利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，具體地說是一種利用基因重組病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法：重組慢病毒載體構(gòu)建；神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定；重組病毒轉(zhuǎn)染NSCs；重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定；重組病毒轉(zhuǎn)染NSCs：取傳代3次后的NSCs消化制備成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)板中；轉(zhuǎn)染TH+Brn4基因重組慢病毒；加入慢病毒和ploybrene，搖晃混勻后將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12小時(shí)后更換新鮮分化培養(yǎng)基；同時(shí)用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過構(gòu)建目的基因TH和Brn4的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染NSCs后外源性基因能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；分化后產(chǎn)生高比例的TH陽性多巴胺能神經(jīng)元；Brn4能促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的高表達(dá)，且具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。
【專利說明】利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的
方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]帕金森病(Parkinson’ s Disease, PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其基本病理改變是特異性的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元因各種原因漸行性退變壞死，數(shù)量減少，致使紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少，從而產(chǎn)生震顫、肌肉強(qiáng)直等一系列運(yùn)動障礙癥狀。
[0003]傳統(tǒng)的藥物治療和外科治療僅限于改善癥狀，但并不能阻止病情發(fā)展，不能從根本上解決問題。由于此病變主要侵犯中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，且黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元投射的靶區(qū)紋狀體定位明確，所以在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)內(nèi)移植能夠分泌多巴胺的細(xì)胞，恢復(fù)多巴胺的神經(jīng)環(huán)路是一個(gè)針對病因治療的理想方法。
[0004]近三十年來，ro的腦內(nèi)移植研究取得了較大的進(jìn)展，有許多ro患者接受了流產(chǎn)胎兒中腦組織的移植，移植組織中的多巴胺神經(jīng)元能夠長期存活，并不斷釋放多巴胺，使病人的運(yùn)動癥狀得以明顯改善。這表明細(xì)胞移植替代治療是治療ro較有希望的方法。但因胚腦移植物來源有限、異體免疫排斥及倫理等問題，胚腦組織移植在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。
[0005]神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)是當(dāng)前國際上研究的熱點(diǎn)之一,它不僅存在于胚胎腦組織中，在成年腦內(nèi)也已被發(fā)現(xiàn)。NSCs不僅具有分裂增殖和自我更新的能力，還具有多分化潛能，可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)系統(tǒng)多種類型的細(xì)胞，包括多巴胺能神經(jīng)元。因此，NSCs作為細(xì)胞移植替代治療的供體細(xì)胞治療ro等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有巨大的潛力和優(yōu)越性。然而，研究表明體外培養(yǎng)的NSCs —般情況下大多分化為膠質(zhì)細(xì)胞，很少分化為神經(jīng)元，特別是特異性的多巴胺能神經(jīng)元，這給臨床應(yīng)用NSCs移植治療ro造成了極大的障礙。同時(shí)，目前的研究表明單獨(dú)NSCs移植后細(xì)胞存活率只有5% -10%，且不能有效地遷移分化并整合到宿主的神經(jīng)環(huán)路中，從而不能很好的釋放神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮生理功能。
[0006]所以探討誘導(dǎo)NSCs分化為多巴胺神經(jīng)元的方法以及促進(jìn)移植的細(xì)胞在體內(nèi)存活，較長時(shí)間地分泌多巴胺是NSCs移植治療ro研究中迫切需要解決的問題。
[0007]酪氨酸輕化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)是細(xì)胞內(nèi)酪氨酸合成多巴胺過程中的限速酶，通常作為多 巴胺能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志，其表達(dá)情況是NSCs能否轉(zhuǎn)化為多巴胺能神經(jīng)元的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)TH含量與中腦多巴胺含量呈線性正相關(guān)，H)患者腦內(nèi)TH及TH mRNA的水平明顯低于正常人，提示補(bǔ)充腦內(nèi)TH基因可促進(jìn)多巴胺的生物合成。將人或鼠TH基因作為目的基因轉(zhuǎn)入多種細(xì)胞的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)TH遺傳改造的細(xì)胞具有分泌多巴胺的能力。因此，設(shè)法提高NSCs的TH活性，促進(jìn)多巴胺的生成和釋放是NSCs移植聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療H)的新方法。
