糜蛋白酶原的仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，包括下列步驟：(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，分別與L-纈氨酸以及對氨基苯磺酸反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶原，將含有糜蛋白酶原的樣品流過該親和層析柱，糜蛋白酶原吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，將結(jié)合的糜蛋白酶原洗脫下來。(3)用胰蛋白酶進(jìn)行糜蛋白酶原的激活。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高酶活的糜蛋白酶。
【專利說明】糜蛋白酶原的仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】的純化方法。特別是一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶的純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶是從胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理及臨床上的功用主要有1.用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合、抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫、乳房手術(shù)后浮腫、中耳炎、鼻炎等。2.對眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，可用于白內(nèi)障摘除，使晶狀體比較容易地移去。3.使粘稠的痰液稀化，便于咳出，對膿性和非膿性痰液均有效。
[0003]在動(dòng)物胰臟中含有大量的酶，大多數(shù)以酶原非活性的形式存在，經(jīng)胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在動(dòng)物胰臟中大部分的酶為絲氨酸蛋白酶家族，特別是胰蛋白酶原與糜蛋白酶原的理化性質(zhì)相近，難以將二者分離。目前國際上通用的動(dòng)物組織提取藥用蛋白工藝是基于傳統(tǒng)的鹽析、沉淀等方式，這種工藝提取特異性差，操作過程目標(biāo)產(chǎn)品損失大，以這種傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品活性一般在800-1000單位/毫克，最高只能達(dá)到1200單位/毫克左右。從市場上采購的通用純化介質(zhì)和純化技術(shù)，如超濾、分子篩凝膠層析、離子交換凝膠層析、疏水凝膠層析。由于這些純化介質(zhì)和方法的純化效率低、往往需要多介質(zhì)與多個(gè)步驟組合才能達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量要求，生產(chǎn)步驟的增多導(dǎo)致產(chǎn)品總回收率降低，生產(chǎn)成本升高,純化工段成本可高達(dá)總生產(chǎn)成本60% -80%。加之這類介質(zhì)多由國際公司定價(jià)并且每年以15%提價(jià)，造成蛋白純化工藝升級(jí)慢，工藝成本高，難以形成產(chǎn)業(yè)化，嚴(yán)重制約資源的充分利用。
[0004]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物胰臟中提取純化糜蛋白酶的方法有多種，多為硫酸銨沉淀，陽離子交換和陰離子交換層析，超濾等，如中國專利102618523A—種糜蛋白酶的純化；中國專利101302505A —種分離提取糜蛋白酶的方法；由于采用多步提取純化，導(dǎo)致糜蛋白酶的回收率低，酶活性不高；有專利報(bào)道采用親和層析技術(shù)進(jìn)行糜蛋白酶的純化，如中國專利1807612A —種糜胰蛋白酶的制備方法，以卵粘蛋白作為親和配基，由于這種親和配基成本較高，且使用壽命較短，糜蛋白酶的生產(chǎn)成本高，不利于工業(yè)上的放大進(jìn)行。
[0005]因此，有必要開發(fā)效率高、成本低、生產(chǎn)步驟更簡便的糜蛋白酶原分離材料和和生產(chǎn)工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糜蛋白酶原仿生親和材料及糜蛋白酶的純化方法，使其克服糜蛋白酶大規(guī)模純化中的缺點(diǎn)，在大規(guī)模分離純化時(shí)步驟少、成本低、效率高，利用糜蛋白酶原專一的親和配位體，可快速、簡便、低成本、大批量純化糜蛋白酶。
[0007]因此本發(fā)明的目的在于提供糜蛋白酶原特異性的親和配基，制備糜蛋白酶原仿生親和材料；
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于建立糜蛋白酶層析純化方法，保證在大規(guī)模分離純化時(shí)，高效的提取糜蛋白酶。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶原。
[0010]本發(fā)明包括以下步驟
[0011](I)在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上進(jìn)行固相合成，制備仿生親和分離材料；
[0012]合成糜蛋白酶原專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，或用常規(guī)化學(xué)方法對基礎(chǔ)層析介質(zhì)進(jìn)行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應(yīng)活化，然后與L-纈氨酸和對氨基苯磺酸反應(yīng)，合成親和分離材料。
[0013](2)用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶；
[0014]用上述合成的親和層析介質(zhì)制備成親和層析柱，將胰臟提取液上清流過該親和層析柱，糜蛋白酶原吸附在親和層析柱上，未結(jié)合的其它蛋白被洗去，改變換緩沖液條件將結(jié)合的糜蛋白酶原洗脫下來，得到高純糜蛋白酶原。
[0015](3)糜蛋白酶原激活。
[0016]洗脫下來的糜蛋白酶原經(jīng)胰蛋白酶激活后，即得到糜蛋白酶。
[0017]在步驟(I)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
[0018]在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附糜蛋白酶原的條件為PH6-7，離子強(qiáng)度為0.0-0.3M的緩沖液；洗雜條件為PH6-7，離子強(qiáng)度為0.05M的緩沖液；洗脫條件為PH6-7，離子強(qiáng)度為0.5-1.0M的緩沖液。
