一種cd81和ocln雙轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和用途，該雙轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于建立急性和慢性HCV感染小鼠模型。
【專利說(shuō)明】—種CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)涉及一種CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠及其構(gòu)建方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎在全世界廣泛流行，目前約有1.3-1.7億丙型肝炎患者。近80%HCV感染人群形成慢性感染，其中一部分慢性丙肝將進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌。HCV有不同的亞型，不同人種間流行亞型不同，不同亞型對(duì)現(xiàn)有臨床治療的響應(yīng)性不一樣。目前尚沒(méi)有HCV疫苗。因此，如何有效預(yù)防和治療丙型肝炎仍是亟待解決的重大衛(wèi)生與健康問(wèn)題。
[0003]HCV感染和致病機(jī)制的基礎(chǔ)研究，藥物和疫苗開(kāi)發(fā)均依賴于合適的動(dòng)物模型。除了人類之外，黑猩猩也對(duì)HCV易感。但黑猩猩數(shù)量少，繁殖慢，使用費(fèi)用高，靈長(zhǎng)類動(dòng)物福利和倫理問(wèn)題復(fù)雜，且不能反映慢丙性病型肝炎的病理，黑猩猩被用于研究的范圍有限，人們從黑猩猩感染模型獲得丙型肝炎相關(guān)理論和技術(shù)的突破受到極大限制。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)開(kāi)發(fā)丙型肝炎的小動(dòng)物模型的研究也取得了一定的進(jìn)展，包括:
[0004](I)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因小鼠:有HCV小鼠模型通常是將HCV全長(zhǎng)基因組或者特定蛋白的片段通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法整合到小鼠基因組中，構(gòu)建持續(xù)性表達(dá)HCV蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠(Moriya et al.，1998)。HCV基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小鼠體細(xì)胞中超量表達(dá)，會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞造成表達(dá)壓力。這類小鼠模型只表達(dá)HCV基因片段，缺乏HCV病毒顆粒侵入細(xì)胞和在細(xì)胞中復(fù)制的過(guò)程，因此其應(yīng)用非常有限。
[0005](2)樹(shù)駒模型:樹(shù)駒能被丙型肝炎病毒侵染(Tong et al.，2011;Xu etal.，2007)。但屬于一過(guò)性感染，無(wú)法建立穩(wěn)定可重復(fù)的感染；樹(shù)駒動(dòng)物本身為野生動(dòng)物，不易飼養(yǎng)和繁殖，遺傳品系不穩(wěn)定，無(wú)法長(zhǎng)期、穩(wěn)定研究和利用。
[0006](3)嵌合體小鼠模型:在免疫缺陷小鼠中移植人肝細(xì)胞或在腎包膜下包埋人源肝組織的小鼠，雖能夠支持丙型肝炎病毒的有限感染和復(fù)制，但病毒感染效率低，人肝組織或細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)大，缺乏針對(duì)丙型肝炎病毒的免疫病理反應(yīng)。例如，在嚴(yán)重免疫缺陷型(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠中，白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異表達(dá))控制尿激酶型纖溶酶原激活基因(urokinase-type plasminogen-activator gene, uPA)的表達(dá)，肝臟特異表達(dá)的uPA將造成持續(xù)性的小鼠肝損傷，將人的肝細(xì)胞移植到小鼠中，即可建立人肝細(xì)胞嵌合的小鼠模型(Kaul et al., 2007) 0
[0007](4)自身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重缺陷并移植了人肝細(xì)胞和人免疫系統(tǒng)的小鼠，丙型肝炎病毒能有限感染及伴隨部分肝炎病理，但技術(shù)復(fù)雜，嚴(yán)重免疫缺陷小鼠不易獲得，整個(gè)人源化操作不穩(wěn)定，又牽涉到倫理問(wèn)題。例如，在免疫缺陷型的Balb/CRagZ+IUrg+小鼠中，白蛋白啟動(dòng)子控制FK506結(jié)合蛋白與caspase8融合蛋白特異性在小鼠肝細(xì)胞中表達(dá),造成可誘導(dǎo)性肝細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)后可接受人源肝細(xì)胞移植(Washburn et al., 2011) ?
