一種高表達(dá)snd1-flag轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法
【專利摘要】一種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。SND1蛋白與哮喘、過敏、結(jié)腸癌、肺癌等多種疾病相關(guān)。本發(fā)明即為針對(duì)位于染色體6A3.3的鼠源SND1轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建方法。主要流程:首先構(gòu)建pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1轉(zhuǎn)基因載體;然后利用受精卵原核注射技術(shù),將外源SND1基因在C57BL6/j小鼠基因組中隨機(jī)插入,最終建立小鼠基因組中帶有外源SND1基因的遺傳性小鼠突變模型。由本發(fā)明所制備的SND1轉(zhuǎn)基因小鼠在實(shí)際應(yīng)用中有助于研究多功能SND1蛋白在生殖發(fā)育、糖脂代謝、腫瘤增殖、遷移等方面的作用機(jī)制,為臨床相關(guān)疾病的診療提供有效的研究平臺(tái)。
【專利說明】—種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]SNDl (staphylococcal nuclease domain containing I)蛋白,又稱 plOO 蛋白,Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease),首次作為 EBNA2 (Epstein-Barr virusnuclear protein 2, EB病毒細(xì)胞核抗原2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn),SNDl蛋白廣泛表達(dá)于人、牛、小鼠、大鼠及斑馬魚等物種中,可參與基因轉(zhuǎn)錄、剪接體加工、細(xì)胞增殖、細(xì)胞應(yīng)激、RNA干擾、病毒感染等多種重要的細(xì)胞生物學(xué)事件。
[0003]SNDl蛋白由N端四個(gè)重復(fù)葡萄球菌核酸酶樣(Staphylococcal nucleases-like,SN-1ikeMA SN( I?4)結(jié)構(gòu)域及 C 端的 SN5a-Tudor_SN5b(TSN)結(jié)構(gòu)域組成。SND1-TSN 包含 4個(gè)α -螺旋、9個(gè)β -折疊和14個(gè)連接環(huán),其中β (廣2)折疊參與SN5a(679 - 703)的構(gòu)成,大部分α 1-螺旋和β (3?6)折疊形成典型的β -桶狀tudor(704 - 793)結(jié)構(gòu)域,β (7?9)-折疊和α (2?4)螺旋參與SN5b (794 - 895)的構(gòu)成。Tudor結(jié)構(gòu)域具有負(fù)電荷表面,還包含一個(gè)由保守的3個(gè)酪氨酸(Tyr721、Tyr738、Tyr741)及I個(gè)苯丙氨酸(Phe715)殘基組成的芳香族籠子,其可以鉤住富含尿卩密唳的小核核糖核蛋白體(Uridine-rich small nuclearribonucleo-proteins, U snRNPs)的甲基化基團(tuán),而將其錨定于剪接體(spliceosome)上。另外,SNDl蛋白的三維模型發(fā)現(xiàn)SN (1?4)結(jié)構(gòu)域具有正電荷表面,而SM具有與TSN相似的可能參與蛋白結(jié)合作用的負(fù)電荷表面。SNDl蛋白的SN3、SM、Tudor-SN5結(jié)構(gòu)域聚集在一起形成新月狀結(jié)構(gòu),其SN3、SM所形成的凹陷型堿性表面是RNase活性位點(diǎn)上檸檬酸鹽離子的結(jié)合部位,可像夾子一樣特異性地結(jié)合并降解處于高編輯(hyper-edited)狀態(tài)的含有IU、UI的雙鏈microRNA前體。
[0004]多功能SNDl蛋白具有較為廣泛且重要的生物學(xué)作用,其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常,都有可能引起一定的臨床疾病。陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道SNDl蛋白與哮喘、過敏、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、乳腺癌等多種人類疾病相關(guān)。比如,SNDl蛋白可通過NF-KB/mir221途徑促進(jìn)人類肝細(xì)胞癌的腫瘤血管生成。寡居核苷酸微陣列基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)人類結(jié)腸腺癌SNDl基因表達(dá)上調(diào)。SNDl蛋白在結(jié)腸癌早期表達(dá)升高,并通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制腺瘤狀結(jié)腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein, APC)的表達(dá),影響細(xì)胞的接觸抑制、極化、增殖等,在結(jié)腸癌早期形成過程中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)比腎細(xì)胞癌與正常腎組織的基因表達(dá)譜微陣列分析發(fā)現(xiàn)非編碼基因的轉(zhuǎn)錄在腎組織中較普遍,并且若干腫瘤相關(guān)的編碼與非編碼基因轉(zhuǎn)錄水平在腎細(xì)胞癌組織中均顯著下調(diào)。在腎透明細(xì)胞癌(Clear Cell RenalCarcinoma)的基因表達(dá)中,SNDI的非編碼基因轉(zhuǎn)錄本明顯下調(diào),推測SNDl可能通過非編碼基因調(diào)控方式來影響STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而參與腎癌的發(fā)生與發(fā)展。