[0008]Brn-4是轉(zhuǎn)錄因子POU蛋白家族第三類成員之一。許多資料表明，多種同源盒基因，如HOX、POU、UM、PAX等，編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中對神經(jīng)細(xì)胞的分化、遷移和某些組織特異性基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。其中，POU同源盒基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中扮演著重要角色。根據(jù)POU區(qū)的全部氨基酸序列同源程度，哺乳動物POU蛋白分為Class I~ClassVI共六類，Brn_4和Brn-l、Brn-2、Tst_l同屬于第III類，在胚胎早期Brn-1、Brn-2、Brn-4即在神經(jīng)系統(tǒng)中出現(xiàn)，且分布廣泛，提示這些因子可能參與早期神經(jīng)發(fā)生。近期在《Nature》上的一篇報(bào)道中，將三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Ascll、fcn-2、Mytll導(dǎo)入來自成年大鼠尾部的皮膚細(xì)胞，一周后，約有20%的實(shí)驗(yàn)鼠皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，這些神經(jīng)細(xì)胞不但可以表達(dá)神經(jīng)蛋白，而且可與其他神經(jīng)細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，表明POU蛋白家族成員Brn-2在神經(jīng)發(fā)育中的關(guān)鍵作用?？梢?，POU蛋白家族的第III類因子對NSCs分化命運(yùn)可能起著決定性的作用。Le Moine等的研究還發(fā)現(xiàn)，阻斷成年哺乳動物黑質(zhì)向紋狀體的多巴胺能神經(jīng)投射，會引起紋狀體內(nèi)Brn-4表達(dá)上調(diào)。表明Brn_4可能和成年哺乳動物去多巴胺能神經(jīng)支配后紋狀體內(nèi)的神經(jīng)再生與修復(fù)有關(guān)。
[0009]前期研究中，通過切割大鼠穹窿海馬傘阻斷自隔區(qū)向海馬投射的膽堿能神經(jīng)纖維建立去神經(jīng)支配海馬模型，將NSCs移植到海馬內(nèi)，植入的NSCs在去神經(jīng)支配的海馬內(nèi)更容易存活，并且更多地分化為神經(jīng)元，同時(shí)，存在于齒狀回的內(nèi)源性NSCs在去神經(jīng)支配損傷刺激下也出現(xiàn)明顯增生、遷移和神經(jīng)元分化。上述結(jié)果表明，去神經(jīng)支配損傷后，海馬內(nèi)局部微環(huán)境的改變?yōu)镹SCs的存活、再生和向神經(jīng)元分化提供了良好的條件。我們進(jìn)一步利用原位雜交、RT-PCR、免疫組織化學(xué)和Western blot等多種方法檢測發(fā)現(xiàn)，Brn_4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平在去神經(jīng)支配的海馬內(nèi)均明顯上調(diào)。在獲得的去神經(jīng)支配海馬提取液中加入過量的Brn-4抗體中和其中的Brn_4，再與NSCs共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體中和后，去神經(jīng)支配海馬提取液促進(jìn)神經(jīng)元分化的效應(yīng)顯著減弱。利用RNA干擾技術(shù)將針對Brn-4的小RNA片段轉(zhuǎn)入NSCs中，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Brn-4的水平，結(jié)果NSCs分化為神經(jīng)元的比例明顯下降。相反，過表達(dá)Brn-4的NSCs分化為神經(jīng)元的比例明顯升高，而且新生神經(jīng)元的成熟度明顯增加。這些結(jié)果說明Brn-4在NSCs向神經(jīng)元分化成熟過程中起著十分重要的作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Brn-4基 因的NSCs在體外分化7天后,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯低于對照組,提示Brn_4可能具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Shimazaki等的研究發(fā)現(xiàn)，在體外用腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胰島素樣生長因子-1 (Insulinlike growth factor-1, IGF-1)刺激來源于小鼠胚胎紋狀體的NSCs分化過程中，Brn-4表達(dá)迅速上調(diào)，且Brn_4蛋白主要表達(dá)于新生的神經(jīng)元內(nèi)；應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)阻斷Brn-4的功能，NSCs分化為成熟神經(jīng)元的比例則下降。說明Brn-4可能通過一些神經(jīng)營養(yǎng)因子的介導(dǎo)來調(diào)控NSCs向神經(jīng)元的分化及其成熟。然而，Brn-4促進(jìn)NSCs向成熟神經(jīng)元分化并且維持移植細(xì)胞存活的分子機(jī)制在國內(nèi)、外沒有研究。如果能通過TH和Brn-4基因有效地誘導(dǎo)NSCs向成熟的多巴胺能神經(jīng)元分化，并且通過Brn-4維持移植后細(xì)胞的存活，使之長時(shí)間地分泌多巴胺，糾正H)的病理和生化異常，改善臨床癥狀，這將為多基因聯(lián)合NSCs移植治療H)提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法。[0011]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，我們將采用如下技術(shù)方案予以實(shí)施:
[0012]利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，所述的方法包括如下實(shí)施步驟:
[0013]一、pLV5-TH+Brn4重組慢病毒載體構(gòu)建:
[0014]根據(jù)pLV5-EFla-GFP慢病毒表達(dá)載體的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全長序列分別為ΝΜ_012740和ΝΜ_017252的基因，合成目的基因并構(gòu)建pLV5_TH、pLV5-Brn4和pLV5_TH+Brn4慢病毒表達(dá)載體，包裝滴度后進(jìn)行測序鑒定和滴度鑒定；
[0015]二、神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:
[0016]神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法:在無菌條件下取孕14d的SD胎鼠腹側(cè)中腦組織，用吸管反復(fù)吹打直至為細(xì)胞懸液，并經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，收集過濾后的細(xì)胞懸液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗3遍后重懸于NSCs培養(yǎng)液中，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力觀察后，按IX 105/ml細(xì)胞密度接種于含有IOml NSCs培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%、37°C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后可見培養(yǎng)瓶內(nèi)形成懸浮的NSCs球，7天后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0017]神經(jīng)干細(xì)胞的分離方法:神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3天后，用低速離心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶進(jìn)行消化，約IOmin鐘后用含10% FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，通過機(jī)械吹打的方式使其分散成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng);
[0018]神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定方法:取P3代NSCs在傳代時(shí)培養(yǎng)液中加入終濃度為5 μ mol/L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記,使BrdU整合到神經(jīng)干細(xì)胞DNA中，7天后進(jìn)行BrdU免疫突光檢測；另取P3代以后的NSCs亞克隆球用Nestin免疫熒光檢測證明其胚胎源性；將PlO代NSCs球接種于預(yù)先置入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化，2周后分 別進(jìn)行MAP_2、GFAP和CNP免疫熒光檢測以證明NSCs的多分化潛能；
[0019]重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定，包括:
[0020]轉(zhuǎn)染效率檢測是將轉(zhuǎn)染后的NSCs球接種至預(yù)涂有多聚賴氨酸圓蓋片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培養(yǎng)液，分化培養(yǎng)I周后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；
[0021]TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測是將各組NSCs分化培養(yǎng)2W后，吸去各孔中的培養(yǎng)液，用
0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室溫下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用Roche公司TUNEL凋亡檢測試劑盒按操作說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，最后PBS洗片3遍后，在避光條件下，加入Hoechst33342，室溫濕盒孵育30min。PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置熒光顯微鏡下觀察TUNEL、Hoechst陽性細(xì)胞核并攝片；用Statal0.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較；
[0022]高效液相色譜法檢測分化培養(yǎng)液中DA含量是將各組取NSCs分化培養(yǎng)液Iml，加入0.lmol/L過氯酸酸化培養(yǎng)液，14000rpm離心15min,取上清過濾后按吳燕瓊等報(bào)道的方法行高效液相色譜測定；
[0023]其特征在于:該方法實(shí)施步驟還包括:
[0024]三、重組病毒轉(zhuǎn)染NSCs :
[0025]所述的重組病毒的轉(zhuǎn)染方法:取P3代NSCs消化制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔接種4 X 104個(gè)細(xì)胞，加入500 μ I基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；細(xì)胞共分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組6孔:Mock組轉(zhuǎn)染pLV5-GFP慢病毒陰性對照；TH組轉(zhuǎn)染pLV5_TH重組慢病毒；Brn4組轉(zhuǎn)染pLV5_Brn4重組慢病毒；TH+Brn4組轉(zhuǎn)染pLV5_TH+Brn4重組慢病毒；每孔加入20 μ 11 X 108TU/ml感染復(fù)數(shù)為50的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,輕輕搖晃混勻后將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12小時(shí)后更換新鮮分化培養(yǎng)基；感染72小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入I μ g/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；7天后對各組形成的NSCs球進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0026]四、重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定。
[0027]利用所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法獲得一種轉(zhuǎn)染pLV5-TH+Brn4重組慢病毒的神經(jīng)干細(xì)胞:是將所述的方法中所述的實(shí)施步驟三中獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成單細(xì)胞懸液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2 X 106/ml，加入1.5ml細(xì)胞凍存管中，同時(shí)加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亞楓，混勻后密封，置4°C 1小時(shí)，-200C 2小時(shí)，然后直接放入_80°C超低溫冰箱中保存獲得。