[0008](5)研究表明，丙型肝炎病毒感染的種屬特異性取決于其侵染特異性受體。在細(xì)胞水平已證明，轉(zhuǎn)入人源丙型肝炎病毒的細(xì)胞受體⑶81(Clusters of Differentiation 81:分化抗原81)和OCLN (Occludin:閉合蛋白)的小鼠細(xì)胞能支持病毒感染和復(fù)制。利用腺病毒載體攜帶CD81和OCLN在鼠肝細(xì)胞瞬間表達(dá)后，可檢測(cè)到丙型肝炎病毒在小鼠肝細(xì)胞中的復(fù)制，但不能建立感染和引起肝炎病理變化。例如，將四個(gè)HCV受體基因通過(guò)腺病毒載體表達(dá)于小鼠體內(nèi)，能使HCV能夠進(jìn)入小鼠細(xì)胞并復(fù)制。但HCV在這個(gè)模型中無(wú)法完成復(fù)制生活周期，也無(wú)法觀察丙型肝炎的病理進(jìn)程(Dorner et al., 2011) 0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明首先提供了一種⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠是通過(guò)如下方法建立的:
[0010](I)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體pLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN ；
[0011](2)CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建；
[0012]將載體pLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進(jìn)行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段；
[0013]將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵；
[0014]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0015]小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠；
[0016]建系小鼠經(jīng)回交獲得同時(shí)含有⑶81和OCLN的轉(zhuǎn)基因子代小鼠。
[0017]本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的方法:
[0018](I)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體pLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN ；
[0019](2) CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建；
[0020]將載體pLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進(jìn)行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段；
[0021]將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵；
[0022]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0023]小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠；
[0024]建系小鼠經(jīng)回交獲得同時(shí)含有⑶81和OCLN的轉(zhuǎn)基因子代小鼠。
[0025]具體的說(shuō)，本發(fā)明的CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建方法的具體步驟為:
[0026](I)人CD81、0CLN基因的克隆
[0027]從人cDNA文庫(kù)中通過(guò)RNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出人CD81和OCLN編碼DNA(cDNA) (DNA 序列分別為 SEQ ID:1 和 SEQ ID:2)；
[0028]⑶81cDNA插入pLIVE載體核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體pLIVE-⑶81 ；
[0029]OCLN cDNA插入pLIVE載體核酸內(nèi)切酶Sal I和Xho I酶切位點(diǎn)，獲得含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN ；
[0030]其中pLIVE載體含小鼠甲胎蛋白增強(qiáng)子和小鼠白蛋白啟動(dòng)子，可用于轉(zhuǎn)基因在小鼠肝臟的高效、特異性、穩(wěn)定、長(zhǎng)效表達(dá)；
[0031](2) CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建[0032]pLIVE-CD81 載體 DNA 經(jīng) Bgl II 和 Nde I 內(nèi)切酶消化，pLIVE-OCLN 載體 DNA 經(jīng) XbaI和Nde I內(nèi)切酶消化，分別得到含該基因的線性化DNA片段(基因序列分別為SEQ ID:3和SEQ ID:4)；
[0033]將DNA片段分別稀釋至Ing/mL，經(jīng)顯微注射入ICR小鼠受精卵；
[0034]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0035]小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠(⑶8 lTg/_和0CLNTg/O ；
[0036]建系小鼠經(jīng)回交獲得同時(shí)含有CD81和OCLN轉(zhuǎn)基因子代小鼠(CD81Tg/0CLNTg，簡(jiǎn)稱C/0Tg)。
