輔助鑒定h9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的特異引物對(duì)，由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還保護(hù)一種引物組合物，由引物對(duì)甲和所述特異引物對(duì)組成；所述引物對(duì)甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成。本發(fā)明提供的特異引物對(duì)可鑒定雞傳染性支氣管炎病毒，本發(fā)明提供的引物組合物結(jié)合雙重RT-PCR可同時(shí)鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒，均具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、普適性強(qiáng)、所需時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)多種臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的 引物組合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的引物組 合物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] H9亞型禽流感和雞傳染性支氣管炎是目前危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病。H9亞型 禽流感病毒可以感染多種禽和哺乳動(dòng)物，并可導(dǎo)致禽類發(fā)病死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的健康 發(fā)展。雞傳染性支氣管炎也是一種危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，病雞主要表現(xiàn)呼吸道癥 狀。臨床上兩病癥狀相似，兩種病毒感染均導(dǎo)致肉雞生長(zhǎng)緩慢和蛋雞產(chǎn)蛋率下降，給養(yǎng)禽業(yè) 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒抗原特性的變異， 導(dǎo)致常規(guī)血清學(xué)方法無(wú)法檢出流行毒株。因此，建立一種快速有效的鑒別兩種病毒流行毒 株的診斷方法，對(duì)于及時(shí)采取有效控制措施和防止疫情擴(kuò)散具有重要的意義。
[0003] 對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如病毒分離、氣管環(huán)培養(yǎng)試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶 試驗(yàn)等，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能做出快速而及時(shí)的診斷；而且不能在同一檢測(cè)反應(yīng)中檢測(cè)不同的 對(duì)象，即無(wú)法同時(shí)進(jìn)行鑒別診斷。由于變異株的出現(xiàn)，常常導(dǎo)致這些方法無(wú)法檢出病毒，出 現(xiàn)漏檢的情況。因此，建立一種能夠快速鑒別診斷H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎 病毒，而且很好的覆蓋當(dāng)前流行毒株的檢測(cè)方法非常重要。
[0004] 傳統(tǒng)的流感病毒檢測(cè)方法為采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)(需時(shí)2-3天)，然后采用 血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行流感病毒亞型的鑒定(需時(shí)1天)。雞傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)方法通常 采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)或者氣管環(huán)組織培養(yǎng)這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，其中利用雞胚進(jìn)行 病毒分離培養(yǎng)需要10天時(shí)間，而氣管環(huán)組織培養(yǎng)技術(shù)難度比較大，操作不易。總之，傳統(tǒng)的 檢測(cè)方法具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的弊端，難以做出快速而及時(shí)的診斷；而且不能在同一檢測(cè)反應(yīng)中 檢測(cè)不同的對(duì)象，即無(wú)法同時(shí)進(jìn)行鑒別診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒 的引物組合物及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的特異引物對(duì)，由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列 4所示單鏈DNA分子組成。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下 (a)或（b) : (a)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b)輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳 染性支氣管炎病毒。所述待測(cè)樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔 拭子等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）或雞 的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括所述特異引物對(duì)；所述試劑盒的用途為如下（a) 或（b) : (a)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b)輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性 支氣管炎病毒。所述待測(cè)樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔拭子 等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）或雞的內(nèi) 臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：以待 測(cè)病毒的cDNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒 為候選的雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為候選的非 雞傳染性支氣管炎病毒。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為600-700bp，具體可為655bp。所述待 測(cè)病毒可為H9N2亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、H4N6亞型禽流感病毒、H3N8亞 型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒或新城疫病毒。所述方法為非疾病治 療和診斷方法。