[0019]在步驟(3)中，糜蛋白酶原激活的條件為pH7.6，按照(I: 10) (L:mg)比例加入胰蛋白酶，4°C，激活24-48h。
[0020]所述的仿生親和分離材料，其結(jié)構(gòu)是通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂固定L-纈氨酸及對氨基苯磺酸基團(tuán)。
[0021 ] 所述的糜蛋白酶原，其原料為哺乳動(dòng)物胰臟。
[0022]本發(fā)明克服了糜蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使糜蛋白酶生產(chǎn)分離純化時(shí)步驟少，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，利用糜蛋白酶原專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化糜蛋白酶。糜蛋白酶一步純化的回收率> 60%，酶活> 1500U/mg，CT/T > 10。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:1_氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氨基苯磺酸-2,4,6-三氮嗪純化糜蛋白酶原SDS-PAGE檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,如起始材料NH2-Sepharose可以更換成葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠等，這些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明的范圍。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步的闡述:
[0026]實(shí)施例1
[0027]一分離材料制備
[0028]取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O: 1,1: 3,1: 1,3: 1,1: O)洗滌，得到1-氨基-Sepharose-3, 5_ 二氯-2,4,6_ 三氮嗪。
[0029]稱取L-纈氨酸(3?5g)用去離子水溶解，與介質(zhì)1-氨基-S印harose-3，5_ 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50°C中攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-纈氨酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20 %乙醇儲(chǔ)存待用。
[0030]取介質(zhì)1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氯-2,4,6-三氮嗪(30mL),并稱取對氨基苯磺酸(3?5g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7,倒入反應(yīng)器與介質(zhì)1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混勻,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下攪拌反應(yīng)60小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3倍體積的二甲亞砜洗滌，然后用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-纈氨酸-5-氨基苯磺酸_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20 %乙醇儲(chǔ)存待用。
[0031]二用親和分離材料純化糜蛋白酶原
[0032]選取新鮮冷凍的牛胰臟50g，將脂肪、結(jié)締組織除去，絞碎成勻漿狀，按固液比I: 2的比例加入冷凍的0.25M硫酸100mL，4°C攪拌提取lh，然后4°C靜置過夜。次日勻漿液9800rpm，4°C離心lOmin，過濾除脂，得牛胰臟提取液清液。在第一次離心后沉淀物中，加入等體積的冷硫酸再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，過0.45 μ m膜除去不溶物。將1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氨基苯磺酸-2,4,6-三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質(zhì)后，然后用1mL磷酸鹽(10mM，pH7，0.05M NaCl)洗去非特異性吸附的雜蛋白，再用1mL磷酸緩沖液(10mM，pH7，0.5MNaCl)洗脫，收集洗脫組分。用15%的變性還原SDS-PAGE檢測糜蛋白酶原的純度。洗脫樣品調(diào)pH至7.6，按(I: 10) (L:mg)比例加入胰蛋白酶，4°C條件下放置24-48h，然后2010版《中華人民共和國藥典》第二部糜蛋白酶活性測定方法測定糜蛋白酶活性為1800U/mg。
[0033]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1 說明，1:Marker 從上之下分子量依次為 116KD, 66.2KD, 45KD, 35KD, 25KD,18.4KD, 14.4KD ；2:牛胰提取液;3_6:流穿液(pH7，1mM PB緩沖體系)；7:洗雜液(1mM,ρΗ7，0.05Μ NaCl緩沖液體系)；8:洗脫液(1mM, ρΗ7，0.5Μ NaCl緩沖液體系。
[0035]實(shí)施例2:
[0036]一分離材料制備
[0037]取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O: 1,1: 3,1: 1,3: 1,1: O)洗滌，得到1-氨基-Sepharose-3, 5_ 二氯-2,4,6_ 三氮嗪。
[0038]稱取L-纈氨酸(3?5g)用去離子水溶解，與介質(zhì)1-氨基-S印harose-3，5_ 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50°C中攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-纈氨酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20 %乙醇儲(chǔ)存待用。