[0037]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將⑶81和OCLN分別整合到小鼠染色體上，然后通過(guò)遺傳學(xué)手段選育出含⑶81和OCLN轉(zhuǎn)基因的小鼠，小鼠基因組穩(wěn)定整合并同時(shí)表達(dá)編碼HCV受體的人CD81和OCLN兩個(gè)基因，但不影響其等位的宿主基因，故對(duì)宿主盡可能小的造成影響，可以用來(lái)支持HCV進(jìn)入小鼠肝細(xì)胞。
[0038]本發(fā)明還提供了上述⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的用途，其可用于建立急性和慢性HCV感染小鼠模型，CD81和OCLN的雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HCV復(fù)制對(duì)抗病毒藥物(包括核苷酸類似物和蛋白酶抑制劑)敏感，可在HCV自然感染小鼠中驗(yàn)證針對(duì)HCV的抗病毒藥物的藥效、免疫調(diào)節(jié)劑的抗病毒評(píng)價(jià)、臨床治療方案研究和優(yōu)化、和疫苗研發(fā)。
[0039]而且可以在具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠中重現(xiàn)HCV病毒感染自然史和病理進(jìn)程，使HCV在小鼠中持續(xù)復(fù)制，肝臟和外周血中HCV病毒載量穩(wěn)定；從而可建立急性和慢性感染及其肝臟病理模型。
[0040]本發(fā)明首次構(gòu)建了丙型肝炎病毒受體CD81和OCLN的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，構(gòu)建方法穩(wěn)定，能穩(wěn)定批量的制備；
[0041]本發(fā)明首次在⑶81和OCLN的雙轉(zhuǎn)基因小鼠中建立能夠完整反映HCV自然感染史和丙型肝炎病理進(jìn)程的持續(xù)感染模型；
[0042]還可以利用OCLN和CD81基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展各種針對(duì)HCV的診斷、檢測(cè)技術(shù)、方法和產(chǎn)品；
[0043]本發(fā)明還提供了利用OCLN和⑶81基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)血感染HCV病毒產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，包括但不限于抗體、廣譜和或中和抗體、抗原遞呈細(xì)胞、HCV反應(yīng)性T細(xì)胞等;
[0044]利用OCLN和⑶81基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)血感染HCV病毒可能產(chǎn)生的各種HCV突變體突變信息可用于藥物設(shè)計(jì)、疫苗開(kāi)發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1-A包含人源⑶81和OCLN的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建圖譜
[0046]圖1-B鼠尾提取DNA，PCR鑒定小鼠的基因型
[0047]圖1-C檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟人CD81和OCLN的表達(dá)，肝癌細(xì)胞系Huh7，Huh7.5.1作為對(duì)照`
[0048]圖1-D通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠中人源CD81和OCLN在不同組織中的表達(dá)
[0049]圖1-E檢測(cè)人源⑶81和OCLN在轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞的定位。[0050]圖2-A實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉(zhuǎn)基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對(duì)照小鼠wt (n=3)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，分析血清病毒載量。
[0051 ] 圖2-B實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉(zhuǎn)基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對(duì)照小鼠wt (n=3)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，分析肝臟病毒載量。
[0052]圖2-C實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉(zhuǎn)基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對(duì)照小鼠wt (n=3)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，分析血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。
[0053]圖2-D實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉(zhuǎn)基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對(duì)照小鼠wt(n=3)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死,分析血清前白蛋白(PA)水平。