[0010] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒的方法， 包括如下步驟：以待測(cè)樣本的cDNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本疑似含有雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待 測(cè)樣本疑似不含有雞傳染性支氣管炎病毒。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為600-700bp，具體 可為655bp。所述待測(cè)樣本可為死亡的雞的肝、腦、肺等組織，也可為死亡的雞的口腔拭子、 泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺 等）或雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述方法為非疾病治療和 診斷方法。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種引物組合物，由引物對(duì)甲和引物對(duì)乙組成；所述引物對(duì)甲由序 列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)乙 由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA分子組成。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合物在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下 (c)或（d) : (c)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒；（d)輔助鑒定待測(cè) 樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。所述H9亞型禽流感病毒具 體可為H9N2亞型禽流感病毒。所述待測(cè)樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭 子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、 肺等）或雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括所述引物組合物；所述試劑盒的用途為如下（c) 或（d): (c)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒；（d)輔助鑒定待測(cè)樣本 中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。所述H9亞型禽流感病毒具體可 為H9N2亞型禽流感病毒。所述待測(cè)樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、 泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺 等）或雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合物對(duì)在輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽 流感病毒中的應(yīng)用。應(yīng)用所述引物對(duì)進(jìn)行所述輔助鑒定時(shí)的方法如下：以待測(cè)病毒的cDNA 為模板，用所述引物組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到600-700bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為 候選的雞傳染性支氣管炎病毒，如果得到400-500bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為候選的H9 亞型禽流感病毒，如果均沒有得到上述兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為候選的非雞傳染性 支氣管炎病毒且非H9亞型禽流感病毒。所述600-700bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為655bp。所 述400-500bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為473bp。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型 禽流感病毒。所述待測(cè)病毒可為H9N2亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、H4N6亞型 禽流感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒或新城疫病毒。 所述應(yīng)用中不包括疾病治療和診斷方法。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合物對(duì)在輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性支氣 管炎病毒和H9亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。應(yīng)用所述引物對(duì)進(jìn)行所述輔助鑒定時(shí)的方法如 下：以待測(cè)樣本的cDNA為模板，用所述引物組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到600-700bp PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本疑似含有雞傳染性支氣管炎病毒，如果得到400-500bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、 待測(cè)樣本疑似含有H9亞型禽流感病毒，如果均沒有得到上述兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本 疑似均不含有雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。所述600-700bp PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物具體可為655bp。所述400-500bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為473bp。所述H9亞型禽流感病 毒具體可為H9N2亞型禽流感病毒。所述待測(cè)樣本可為死亡的雞的肝、腦、肺等組織，也可為 死亡的雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等拭子樣品。所述待測(cè)樣本還可為食品，所述食品為雞的 內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）或雞的內(nèi)臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述 應(yīng)用中不包括疾病治療和診斷方法。
[0016] 本發(fā)明提供的特異引物對(duì)可鑒定雞傳染性支氣管炎病毒，具有靈敏度高、特異性 強(qiáng)、普適性強(qiáng)、所需時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)多種臨床樣本(如臨床采集的樣品如口腔 拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明提供的引物組合物結(jié)合雙重RT-PCR可同時(shí)鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和 H9亞型禽流感病毒，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、普適性強(qiáng)、所需時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以 對(duì)多種臨床樣本(如臨床采集的樣品如口腔拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）進(jìn)行檢測(cè)，操 作簡(jiǎn)單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明對(duì)于雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒的臨床診斷和流行病控 制具有重大價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為引物對(duì)乙的特異性結(jié)果。