另外,SNDl蛋白高表達(dá)于復(fù)發(fā)的雄激素非依賴型前列腺癌組織中,有望成為前列腺癌的生物診斷標(biāo)記和臨床治療靶點(diǎn)。早期腫瘤SNDl蛋白的高表達(dá)與臨床乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率呈正相關(guān)。SNDl可與一種介導(dǎo)癌細(xì)胞遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移的Metadherin (或稱MTDH3、Lyric、AEGl)蛋白結(jié)合,通過調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐受相關(guān)基因(ALDH3A1和KiSSl)的表達(dá),促進(jìn)小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。SNDl還與Metadherin蛋白在結(jié)腸癌中共同高表達(dá),有望成為結(jié)腸癌早期診斷的新靶點(diǎn)。本發(fā)明提供的高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備方法方便研究SNDl蛋白在腫瘤增殖、遷移等過程中的作用機(jī)制,為臨床腫瘤疾病的診療提供研究平臺(tái)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明目的是解決如何在小鼠等動(dòng)物體內(nèi)研究多功能SNDl蛋白的功能機(jī)制問題,提供一種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。小鼠SNDl基因定位于染色體6A3.3,這里我們針對(duì)小鼠SND1-FLAG基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,有助于從動(dòng)物水平深入研究此多功能蛋白。
[0006]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的具體構(gòu)建過程如下:
第 I 步、pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建:
對(duì)小鼠SNDl基因轉(zhuǎn)錄本(BC007126.1)進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析(圖1)。因小鼠SNDl基因ORF片段較長且含有EcoR I和Nhe I酶切位點(diǎn),故根據(jù)后續(xù)載體特點(diǎn),以EcoR I為分界點(diǎn)將ORF分為SNDl-A和SNDl-B兩個(gè)片段,先后插入相應(yīng)轉(zhuǎn)基因載體中;轉(zhuǎn)基因載體中SNDl基因N端追加有一個(gè)3 X FLAG標(biāo)簽基因。
[0007]第2步、轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射:
將第I步構(gòu)建的外源線性Plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL6/j小鼠受精卵細(xì)胞核內(nèi);外源的SNDl基因會(huì)隨機(jī)插入到小鼠基因組中,最終構(gòu)建的SNDl轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在全組織中過表達(dá)攜帶有3XFLAG標(biāo)簽的SNDl蛋白,便于進(jìn)行后續(xù)的蛋白沉淀、蛋白印跡、質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)。
[0008]第3步、品系基因鑒定,最終建立小鼠基因組中帶有外源SNDl基因的遺傳性小鼠突變模型:
經(jīng)過第2步處理后出生的首代SNDl轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠即為Founder小鼠;每個(gè)Founder都將被視為一個(gè)獨(dú)立的品系進(jìn)行繁育,對(duì)每個(gè)founder品系都進(jìn)行首次剪趾,二次剪尾的PCR鑒定。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)本發(fā)明提供的高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備方法在實(shí)際應(yīng)用中方便研究多功能SNDl蛋白在小鼠生殖發(fā)育、糖脂代謝、機(jī)體應(yīng)激防御等方面的作用機(jī)制。
[0010](2)本發(fā)明提供的SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型可過表達(dá)有帶有FLAG標(biāo)簽的SNDl蛋白方便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),如蛋白沉淀、蛋白印跡、質(zhì)譜分析等。
[0011](3)本發(fā)明提供的高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備方法方便研究SNDl蛋白在腫瘤增殖、遷移等過程中的作用機(jī)制,為臨床腫瘤疾病的診療提供研究平臺(tái)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1.小鼠SNDl基因ORF重要酶切位點(diǎn)。
[0013]圖2.小鼠SNDl基因A片段引物設(shè)計(jì)。
[0014]圖3.pcDNA3.1 3 XFLAG RheB質(zhì)粒酶切及與SND1-A片段連接圖譜。
[0015]圖4.pcDNA3.1 3 XFLAG SND1-A 質(zhì)粒圖譜。