[0054]圖2-E慢性感染導(dǎo)致脂肪變性出只在感染后I個(gè)月，5只在感染后2個(gè)月)，纖維化(4只在感染后6個(gè)月，4只在感染后10個(gè)月)，肝硬化(4只在感染后13個(gè)月)時(shí)的血清和肝臟病毒載量，肝損傷(ALT水平)，抗HCV抗體的指標(biāo)。每組左側(cè)的點(diǎn)表示病理階段小鼠經(jīng)由超聲，CT和病理評(píng)判為陽(yáng)性的小鼠數(shù)據(jù)。右側(cè)的點(diǎn)表示為病理階段陰性的小鼠。
[0055]圖3-A通過(guò)H&E染色分析肝臟(每只小鼠3張切片)，虛線標(biāo)出中央靜脈淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(e-f)淋巴細(xì)胞在肝小葉聚集(g_h)柱狀圖顯示了每張切片的淋巴細(xì)胞聚集數(shù)量。
[0056]圖3-B H&E染色表現(xiàn)出微小的水泡樣脂肪變性(箭頭所示)。淀粉樣沉積物或組織壞死(虛線標(biāo)出)
[0057]圖3-C masson染色顯示纖維化進(jìn)展。纖維化程度由彌散度評(píng)價(jià)(纖維化區(qū)域/纖維化區(qū)域數(shù)量)
[0058]圖3-D血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β I)在HCV感染后的表達(dá)。
`[0059]圖4-A C/0Tg小鼠注射病毒I周后，以(200毫克/千克)進(jìn)行利特拉匹偉藥物注射，對(duì)照小鼠注射DMSO。qRT-PCR分析治療后小鼠血清和肝臟的病毒拷貝數(shù)。
[0060]圖4-B C/0Tg小鼠注射病毒I周后，以(20毫克/千克)進(jìn)行利巴韋林藥物注射，對(duì)照小鼠注射生理鹽水。qRT-PCR分析治療后小鼠血清和肝臟的病毒拷貝數(shù)。
[0061]圖5pLIVE 載體
【具體實(shí)施方式】
[0062]ICR小鼠:⑶-1 ?小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司
[0063]pLIVE載體:購(gòu)于美國(guó)Mirus公司。
[0064]實(shí)施例1⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
[0065]從人cDNA文庫(kù)中通過(guò)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出人CD81和OCLN編碼DNA (cDNA,序列分別為SEQ ID:1和SEQ ID:2)，擴(kuò)增條件為:95度10分鐘；95度30秒，58度30秒，72度2分鐘，33個(gè)循環(huán)；72度10分鐘。(Pfuultra II酶購(gòu)于Agliant公司)。⑶81cDNA插入pLIVE載體核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體pLIVE-CD81 ；0CLN cDNA插入pLIVE載體核酸內(nèi)切酶Sal I和Xho I酶切位點(diǎn)，獲得含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN (核酸內(nèi)切酶購(gòu)于NEB公司、pLIVE載體購(gòu)于Mirus公司)。pLIVE-CD81載體DNA經(jīng)Bgl II和Nde I內(nèi)切酶消化，pLIVE-OCLN載體DNA經(jīng)XbaI和Nde I內(nèi)切酶消化，分別得到含該基因的線性DNA片段(圖1_A，片段序列分別為SEQID:3和SEQ ID:4)。將兩個(gè)線性DNA片段分別稀釋至Ing/mL，經(jīng)顯微注射入ICR小鼠受精卵。受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定(圖1-B)，分別獲得CD81和OCLN的建系小鼠(CD81Tg/_和0CLNTg/_);建系小鼠經(jīng)交配CD81Tg/_和0CLNTg/_單轉(zhuǎn)基因小鼠最終獲得同時(shí)含有⑶81和OCLN轉(zhuǎn)基因子代小鼠(⑶81Tg/0CLNTg，簡(jiǎn)稱C/0Tg)。
[0066]實(shí)施例2HCV持續(xù)感染模型的建立 [0067]丙型肝炎病毒(Huh7.5.1細(xì)胞(巴斯德研究所)，通過(guò)電轉(zhuǎn)P-J399EM (實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)(Han et al.，2009)體外轉(zhuǎn)錄得到的全長(zhǎng)HCV的RNA，培養(yǎng)96h后收集上清，上清超濾純化)通過(guò)尾靜脈注射(TCID5ci=IXIO8),注射時(shí)間控制在I~2分鐘。分別感染C/0Tg|轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型ICR鼠，分別在感染后O小時(shí)-12月，不同時(shí)間點(diǎn)采集血清或者肝臟組織。以實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)方法檢測(cè)血清(genomes/mL)和肝細(xì)胞(genomes/g)中HCV RNA含量。條件為:50度30分鐘；95度10分鐘；95度30秒，58度30秒，72度30秒(采集信號(hào))，50個(gè)循環(huán)，引物序列為=Sence(正向引物):ATCACTCCCCTGTGAGGAACT ；Ant1-sence (反向引物):GCGGGTTGATCCAAGAAAGG。注射病毒后wt的血清病毒載量為(genomes/mL):53746900±747977 (12 小時(shí))，25791242±8626787(2 天)，7026±2797(4 天)，433±73(1周)，1周后wt小鼠的外周血檢測(cè)不到病毒拷貝。