[0020] 圖2為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的組合物的特異性結(jié)果。
[0021] 圖3為引物對(duì)乙的靈敏度結(jié)果。
[0022] 圖4為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的組合物的靈敏度結(jié)果。
[0023] 圖5為引物對(duì)乙的普適性結(jié)果。
[0024] 圖6為引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的普適性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。以下實(shí)施例中，用于提取總RNA的試劑盒為Viral genome RNA rapid extraction Kit (名稱：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，廠家QIAGEN，貨號(hào)52904。以下實(shí)施例中，用于 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 的試劑盒為 The reverse transcription(RT)reaction (名稱： RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，廠家 Fermentas，貨號(hào) K1622。
[0026] H9N2 亞型禽流感病毒（H9N2influenza viruses):參考文獻(xiàn)：Yipeng Sun，Juan Pu, Zhanlei Jiang，Tao Guan, Yingju Xia，Qi Xu，Linqing Liu, Bo Ma, Fulin Tian, E. G. Brown, Jinhua Liu. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China froml994to2008, Veterinary Microbiologyl46(2010)215 - 225〇
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[0028] H3N8 亞型禽流感病毒（H3N8influenza viruses):參考文獻(xiàn)：Juan Pu，Qin-Fang Liu,Ying-Ju Xia, Yu-Lei Fan, Earl G.Brown, Fu-Lin Tian,Jin-Hua Liu.Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during2004 - 2005Virus Genes (2009)38:136 - 142〇
[0029] 傳染性喉氣管炎病毒：參考文獻(xiàn)：謝菲，郝滿良，王蔚宇，路衛(wèi)星，王慎行，雞傳染 性喉氣管炎人工模擬自然感染模型的建立，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008年第5期。
[0030] 減蛋綜合癥病毒：參考文獻(xiàn)：劉吉山，沈志強(qiáng)，王艷，李書光，肖躍強(qiáng)，喬建光， 減蛋綜合癥在櫻桃鴨父母代中的流行病學(xué)調(diào)查.山東畜牧獸醫(yī).2010年第31期（總第166 期）。
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[0032] 實(shí)施例1、特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)
[0033] 設(shè)計(jì)一對(duì)用于鑒定H9亞型禽流感病毒的HA基因的引物對(duì)如下(將其命名為引物 對(duì)甲）：
[0034] H9-HA99F (序列表的序列 1) :5'-CATCGGCTACCAATCAACAAAC-3' ；
[0035] H9-HA571R (序列表的序列 2) :5' -GATTATTTGTGTATTGGGCGTC-3'。
[0036] 設(shè)計(jì)一對(duì)用于鑒定雞傳染性支氣管炎病毒的N基因的引物對(duì)如下(將其命名為引 物對(duì)乙）：
[0037] IB621F (序列表的序列 3) :5' -CAGGTAAAGGCGGAAGAAAAC-3 ;
[0038] IB1275R (序列表的序列 4) :5' -TGAAGCCCATCTGGTTGAAG-3'。
[0039] 實(shí)施例2、引物對(duì)的特異性檢測(cè)
[0040] 一、引物對(duì)乙的特異性檢測(cè)
[0041] 實(shí)驗(yàn)樣本分別為：H4N6亞型禽流感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎 病毒、減蛋綜合癥病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病 毒。
[0042] 1、提取各個(gè)待測(cè)樣本（即病毒濃度為106EID5Q/100y L的病毒液）的總RNA并反轉(zhuǎn) 錄為cDNA。
[0043] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0044] PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、IB621F0. 5μ 1、 IB1275R0. 5 μ 1、cDNA2 μ 1，加雙蒸水至 25 μ 1。
[0045] PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94 °C 5min ;94 °C 45s、59 °C 45s、72 °C 2min，30 個(gè)循環(huán)； 72〇C lOmin ；4°C 10h〇
[0046] 3、將步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖1。圖1中，1為 H4N6亞型禽流感病毒，2為H3N8亞型禽流感病毒，3為傳染性喉氣管炎病毒，4為減蛋綜合 癥病毒，5為新城疫病毒，6為雞傳染性支氣管炎病毒H120株，7為H9N2亞型禽流感病毒， Μ 為 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、 lOObp)。結(jié)果表明，雞傳染性支氣管炎病毒樣本在600-700bp之間顯示特異條帶，其他病毒 則無(wú)相應(yīng)條帶?；厥账鎏禺悧l帶并進(jìn)行測(cè)序，為655bp。
[0047] 二、引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的特異性檢測(cè)
[0048] 實(shí)驗(yàn)樣本分別為：雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病毒的混合 物、H4N6亞型禽流感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒和 新城疫病毒。