[0028]所述的重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定還包括=Western Blot檢測、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測:
[0029]所述的Western Blot檢測是將各組轉(zhuǎn)染后的NSCs球接種至24孔板中進(jìn)行分化，另設(shè)一組未轉(zhuǎn)染的NSCs作為對照組，分化培養(yǎng)2周后終止培養(yǎng)，按RIPA裂解液說明書的要求，提取各組中細(xì)胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直電泳對蛋白進(jìn)行分離，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜15V,50min,5%脫脂奶粉封閉后分別加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗TH抗體、兔抗Brn4抗體、兔抗GDNF抗體、兔抗GFR α -1抗體、兔抗RET抗體，室溫孵育2h，4°C過夜，次日分別加入辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育4h，然后進(jìn)行曝光、顯影并用所采集圖像，用圖像分析軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行平均光密度分析，并用統(tǒng)計(jì)的方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較；
[0030]所述的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測是各組NSCs分化2周后終止培養(yǎng)，對陰性對照組和各重組病毒轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，簡述如下:所用一抗分別為:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗為:結(jié)合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育過夜,二抗室溫下孵育2h，隨后用Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核染色30min，中間各步驟之間均用0.01M PBS進(jìn)行常規(guī)洗片，最后用20%甘油緩沖液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡下觀察TH或DAT的表達(dá)情況，并計(jì)算GFP/TH和GFP/DAT雙標(biāo)細(xì)胞占Hoechst標(biāo)記細(xì)胞的百分比，并用統(tǒng)計(jì)方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較；
[0031]所述的高效液相色譜法檢測分化培養(yǎng)液中DA含量的色譜條件:色譜柱為4.6 X 250mm,顆粒度5 μ m的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱，柱溫40°C，流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，流速為l.0ml/min，檢測器為SH)-20A型紫外檢測器，檢測波長280nm ;定性分析:以樣品峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對照定性；定量分析:先利用DA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下依次進(jìn)行樣品測定，用外標(biāo)法定量，以峰面積表不含量。
[0032]所述的磷酸鹽緩沖液是由磷酸二氫鉀6.742g，磷酸氫二鉀0.0114g，加水定溶至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，并用0.12 μ m纖維素脂膜過濾獲得的。
[0033]所述的流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，其比例為97: 3。[0034]所述的NSCs 培養(yǎng)液由 DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF 組成。
[0035]所述的慢病毒的感染復(fù)數(shù)為50。
[0036]有益效果
[0037]—、我們從鼠胚中腦組織中分離得到的細(xì)胞具有不斷增殖和自我更新能力，并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的多分化潛能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞；
[0038]二、成功構(gòu)建帶有目的基因TH和Brn4的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染NSCs后外源性基因能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，得到大鼠NSCs-TH+Brn4細(xì)胞株；
[0039]NSCs-TH+Brn4在體外分化后能產(chǎn)生較高比例的TH陽性多巴胺能神經(jīng)元，且這些神經(jīng)元在形態(tài)、表型和功能上均較為成熟。Brn4能促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF及其受體GFRa-1和Ret的高表達(dá)，同時(shí)還具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，這些對于多巴胺神經(jīng)元的分化、成熟以及維持其存活可能起到了重要的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0041]圖2為NSCs的培養(yǎng)、分離及鑒定結(jié)果圖；
[0042]圖3為重組病毒轉(zhuǎn)染NSCs的效率檢測結(jié)果圖；
[0043]圖4為Western blot檢測結(jié)果圖；
[0044]圖5為免疫突光檢測結(jié)果圖；
[0045]圖6為細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進(jìn)一步地說明:
[0047]第一部分體外實(shí)驗(yàn)