注射病毒后C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠外周血病毒載量(genomes/mL)(圖 2_A):35986785±3016340 (12 小時(shí))，1607875± 1304933(2 天)，228942± 174178 (4 天)，64505±6821 (I 周)，67622±4612 (2 周)，33671 ± 13347(3 周)，6921±4272 (I 個(gè)月)，6739±4783 (2 個(gè)月)，403±95 (3 個(gè)月)，534± 125 (4 個(gè)月)，1375±198 (6 個(gè)月)，4781±2969 (10 個(gè)月)，2067±277 (12 個(gè)月)。結(jié)果顯示 HCV能夠在C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血形成持續(xù)的病毒血響應(yīng)。注射病毒后wt小鼠的肝臟檢測(cè)不到病毒拷貝，而C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟病毒拷貝數(shù)為(genomes/g)(圖2-B):149676500±26422459.09 (12 小時(shí))，68863260±26554660 (2 天)，30167166± 14023164(4 天)，48183923±49326087 (I 周)，5221675±782099 (2 周)，4723475±570250 (3 周)，5649760 ±3372903 (I 個(gè)月)，3597135±2671267 (2 個(gè)月)，1831199±34834 (3 個(gè)月)，3055570±565440 (4 個(gè)月)，10729851 ±3954535 (6 個(gè)月)，14392085± 1902774 (10 個(gè)月)，15543000± 124774 (12個(gè)月)，結(jié)果顯示HCV能夠在C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟形成持續(xù)的復(fù)制。同時(shí)，對(duì)肝組織進(jìn)行病理分析(H&E、Masson’ s染色)，超聲、CT等無(wú)創(chuàng)傷影像學(xué)分析，以評(píng)估HCV感染導(dǎo)致的肝炎、肝損傷(肝纖維化、肝硬化)等典型丙型肝炎病理。HCV感染的雙轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為輕微的肝炎癥狀(大部分ALT < 40)。wt小鼠組ALT (U/L)水平為:17.8±11.08(未感染)，10.5±0.51 (12 小時(shí))，7.0± 1.42 (2 天)，29.5±9.19 (4天)，6.6±3.54 (I 周)，28.2±8.84 (2 周)，17.7± 13.33 (I 個(gè)月)，27.9± 1.69 (2 個(gè)月)，26.5±0.70 (3 個(gè)月)，37.4±12.90 (4 個(gè)月)，27.3±6.01 (10 個(gè)月)，16.5±6.29 (12 個(gè)月)。C/0Tg|轉(zhuǎn)基因小鼠的ALT(U/L)水平為:17.8± 11.01(未感染)，7.8±6.72(12小時(shí))，28.0±1.25(2 天)，57.3±3.88(4天)，16.3±7.72(1 周)，61.0±5.65(2 周)，21.2±11.16(I 個(gè)月)，19.6±0.68 (2 個(gè)月)，27.4±10.25 (3 個(gè)月)，36.3±4.06 (4 個(gè)月)，35.7±5.44(6個(gè)月)，19.5±3.79 (10個(gè)月)，232.3±26.89 (12個(gè)月)。結(jié)果顯示注射病毒后的wt小鼠幾乎沒(méi)有肝炎癥狀(ALT <40)，而C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠在感染病毒的大部分時(shí)間也幾乎沒(méi)有肝炎癥狀，只在感染晚期有肝炎癥狀(ALT >40)(圖2-C)。注射病毒后wt組的前白蛋白幾乎都維持在正常水平(20~30mg/L)而C/0Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠在感染后4天就幾乎檢測(cè)不到，提示病毒感染造成了一定的肝損傷(圖2-D)。通過(guò)H&E染色發(fā)現(xiàn)，感染HCV的雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟出現(xiàn)淋巴細(xì)胞聚集，在感染后I周到5個(gè)月在每張切片都能發(fā)現(xiàn)5~20個(gè)數(shù)目不等的淋巴細(xì)胞聚集(圖3-A)，感染后I~2個(gè)月脂肪變性(水泡樣結(jié)構(gòu))以及感染后3~6個(gè)月血管周邊淀粉樣沉積和感染后10個(gè)月細(xì)胞壞死(圖3-B)。Masson染色顯示(圖3-C)在感染后6個(gè)月出現(xiàn)明顯的膠原纖維聚集(藍(lán)色)提示肝臟纖維化出現(xiàn)。而彌散度(纖維化區(qū)域/纖維化區(qū)域數(shù)量)顯示感染后3個(gè)月為60，而感染后6個(gè)月以及10個(gè)月為180，顯示纖維化程度的加深。分析顯示感染后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-0 I)表達(dá)的升高也證實(shí)了纖維化的加深(圖3-D)。而通過(guò)比較脂肪變性，纖維化以及肝硬化的小鼠以及相同時(shí)間病理陰性的小鼠發(fā)現(xiàn)只在脂肪變性階段肝臟病毒拷貝數(shù)和血清HCV抗體水平病理陽(yáng)性組和病理陰性組存在顯著性差異其余都沒(méi)有顯著性差異(圖2-E)。以上結(jié)論顯示雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠支持HCV復(fù)制并產(chǎn)生與臨床相同的病理過(guò)程。
[0068]實(shí)施例3利用HCV急性感染小鼠進(jìn)行的抗病毒藥物的藥效評(píng)價(jià)