[0049] 1、提取各個(gè)待測(cè)樣本(待測(cè)樣本為所述混合物或各個(gè)病毒的病毒液；對(duì)于所述 混合物來(lái)說(shuō)，兩種病毒的濃度均為106EID5(l/100yL;對(duì)于其他病毒液來(lái)說(shuō)，病毒濃度為 106EID5Q/100 μ L的病毒液）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0050] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0051] PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、IB621F0. 5μ 1、 IB1275R0. 5μ 1、H9-HA99F0. 5μ 1、H9-HA571R0. 5μ l、cDNA2y 1，加雙蒸水至 25μ 1。
[0052] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同步驟一的2。
[0053] 3、將步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖2。圖2中，1 為H4N6亞型禽流感病毒，2為H3N8亞型禽流感病毒，3為傳染性喉氣管炎病毒，4為減蛋綜 合癥病毒，5為新城疫病毒，6為雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病毒的 混合物，Μ 為 TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp)。雞傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的混合物在600-700bp和 400-500bp之間各顯示一條特異條帶，其他病毒無(wú)該兩條特異條帶相應(yīng)的條帶。分別回收所 述兩條特異條帶并進(jìn)行測(cè)序，分別為655bp和473bp。
[0054] 實(shí)施例3、引物對(duì)的靈敏度檢測(cè)
[0055] 一、引物對(duì)乙的靈敏度
[0056] 1、分別提取病毒濃度為 105EID5Q/100 μ L、104EID5Q/100 μ L、103EID5Q/100 μ L、 102EID5(I/100 μ L或10EID5(I/100 μ L的雞傳染性支氣管炎病毒Η120株的病毒液(按照病毒濃 度由高至低依次命名為病毒液A1、病毒液B1、病毒液C1、病毒液D1和病毒液E1)的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0057] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0058] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0059] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0060] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖3。圖3中， 1至5依次代表病毒液A1、病毒液B1、病毒液Cl、病毒液D1和病毒液El，Μ為TransDNA Marker I (自上至下依次代表 70(^口、60(^口、50(^口、40(^口、30(^口、20(^口、10(^口）。結(jié)果表 明，102EID 5(l/100yL及以上的雞傳染性支氣管炎病毒的病毒液進(jìn)行以上步驟后均可在電泳 圖中觀察到600-700bp之間的特異條帶。回收所述特異條帶并進(jìn)行測(cè)序，為655bp。
[0061] 二、引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的靈敏度
[0062] 1、分別提取各個(gè)病毒液的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0063] 病毒液B2 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病毒的病 毒液，雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病毒的濃度均為10 4EID5(I/100 μ L。
[0064] 病毒液C2 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的病 毒液，雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H9N2亞型禽流感病毒的濃度均為10 3EID5(I/100 μ L。
[0065] 病毒液D2 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的病 毒液，雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 2EID5(I/100 μ L。
[0066] 病毒液Ε2 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的病 毒液，雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10EID 5(I/100 μ L。
[0067] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0068] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟二的1。
[0069] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0070] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖4。圖4中，1至4 依次代表病毒液B2、病毒液C2、病毒液D2和病毒液E2,Μ為TransDNA Marker I (自上至下 依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。結(jié)果表明，含 102EID5(I/100 μ L 及以上的雞傳染性支氣管炎病毒Η120株和Η9Ν2亞型禽流感病毒的病毒液進(jìn)行以上步驟后 均可在電泳圖中觀察到600-700bp和400-500bp之間的兩條特異條帶。分別回收所述兩條 特異條帶并進(jìn)行測(cè)序，分別為655bp和473bp。
[0071] 實(shí)施例4、引物對(duì)的普適性
[0072] 雞傳染性支氣管炎病毒Gray株、雞傳染性支氣管炎病毒H120株、雞傳染性支氣 管炎病毒H52株、雞傳染性支氣管炎病毒M41株、雞傳染性支氣管炎病毒Holte株、雞傳染 性支氣管炎病毒LX4株、雞傳染性支氣管炎病毒C 〇nn46/1996株均在如下文獻(xiàn)中有記載： Jinling Feng, Yanxin Hu，Zhijun Ma，Qi Yu,Jixun Zhao, Xiaodong Liu,and Guozhong Zhang. Virulent Avian Infectious Bronchitis Virus，People' s Republic of China. Emerging Infectious Diseases. Vol. 18,No. 12,December2012〇
[0073] 雞傳染性支氣管炎病毒毒株1 :雞傳染性支氣管炎病毒Gray株。雞傳染性支氣管 炎病毒毒株2 :雞傳染性支氣管炎病毒H120株。雞傳染性支氣管炎病毒毒株3 :雞傳染性支 氣管炎病毒H52株。雞傳染性支氣管炎病毒毒株4:雞傳染性支氣管炎病毒Holte株。雞 傳染性支氣管炎病毒毒株5 :雞傳染性支氣管炎病毒M41株。雞傳染性支氣管炎病毒毒株 6 :雞傳染性支氣管炎病毒LX4株。雞傳染性支氣管炎病毒毒株7 :雞傳染性支氣管炎病毒 Conn46/1996株。雞傳染性支氣管炎病毒毒株8 :2010年，從中國(guó)遼寧省具有發(fā)病表型的病 雞體內(nèi)分離得到。雞傳染性支氣管炎病毒毒株9 :2010年，從中國(guó)山東省具有發(fā)病表型的病 雞體內(nèi)分尚得到的毒株。雞傳染性支氣管炎病毒感染的病雞的發(fā)病表型為呼吸困難、發(fā)出 羅音、咳嗽、張口呼吸、打噴嚏。