[0048]轉(zhuǎn)染重組慢病毒的神經(jīng)干細(xì)胞的制備和該神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定
[0049]實(shí)驗(yàn)材料
[0050]1.1、實(shí)驗(yàn)動物
[0051]孕14d Sprague-Dawley (SD)大鼠,清潔級，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK (蘇)2002-0019。
[0052]1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[0053](I) SF1D-2OA型紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；
[0054]⑵⑶2培養(yǎng)箱(法國Jouan公司)；
[0055](3)超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；
[0056](4)低溫冷凍離心機(jī)(德國Beckman公司)；
[0057](5) Leica DMR正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；
[0058](6) Leica DMIRB倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；
[0059](7)超低溫冰箱(美國Nuaire公司)；
[0060](8) SDS-PAGE電泳槽及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad公司)；
[0061](9) LeicaQwin 圖像分析系統(tǒng)(Leica 公司)；[0062](IO)Molecular Imager ChemiDoc XRS System 米集圖像(Bio-Rad 公司)；
[0063](Il)FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司)；
[0064](12) TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司)；
[0065](13)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(BD公司)；
[0066](14)200目尼龍網(wǎng)(BD公司)；
[0067](15)細(xì)胞凍存管(BD公司)；
[0068](16)纖維素脂膜(BD公司)；
[0069](17) Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱(Shimadzu公司);
[0070](18) Quantity One 圖像分析軟件(Bio-Rad 公司)。
[0071]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0072]1.3.1慢病毒構(gòu)建試劑
[0073](I) pLV5_EFla_GFP 慢病毒(Genepharma 公司)；
[0074](2)限制性核酸內(nèi)切酶BamHI (MBI)；
[0075](3)限制性核酸內(nèi)切酶NotI (MBI)；
·[0076](4) T4DNA Ligase (NEB 公司);
[0077](5) DNA純化試劑盒(Axygen公司);
[0078](6) DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞(TransGen Biotech 公司)；
[0079](7)氨節(jié)抗生素溶液(Invitrogen公司)；
[0080](8)包裝質(zhì)粒 Packaging Mix (Genepharma 公司)；
[0081](9)293FT 細(xì)胞(Invitrogen 公司)；
[0082](10) DMEM+10% FBS (Invitrogen 公司)；
[0083](11) Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)；
[0084](12) Opt1-ΜΕΜ 培養(yǎng)液(Invitrogen 公司)；
[0085](13)0.05% Trypsin(Invitrogen 公司)。
[0086]1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑
[0087](I)DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco’ s Modified EagleMedium,Cat.N0.12100-038，Gibco公司)；
[0088](2)F12 培養(yǎng)基(F12Nutrient Mixture, Cat.N0.21700-026，Gibco 公司)；
[0089](3)無血清培養(yǎng)添加劑 B27 (B27Supplement, Cat.N0.17504-044, Gibco 公司);
[0090](4)胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Cat.N0.16140-087, Gibco 公司)；
[0091](5)表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF, Cat.N0.E4127, Sigma 公司)；
[0092](6)喊性成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor-Basic, bFGF, Cat.N0.F0291, Sigma 公司);
[0093](7)細(xì)胞消化液 Accutase (Sigma 公司);
[0094](8) BrdU (5-Bromo-2-deoxyUridine，sigma 公司)；
[0095](9) RIPA 裂解液(碧云天，P0013B)；
[0096](10) 二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide, sigma 公司)。
[0097](11)嘌呤霉素(puromycm, sigma 公司)。
[0098]1.3.3主要抗體[0099](I)小鼠抗 TH(1: 200，Millipore 公司)；
[0100](2)大鼠抗 DAT(1: 5000，Millipore 公司)；
[0101](3)結(jié)合有 Alexa Fluor568 的山羊抗鼠 IgG(l: 500, Invitrogen 公司);
[0102](4)小鼠抗 β-actin 抗體(1: 2000, Sigma 公司)；
[0103](5)小鼠抗 TH 抗體(I: 200，Millipore 公司)；
[0104](6)兔抗 Bm4 抗體(1: 1000, Santa Cruz 公司);
[0105](7)兔抗 GDNF 抗體(I: 200，Abcam 公司)；