[0039]取介質(zhì)1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氯-2,4,6-三氮嗪(30mL),并稱取對氨基苯磺酸(3?5g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7,倒入反應(yīng)器與介質(zhì)1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混勻,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下攪拌反應(yīng)60小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3倍體積的二甲亞砜洗滌，然后用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-纈氨酸-5-氨基苯磺酸_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20 %乙醇儲(chǔ)存待用。
[0040]二用親和分離材料純化糜蛋白酶原
[0041]選取新鮮冷凍的羊胰臟50g，將脂肪、結(jié)締組織除去，絞碎成勻漿狀，按固液比I: 2的比例加入冷凍好的0.25M硫酸100mL，4°C攪拌提取lh，于4°C靜置過夜。次日勻漿液9800rpm，4°C離心lOmin，過濾除脂，得羊胰臟提取液清液。第一次離心后沉淀物中，加入等體積的冷硫酸再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，過0.45 μ m膜除去不溶物。將1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸_5_氨基苯磺酸_2，4,6_三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。依次用磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7)平衡5-10CV，上樣5mL(樣品的pH及電導(dǎo)與磷酸鹽緩沖液一致)，再用磷酸鹽緩沖液(10M，pH7)洗至280nm光吸收至基線，然后用磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7，0.05M NaCl)洗雜，至280nm光吸收至基線。磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7，lM NaCl)洗脫結(jié)合的糜蛋白酶原，收集洗脫峰。用15%的變性還原SDS-PAGE檢測糜蛋白酶原的純度。洗脫樣品調(diào)PH至7.6，按(I: 10) (L:mg)比例加入胰蛋白酶，4°C條件下放置24-48h，然后2010版《中華人民共和國藥典》第二部糜蛋白酶活性測定方法測定糜蛋白酶活性為1100U/mg
[0042]實(shí)施例三:
[0043]選取新鮮冷凍的牛胰臟50g，將脂肪、結(jié)締組織除去，絞碎成勻漿狀，按固液比1: 2的比例加入冷凍好的0.25M硫酸100mL，4°C攪拌提取lh，于4°C靜置過夜。次日勻漿液9800rpm，4°C離心lOmin，過濾除脂，得牛胰臟提取液清液。第一次離心后沉淀物中，加入等體積的冷硫酸再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，過0.45 μ m膜除去不溶物。將1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸_5_氨基苯磺酸-2,4,6-三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。依次用磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6)平衡5-10CV，然后上樣5mL(樣品的pH及電導(dǎo)與磷酸鹽緩沖液一致)，然后依次用磷酸鹽緩沖液(lOmM，pH6)，磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6，0.05M NaCl)洗至280nm光吸收至基線。磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6，lM NaCl)洗脫結(jié)合的糜蛋白酶原，收集洗脫峰。用15%的變性還原SDS-PAGE檢測糜蛋白酶原的純度。洗脫樣品調(diào)pH至7.6，按(I: 10) (L:mg)比例加入胰蛋白酶，4°C條件下放置24_48h，然后2010版《中華人民共和國藥典》第二部糜蛋白酶活性測定方法測定糜蛋白酶活性為1000U/mg。
【權(quán)利要求】
1.一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)仿生親和分離材料結(jié)構(gòu)是在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上通過三氮嗪骨架作為間臂固定卜纈氨酸及對氨基苯磺酸； (2)用制備的仿生親和分離材料純化胰臟提取液上清； (3)用胰蛋白酶進(jìn)行糜蛋白酶原的激活，得到糜蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，步驟(1)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和IV-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附糜蛋白酶原的條件為為1)116-8，離子強(qiáng)度為0.0-0.3的緩沖液；洗脫條件為1^6-8，離子強(qiáng)度為0.5-11的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，在步驟⑶中，胰蛋白酶激活糜蛋白酶酶原的條件為邱7.6，按照(1: 10)仏:呢)比例加入胰蛋白酶，4。〇，激活24-481
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪，其合成的配體中含有纈氨酸的結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪，其合成的配體中含有對氨基苯磺酸的結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，所述的糜蛋白酶原，其原料來源為哺乳動(dòng)物胰臟。
【文檔編號(hào)】C12N9/76GK104419695SQ201310369661
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】李榮秀, 馬貴軍, 翟東改, 陽成成 申請人:上海亨臻實(shí)業(yè)有限公司