[0074] H9N2亞型禽流感病毒毒株1 :1997年，從中國(guó)香港具有發(fā)病表型的病雞體內(nèi)分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株2 :1999年，從中國(guó)北京市具有發(fā)病表型的病雞體內(nèi)分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株3 :2007年，從中國(guó)山東省具有發(fā)病表型的病雞體內(nèi)分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株4 :2007年，從中國(guó)河北省具有發(fā)病表型的病雞體內(nèi)分離 得到。感染H9N2亞型禽流感病毒的病雞的發(fā)病表型為：精神不振，或閉眼沉郁；采食和飲水 減少或廢絕；張口呼吸，呼吸困難；拉黃白色稀便，較少的極綠色糞便，有時(shí)肛門處粘附淡 綠色或白色糞便。
[0075] -、引物對(duì)乙的普適性
[0076] 1、提取各個(gè)雞傳染性支氣管炎病毒毒株的病毒液(病毒濃度為106EID 5(l/100y L) 的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0077] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0078] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟一的1。
[0079] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0080] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖5。圖5中，泳道1 至9依次代表毒株1至9，M為TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、 400bp、300bp、200bp、100bp)。9株毒株經(jīng)上述檢測(cè)均可在電泳圖中觀察到600-700bp之間 的特異條帶。回收所述特異條帶并進(jìn)行測(cè)序，均為655bp。結(jié)果表明，引物對(duì)乙的普適性很 好。
[0081] 二、引物對(duì)甲和引物對(duì)乙的普適性
[0082] 1、分別提取各個(gè)病毒液的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0083] 病毒液A3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株1和H9N2亞型禽流感病毒毒株1 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0084] 病毒液Β3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株1和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株2 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0085] 病毒液C3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株1和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株3 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0086] 病毒液D3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株1和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株4 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0087] 病毒液Ε3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株2和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株1 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0088] 病毒液F3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株2和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株2 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0089] 病毒液G3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株2和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株3 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0090] 病毒液Η3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株2和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株4 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0091] 病毒液13 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株3和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株1 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0092] 病毒液J3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株3和H9N2亞型禽流感病毒毒株2 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和H9N2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0093] 病毒液Κ3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株3和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株3 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0094] 病毒液L3 :同時(shí)含有雞傳染性支氣管炎病毒毒株3和Η9Ν2亞型禽流感病毒毒株4 的病毒液，雞傳染性支氣管炎病毒和Η9Ν2亞型禽流感病毒的濃度均為10 6EID5(I/100 μ L。
[0095] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0096] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟二的1。
[0097] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0098] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖6。圖6中，泳 道1至12依次代表病毒液A3至L3，Μ為TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp )。各個(gè)病毒液進(jìn)行以上步驟后均可在電泳圖中觀 察到600-700bp和400-500bp之間的兩條特異條帶。分別回收所述兩條特異條帶并進(jìn)行測(cè) 序，600-700bp之間的條帶均為655bp，400-500bp之間的條帶均為473bp。結(jié)果表明，兩對(duì) 引物組成的引物組合物的普適性很好。
[0099] 實(shí)施例5、應(yīng)用引物對(duì)檢測(cè)臨床樣本的方法
[0100] -、樣品的采集
[0101] 組織樣品：病死或撲滅病禽，取肝、腦、肺等組織；