[0106](8)兔抗 GFRa-1 抗體(I: 5OO, Abcam 公司)；
[0107](9)兔抗 RET 抗體(I: 5000，Abcam 公司)；
[0108](10)辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗小鼠IgG(l: 1000，Pierce公司)；
[0109](11)羊抗兔 IgG(l: 1000，Pierce 公司)；
[0110](12) Hoechst33342 (1: 2000，sigma 公司)。
[0111]1.4實(shí)驗(yàn)方法
[0112]一、重組慢病毒載體構(gòu)建
[0113](I)目的基因獲取
[0114]I)引物設(shè)計(jì)
[0115]根據(jù)Genepharma公司pLV5_EFla_GFP慢病毒表達(dá)載體的要求和GenBank大鼠TH(NM_012740)和Bm4 (NM_017252)的cDNA功能全長序列設(shè)計(jì)合成PCR引物，上游引物5’端加BamHI位點(diǎn)序列，下游引物5’端加NotI位點(diǎn)序列，引物序列ΤΗ-1F、TH-1R、Brn4_lF、Brn4_lR、TH+Brn4、TH+Brn4 如序列表:
[0116]2)擴(kuò)增目的基因片段并且膠回收
[0117](I) PCR 體系如下:
[0118]
【權(quán)利要求】
1.利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，所述的方法包括如下實(shí)施步驟: 一、pLV5-TH+Brn4重組慢病毒載體構(gòu)建: 根據(jù)pLV5-EFla-GFP慢病毒表達(dá)載體的要求和GenBank大鼠TH和Brn4的cDNA功能全長序列分別為 NM_012740 和 NM_017252 的基因，構(gòu)建 pLV5-TH、pLV5_Brn4 和 pLV5_TH+Brn4慢病毒表達(dá)載體，包裝滴度后進(jìn)行測序鑒定和滴度鑒定； 二、神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定: 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法:在無菌條件下取孕14d的SD胎鼠腹側(cè)中腦組織，用吸管反復(fù)吹打直至為細(xì)胞懸液，并經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，收集過濾后的細(xì)胞懸液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗3遍后重懸于NSCs培養(yǎng)液中，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力觀察后，按I X 105/ml細(xì)胞密度接種于含有IOml NSCs培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%、37°C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后可見培養(yǎng)瓶內(nèi)形成懸浮的NSCs球，7天后進(jìn)行傳代培養(yǎng)； 神經(jīng)干細(xì)胞的分離方法:神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3天后，用低速離心收集NSCs球，清洗3遍后用Accutase酶進(jìn)行消化，約IOmin鐘后用含10% FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，通過機(jī)械吹打的方式使其分散成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)； 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定方法:取P3代NSCs在傳代時(shí)培養(yǎng)液中加入終濃度為5 μ mol/L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記，使BrdU整合到神經(jīng)干細(xì)胞DNA中，7天后進(jìn)行BrdU免疫熒光檢測；另取P3代以后的NSCs亞克隆球用Nestin免疫熒光檢測證明其胚胎源性；將PlO代NSCs球接種于預(yù)先置入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，加入含10% FBS的DMEM/F12分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化，2周后分別進(jìn)行MAP_2、GFAP和CNP免疫熒光檢測以證明NSCs的多分化潛能； 四、重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定，包括: 轉(zhuǎn)染效率檢測是將轉(zhuǎn)染后的NSCs球接種至預(yù)涂有多聚賴氨酸圓蓋片的24孔板中，加入含2% FBS的DMEM/F12分化培養(yǎng)液，分化培養(yǎng)I周后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后用Hochest33342染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果； TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測是將各組NSCs分化培養(yǎng)2W后，吸去各孔中的培養(yǎng)液，用0.01MPBS清洗3遍，然后用含4%多聚甲醛的0.1PBS室溫下固定20min，吸去多聚甲醛，PBS清洗3遍，用TUNEL凋亡檢測試劑盒按操作說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，最后PBS洗片3遍后，在避光條件下，加入H0echst33342，室溫濕盒孵育30min，PBS洗片3遍后，中性甘油封片；在正置熒光顯微鏡下觀察TUNEUHoechst陽性細(xì)胞核并攝片；用統(tǒng)計(jì)方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較； 高效液相色譜法檢測分化培養(yǎng)液中DA含量是將各組取NSCs分化培養(yǎng)液1ml，加入`0.lmol/L過氯酸酸化培養(yǎng)液，14000rpm離心15min,取上清過濾后按吳燕瓊等報(bào)道的方法行高效液相色譜測定； 其特征在于:該方法實(shí)施步驟還包括: 三、重組病毒轉(zhuǎn)染NSCs: 所述的重組病毒的轉(zhuǎn)染方法:取P3代NSCs消化制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔接種4 X IO4個(gè)細(xì)胞，加入500 μ I基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；細(xì)胞共分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組6孔:Mock組轉(zhuǎn)染pLV5-GFP慢病毒陰性對照；TH組轉(zhuǎn)染pLV5_TH重組慢病毒；Brn4組轉(zhuǎn)染pLV5_Brn4重組慢病毒；TH+Brn4組轉(zhuǎn)染pLV5_TH+Brn4重組慢病毒；每孔加入20 μ IlX 108TU/ml的慢病毒和5 μ g/ml ploybrene,輕輕搖晃混勻后將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12小時(shí)后更換新鮮分化培養(yǎng)基；感染72小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入I μ g/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；7天后對各組形成的NSCs球進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2.利用權(quán)利要求1所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法獲得一種轉(zhuǎn)染PLV5-TH+Brn4重組慢病毒的神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于:是將權(quán)利要求1中所述的實(shí)施步驟三中獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLV5-TH+Brn4病毒的NSCs制成單細(xì)胞懸液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2X 106/ml，加入1.5ml細(xì)胞凍存管中，同時(shí)加入0.4ml小牛血清和0.1ml 二甲基亞楓，混勻后密封，置4°C I小時(shí)，_20°C 2小時(shí)，然后直接放入_80°C超低溫冰箱中保存獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，其特征在于:所述的重組慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs的鑒定還包括=Western Blot檢測、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測。 所述的Western Blot檢測是將各組轉(zhuǎn)染后的NSCs球接種至24孔板中進(jìn)行分化，另設(shè)一組未轉(zhuǎn)染的NSCs作為對照組，分化培養(yǎng)2周后終止培養(yǎng)，按RIPA裂解液說明書的要求，提取各組中細(xì)胞的蛋白，用10% SDS-PAGE垂直電泳對蛋白進(jìn)行分離，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜15V, 50min, 5%脫脂奶粉封閉后分別加入下列一抗:小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗TH抗體、兔抗Brn4抗體、兔抗⑶NF抗體、兔抗GFRa-1抗體、兔抗RET抗體，室溫孵育2h，4°C過夜，次日分別加入辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育4h，然后進(jìn)行曝光、顯影并用所采集圖像，用圖像分析軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行平均光密度分析，并用統(tǒng)計(jì)的方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較； 所述的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測是各組NSCs分化2周后終止培養(yǎng)，對陰性對照組和各重組病毒轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞進(jìn)行 免疫熒光檢測，簡述如下:所用一抗分別為:小鼠抗TH、大鼠抗DAT ;二抗為:結(jié)合有Alexa Fluor568的山羊抗鼠IgG ;—抗于4°C孵育過夜，二抗室溫下孵育2h，隨后用Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核染色30min，中間各步驟之間均用0.01M PBS進(jìn)行常規(guī)洗片，最后用20%甘油緩沖液封片，并在FVlOi智能型激光共聚焦顯微鏡下觀察TH或DAT的表達(dá)情況，并計(jì)算GFP/TH和GFP/DAT雙標(biāo)細(xì)胞占Hoechst標(biāo)記細(xì)胞的百分比，并用統(tǒng)計(jì)方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間比較。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，其特征在于:所述的高效液相色譜法檢測分化培養(yǎng)液中DA含量的色譜條件:色譜柱為4.6 X 250mm，顆粒度5μπι的Inertsil ODS-SP型十八烷基硅烷腱合硅膠柱，柱溫40°C，流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，流速為l.0ml/min，檢測器為SH)-20A型紫外檢測器，檢測波長280nm ;定性分析:以樣品峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對照定性；定量分析:先利用DA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下依次進(jìn)行樣品測定，用外標(biāo)法定量，以峰面積表不含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，其特征在于:所述的流動相為磷酸鹽緩沖液與甲醇的混合液，其比例為97: 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法，其特征在于:所述的NSCs培養(yǎng)液由DMEM/F12、2% B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組慢病毒誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的 方法，其特征在于:所述的慢`病毒的感染復(fù)數(shù)為50。
【文檔編號】C12N5/10GK103865956SQ201310229277
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】譚雪鋒 申請人:南通大學(xué)