[0016]圖5.pCAG 3 XFLAG SND1-A 質(zhì)粒圖譜。
[0017]圖6.pCAG 3 X FLAG SNDl 質(zhì)粒圖譜。
[0018]圖7.plnsulator empty 載體圖譜。
[0019]圖8.plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl 質(zhì)粒。
[0020]圖9.plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl質(zhì)粒的I Ceu I酶切鑒定及線性轉(zhuǎn)基因載體純化。
[0021]圖10.SNDl轉(zhuǎn)基因小鼠首次剪趾PCR鑒定。
[0022]圖11.SNDl轉(zhuǎn)基因小鼠二次剪尾PCR鑒定。
[0023]圖12.成功構(gòu)建的SNDl轉(zhuǎn)基因小鼠。
【具體實(shí)施方式】
[0024]一種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1 pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建
(I)SNDl基因N端追加3 X FLAG標(biāo)簽
O以小鼠SNDl基因轉(zhuǎn)錄本(BC007126.1)為模板,PCR法擴(kuò)增SNDl-A片段。其中設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游加入Bgl II酶切位點(diǎn),下游依次加入Xho I ,Not I和Sal I酶切位點(diǎn)(圖2)。然后PCR產(chǎn)物膠回收,純化線性SNDl基因A片段,然后進(jìn)行Bgl II和Sal I雙酶切處理。
[0026]2)以 BamH I 和 Xho I 酶切 pcDNA3.1 3 XFLAG RheB 質(zhì)粒,獲含 3 XFLAG 標(biāo)簽的線性載體,并與帶有Bgl II和Sal I酶切后粘性末端的SNDl基因A片段T4連接酶連接(圖3),并轉(zhuǎn)化、鑒定、測序、純化,最終獲得pcDNA3.1 3XFLAG SNDl-A載體(圖4)。注:BamH I I與Bgl II ,Xho I與Sal I均系同尾酶。此時(shí)已人工修改了 pcDNA3.1 3XFLAG上的酶切順序,并且破壞BamH I和Sal I酶切位點(diǎn),方便后序載體構(gòu)建。
[0027](2) pCAG 3XFLAG SNDl 質(zhì)粒構(gòu)建
I)以 Nhe I 和 Xho I 分別酶切 pCAG_MS2 載體和 pcDNA3.1 3XFLAG SNDl-A 載體,電泳分離、純化線性口046-1^2載體和帶有3父?1^6的SNDl-A基因片段,T4連接酶連接,并轉(zhuǎn)化、鑒定、測序、純化,最終獲得pCAG 3XFLAG SNDl-A載體(圖5)。
[0028]注:CAG啟動(dòng)子是人工構(gòu)建的組合啟動(dòng)子,由巨細(xì)胞病毒(the cytomegalovirus,CMV)早期增強(qiáng)子(early enhancer element)和雞 β -肌動(dòng)蛋白(chicken beta-actin)啟動(dòng)子組成,用于驅(qū)動(dòng)基因在哺乳動(dòng)物載體的高水平表達(dá)。
[0029]2)以小鼠SNDl基因轉(zhuǎn)錄本為模板,PCR法擴(kuò)增SNDl-B片段。其中設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游含有EcoR I內(nèi)源性酶切位點(diǎn),下游加入Sal I酶切位點(diǎn)。然后PCR產(chǎn)物膠回收,純化線性SNDl基因B片段,然后進(jìn)行EcoR I和Sal I雙酶切處理,電泳分離、純化線性SNDl-B基因片段。
[0030]3)以EcoR I和Xho I酶切pCAG 3 XFLAG SND1-A質(zhì)粒,電泳分離、純化,線性pCAG3 XFLAG SNDl-A載體,再與線性SNDl-B基因片段T4連接酶連接,并轉(zhuǎn)化、鑒定、測序、純化,最終獲得pCAG 3XFLAG SNDl載體(圖6)。
[0031]注:由于SND1A,B兩片段采用同一個(gè)內(nèi)源性EcoR I,故不存在蛋白翻譯的框移突變問題。
[0032](3) plnsulator CAG 3XFLAG SNDl 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
I)以 Sal I 和 BamH I 分別酶切 plnsulator empty 載體(圖 7)和 pCAG 3XFLAG SNDl載體,電泳分離、純化線性plnsulator empty載體和帶有3 X FLAG和CAG元件的SNDl基因片段,T4連接酶連接,并轉(zhuǎn)化、鑒定、測序、純化,最終獲得plnsulator CAG 3XFLAG SNDl載體(圖8)。注:使用隔離子(Insulator)來可減少插入位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。
[0033]2)針對(duì)plnsulator CAG 3XFLAG SNDl轉(zhuǎn)基因載體設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行測序分析,鑒定是否存在點(diǎn)突變。另外,根據(jù)圖譜以I Ceu I酶切此轉(zhuǎn)基因載體,然后進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定(圖9A),可觀察到M,N兩條線性條帶。針對(duì)M條帶進(jìn)行膠回收純化處理,電泳鑒定在7861bp左右得到較單一條帶(圖9B),最終帶得線性的plnsulator CAG 3XFLAG SNDl轉(zhuǎn)基因載體。
[0034]所用引物序列:
SND1-M41-F:5’ GCGTCTCCTCTTTTGCTCCC 3’
SND1-M685-R:5’ TGCTTGTTCCTCGCATTCTG 3’
SND1-M862-F:5’ TCACCACCTTGTCACCGTCA 3’
SND1-M1219-R:5’ AGCAGTGGGAGGCACATAGTC 3’ 。
[0035]實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射
將外源線性plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL6/j小鼠受精卵細(xì)胞核內(nèi);外源的SNDI基因會(huì)隨機(jī)插入到小鼠基因組中,最終構(gòu)建的SNDI轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在全組織中過表達(dá)攜帶有3XFLAG標(biāo)簽的SNDl蛋白,便于進(jìn)行后續(xù)的蛋白沉淀、蛋白印跡、質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)。
[0036]實(shí)施例3品系基因鑒定,最終建立小鼠基因組中帶有外源SNDl基因的遺傳性小鼠突變模型
(O首次剪趾鑒定
O剪趾并抽取90只小鼠基因組DNA:幼仔出生15天左右進(jìn)行編號(hào)剪腳趾;將所剪小鼠腳趾樣本加EB (裂解液)55 μ I (裂解液100:1加入蛋白酶K),55°C裂解過夜;次日將樣本取出,12000r/min,離心Imin ;將樣本取出,加入700 μ I酚/氯仿(1:1),混勻;12000r/min,離心5min.取上清至1.5mlEP管,加2倍體積100%乙醇。輕輕混勻,會(huì)有絮樁沉淀出現(xiàn);12000r/min,離心 5min.棄上清;加 700 μ I 70% 冰乙醇,混勻,12000r/min,離心 5min ;棄上清,12000r/min,離心Imin ;超凈臺(tái)晾干,加入80 μ I EB緩沖液/ddH20,60°C溶解0.5h。
[0037]2)PCR鑒定:以小鼠基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。采用引物F: 5 ‘GCAACGTGCTGGTTATTGTG; R: CTGGGTTGTTGGCTCTCAT, PCR 產(chǎn)物大小為 594bp。鑒定結(jié)果顯示(圖 10):#2、#30、#39、#40、#43、#46、#56、#61、#64、#66、#73 為陽性鼠。(備注:43# 死亡)
(2)二次剪尾鑒定
對(duì)于首次鑒定呈陽性的小鼠進(jìn)行剪尾、抽取小鼠基因組DNA,并以之為模板,進(jìn)行PCR鑒定,方法同上。鑒定結(jié)果(圖11)顯示:#2、#30、#39、#46、#56、#61、#64、#66、#73為陽性鼠。至此,SNDl轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建成功(圖12)。
【權(quán)利要求】
1.一種高表達(dá)SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法,其特征包括以下步驟: 第 I 步、pInsulator-CAG-3XFLAG-SNDl 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建; 第2步、轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射; 第3步、品系基因鑒定,最終建立小鼠基因組中帶有外源SNDl基因的遺傳性小鼠突變模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于第I步所述plnsulator-CAG-3XFLAG-SNDI轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法是,以EcoR I為分界點(diǎn)將較長的小鼠SNDl基因ORF分為SNDl-A和SNDl-B兩個(gè)片段,先后插入轉(zhuǎn)基因載體中;轉(zhuǎn)基因載體中SNDl基因N端追加有一個(gè)3 X FLAG標(biāo)簽基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于第2步所述的轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射是:將外源線性plnsulator CAG 3 XFLAG SNDl轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL6/j小鼠受精卵細(xì)胞核內(nèi);外源的SNDI基因會(huì)隨機(jī)插入到小鼠基因組中,最終構(gòu)建的SNDI轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在全組織中過表達(dá)攜帶有3XFLAG標(biāo)簽的SNDl蛋白,便于進(jìn)行后續(xù)的蛋白沉淀、蛋白印跡、質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于第3步所述的基因鑒定是:出生的首代SNDl轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠即為Founder小鼠;每個(gè)Founder都將被視為一個(gè)獨(dú)立的品系進(jìn)行繁育,對(duì)每個(gè)founder品系都進(jìn)行首次剪趾,二次剪尾的PCR鑒定。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104278056SQ201310285219
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月9日
【發(fā)明者】楊潔, 高星杰, 魏民新, 王鑫廷, 段中潮, 辛靈彪 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)