[0102] 棉拭子：口腔拭子、泄殖腔拭子。
[0103] 2-8°C保存，要求送檢病料新鮮。
[0104] 二、樣品處理
[0105] 1、組織樣品處理
[0106] 稱取待檢病料100mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍0. 8M、硫氰酸銨 0. 4M、甘油5%、苯酚38%的0. 1M醋酸鈉緩沖液）研磨，把研磨好的病料移至1. 5ml離心管 中，4°C、8000rpm離心5min，取250 μ 1上清，置于1. 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液， 劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。
[0107] 2、棉拭子處理
[0108] 將棉拭子置于1. 5ml滅菌離心管中，加入0. 3ml PBS緩沖液，靜置2小時(shí)以上，將 浸液中的棉拭子充分捻動(dòng)，擰干后棄去拭子，4°C、8000rpm離心5min，取250 μ 1上清液，置 于1. 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。
[0109] 3、陰性對(duì)照（RNase free 水）
[0110] 取滅菌雙蒸水250μ 1，置于1.5ml滅菌離心管中，加入750μ 1裂解液，劇烈振蕩混 勻，室溫放置5min。
[0111] 三、應(yīng)用引物對(duì)乙檢測(cè)
[0112] 1、取步驟二得到的各個(gè)樣本，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0113] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用實(shí)施例1的特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0114] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟二的1。
[0115] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟二的1。
[0116] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，如 出現(xiàn)600-700bp (具體為655bp)擴(kuò)增帶，表明樣品中含有雞傳染性支氣管炎病毒。
[0117] 四、應(yīng)用引物對(duì)甲和引物對(duì)乙檢測(cè)
[0118] 1、取步驟二得到的各個(gè)樣本，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0119] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，2、以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對(duì)甲和引 物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0120] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系同實(shí)施例2的步驟二的1。
[0121] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序同實(shí)施例2的步驟一的2。
[0122] 3、將步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，如 出現(xiàn)600-700bp和400-500bp (具體為473bp或655bp)的擴(kuò)增帶，表明樣品中含有雞傳染 性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。
【權(quán)利要求】
1. 特異引物對(duì)，由序列表的序列3所示單鏈DNA分子和序列表的序列4所示單鏈DNA 分子組成。
2. 權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下（a) 或（b) : (a)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b)輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性 支氣管炎病毒。
3. -種試劑盒，包括權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)；所述試劑盒的用途為如下（a)或（b): (a)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒；（b)輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性支氣管 炎病毒。
4. 一種輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：以待測(cè)病毒的cDNA為 模板，用權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為候 選的雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為候選的非雞傳 染性支氣管炎病毒。
5. -種輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒的方法，包括如下步驟： 以待測(cè)樣本的cDNA為模板，用權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物、待測(cè)樣本疑似含有雞傳染性支氣管炎病毒，如果沒有得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè) 樣本疑似不含有雞傳染性支氣管炎病毒。
6. 引物組合物，由引物對(duì)甲和引物對(duì)乙組成；所述引物對(duì)甲由序列表的序列1所示單 鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)乙由序列表的序列3所 不單鏈DNA分子和序列表的序列4所不單鏈DNA分子組成。
7. 權(quán)利要求6所述引物組合物在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下（c) 或（d): (c)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒；（d)輔助鑒定待測(cè)樣本 中是否含有雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。
8. -種試劑盒，包括權(quán)利要求6所述引物組合物；所述試劑盒的用途為如下（c)或（d): (c)輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒；（d)輔助鑒定待測(cè)樣本中是否 含有雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒。
9. 權(quán)利要求6所述引物組合物對(duì)在輔助鑒定雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感 病毒中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求6所述引物組合物對(duì)在輔助鑒定待測(cè)樣本中是否含有雞傳染性支氣管炎 病毒和H9亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232624SQ201310230937
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】蒲娟, 劉金華, 魏延迪, 俞晨芳, 裴星瑤, 齊魯, 張谞霄 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)