55°C數(shù)小時，然后浸淹在冰冷的DBB試劑中.如果該培養(yǎng)物在室溫下2分鐘內(nèi)變成暗紅色，那么該結(jié)果被記錄為陽性?？狗啪€菌酮實(shí)驗(yàn):將新鮮活化的測試菌接入含0.01%及0.1%的培養(yǎng)基中進(jìn)行28°C培養(yǎng)2-3d，觀察期生長狀況。表I 慕薩萊思酵母菌分離源及分離株數(shù)
權(quán)利要求
1.一種能生產(chǎn)慕薩萊思的高溫釀酒酵母cerevisiae) GTGM-E2,該釀酒酵母 iSacclmromyces cerevisiae) GTGM-E2 的保藏號為 CGMCC N0.7513。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2生產(chǎn)慕薩萊思的方法，其特征在于，所述方法具體步驟包括: (1)酒母制備:將釀酒酵母i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 在YPD固態(tài)培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物，接入24Brix的葡萄熬煮汁中，28°C培養(yǎng)24h，備用； (2)原料揀選與沖洗:人工將石子等異物及霉?fàn)€、青果等從葡萄原料中揀選出，揀選干凈的葡萄利用自來水將泥沙沖洗干凈； (3)榨汁:利用破碎機(jī)將上述步驟(2)揀選與沖洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋壓榨機(jī)進(jìn)行壓榨，將葡萄汁泵入緩沖池，進(jìn)行靜止沉淀，而后打入蒸煮鍋； (4)熬煮:在步驟(3)榨出的葡萄皮渣中加入以淹沒皮渣為宜的水量，熬煮2h 6h，熬煮好的皮渣水進(jìn)行過濾，過濾后的皮渣水與壓榨后的葡萄汁以1:3 1:8 (v:v)的比例打入蒸汽鍋進(jìn)行煮沸熬煮，定期檢測糖度終了糖度為22Brix 25Brix; (5)冷卻:關(guān)閉蒸汽，用冷卻水將步驟(4)熬煮汁進(jìn)行冷卻，冷卻到35°C打入發(fā)酵容器中； (6)發(fā)酵:將步驟(I)制備的新鮮酒母，按總發(fā)酵液的1%(ν/:ν)接種量接入冷卻后的葡萄熬煮汁，接種溫度為32°C 35°C，環(huán)境溫度20°C _30°C進(jìn)行發(fā)酵，品溫為25°C 37°C，適宜溫度為28°C，定期檢測糖度，直至糖度不再降低為止； (7)后熟，殺菌及灌裝:發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行后熟，后熟溫度不得超過25°C，酒與酒渣放置4(T45d，將上清液 導(dǎo)入干凈容器中，在灌裝前進(jìn)行65°C 75°C殺菌30min，冷卻并將溫度降至室溫，進(jìn)行灌裝；若不及時灌裝，將容器裝滿，在灌裝前的殺菌條件同上。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母cerevisiae) CGMCC N0.7513和權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)慕薩萊思的方法制備獲得慕薩萊思。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)慕薩萊思的高溫釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo.7513和利用此菌株發(fā)酵制備方法獲得慕薩萊思。本發(fā)明通過不同溫度、糖度、酒度及低氮耐受性分析、起發(fā)性測定、產(chǎn)酒力、絮凝性、自溶性、產(chǎn)H2S能力、產(chǎn)生物胺特性的檢測、果膠酶活性測定和β-葡萄糖苷酶活性測定試驗(yàn)，篩選出釀酒性能優(yōu)良的高溫慕薩萊思酵母一株，廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/865GK103243037SQ20131019738
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月24日
發(fā)明者朱麗霞, 薛菊蘭, 馮姝, 郭東起, 王麗玲, 楊保求, 熊素英, 許倩, 陳勝惠子, 范英閣, 侯旭杰 申請人:塔里木大學(xué)