[0069]丙型肝炎病毒通過(guò)尾靜脈注射(TCID5tl=I X IO8)感染C/0Tg雄性小鼠，注射時(shí)間控制在I~2分鐘。感染一周后開(kāi)始進(jìn)行藥物治療，利巴,林(ribavirin, RBV(sigma)給藥持續(xù)4周，姆天腹腔注射20mg/kg)或者特拉匹偉(Telaprevir (votex, VX-950),給藥持續(xù)2周，每天腹腔注射200mg/kg)單組份抗病毒藥物治療。利巴韋林在治療后I周和4周，特拉匹偉在治療后I周和2周取小鼠的血清和肝組織。qRT-PCR方法檢測(cè)血清、肝細(xì)胞中HCVRNA拷貝數(shù)(方法見(jiàn)實(shí)施例2)。相對(duì)于非治療組，利巴韋林在治療后顯著降低了血清和肝臟的病毒拷貝數(shù)，其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL) 123489±5761 (注射病毒后I周)，68312±214 (生理鹽水腹腔注射I周)，5958± 1332(生理鹽水腹腔注射I個(gè)月);而治療組123489土5761 (注射病韋后I周)，而利巴,林治療I周以及4周在外周血檢測(cè)不到病韋拷貝。肝臟病毒拷貝(genomes/mg)未治療組:17864±3223 (注射病毒后I周)，5289±891(生理鹽水腹腔注射后I周)，4713±916 (生理鹽水腹腔注射后4周)，治療組17864±3223(注射病毒后I周)，260 ±226 (注射利巴韋林后I周)，894±639 (注射利巴韋林4周)。結(jié)果顯示利巴韋林治療能有效降低HCV在血清中的拷貝數(shù)以及在肝臟的復(fù)制(圖4-A)而針對(duì)HCV特異性藥物特拉匹偉，相對(duì)于非治療組，特拉匹偉在治療后顯著降低了血清和肝臟的病毒拷貝數(shù)，其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL)其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL) 123489±5761 (注射病毒后 I 周)，39782±5315 (DMS0 腹腔注射 I 周)，4349±1531 (DMS0腹腔注射I個(gè)月);而治療組123489±5761 (注射病毒后I周)，特拉匹偉治療I周以及2.周在外周血檢測(cè)不到病毒拷貝。肝臟病毒拷貝(genomes/mg)未治療組:17864±3223 (注射病毒后 I 周)，14041 ±2712 (DMS0 腹腔注射后 I 周)，4723±570 (DMS0腹腔注射后4周)，治療組11836±1104 (注射病毒后I周)，273±301 (注射特拉匹偉后I周)，注射特拉匹偉4周肝臟檢測(cè)不到病毒拷貝。結(jié)果顯示利巴韋林治療能有效降低HCV在血清中的拷貝數(shù)以及在肝臟的復(fù)制(圖4-B)。提示雙轉(zhuǎn)基因小鼠的HCV感染模型對(duì)于臨床現(xiàn)行藥物敏感，是評(píng)估HCV藥物的優(yōu)秀平臺(tái)。
【權(quán)利要求】
1.一種⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于該雙轉(zhuǎn)基因小鼠是通過(guò)如下方法建立的: (1)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體PLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN ； (2)⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建； 將載體PLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進(jìn)行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段； 將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵； 受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮； 小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠； 建系小鼠經(jīng)回交獲得同時(shí)含有CD81和OCLN的轉(zhuǎn)基因子代小鼠。
2.一種制備權(quán)利要求1所述CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其特征在于該方法為: (1)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達(dá)載體PLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達(dá)載體pLIVE-OCLN ； (2)⑶81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建； 將載體PLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進(jìn)行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段； 將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵； 受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮； 小鼠出生后經(jīng)基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠； 建系小鼠經(jīng)回交獲得同時(shí)含有CD81和OCLN的轉(zhuǎn)基因子代小鼠。
3.權(quán)利要求1所述CD81和OCLN雙轉(zhuǎn)基因小鼠建立急性和慢性HCV感染小鼠模型的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103548775SQ201310502450
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】唐宏, 陳新文, 陳繼征, 趙洋, 張超, 陳海榮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所