一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒。該抗性表達(dá)盒含有精簡后的潮霉素抗性基因（SEQ?ID?NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因兩端的dif1和dif2序列。本發(fā)明精簡后的Hyg基因序列由原來的1.7kb縮短至1kb左右，去掉了轉(zhuǎn)錄終止子，較長的天然啟動(dòng)子等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，便于PCR擴(kuò)增，內(nèi)部酶切位點(diǎn)更少（常見酶切位點(diǎn)已被定點(diǎn)突變掉），同時(shí)，Hyg自帶短的人工啟動(dòng)子，在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達(dá)，定向插入時(shí)不影響下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本發(fā)明的抗性表達(dá)盒在精簡后的Hyg基因兩端添加了dif序列，可以在分枝桿菌中自動(dòng)解離。Hyg基因丟失后，被破壞的基因仍可繼續(xù)表達(dá)縮短的小肽，不影響下游基因的翻譯，從而可有效避免極性效應(yīng)。
【專利說明】一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Mtb是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病，其診斷，預(yù)防和治療研究進(jìn)展緩慢。這3個(gè)方面均涉及到研究Mtb基因的功能，而對Mtb進(jìn)行遺傳改造在Mtb的研究中起著舉足輕重的作用。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，難于對其進(jìn)行遺傳操作，需要昂貴的帶負(fù)壓的3級生物安全實(shí)驗(yàn)室，長時(shí)間培養(yǎng)不僅占用空間而且容易污染等等使結(jié)核分枝桿菌的研究耗時(shí)耗財(cái)耗力。以抗Mtb藥物的研發(fā)為例，抗Mtb藥物的研發(fā)昂貴且周期長。近半個(gè)世紀(jì)以來，直到2012年底剛剛有一種新作用機(jī)制的藥物問世，且具有潛在的毒力。目前研究抗Mtb藥物/疫苗最核心的問題之一就是建立有效，快速和廉價(jià)的基因工程菌。
[0003]目前在對分枝桿菌進(jìn)行基因操作的過程中，僅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比較有效。因此，進(jìn)行分枝桿菌突變株的研究時(shí)，如果所用菌株具有抗性基因，這會對以后的遺傳操作帶來不便。例如，基因敲除/遺傳互補(bǔ)至少需2種抗性基因；遺傳重組技術(shù)(recombineering)也需要2種抗性基因等。同時(shí)，在分枝桿菌中，有時(shí)需要表達(dá)多種抗原蛋白，需要多次遺傳操作，因 此，產(chǎn)生無抗性重組菌株對后續(xù)操作尤為重要?？衫没蚯贸夹g(shù)用抗性基因?qū)谢蛱鎿Q，但是基因敲除時(shí)還常常用到噬菌體包裝技術(shù)。該技術(shù)需要將靶基因上游序列+抗性基因+靶基因下游序列(簡稱三片段)一起包裝到噬菌體中，形成噬粒。三片段總長度有一定的限制，如果過長，將不能被包裝到噬菌體，無法獲得用于基因敲除的噬粒。由于包裝有容量有限制，如果抗性基因短小，則可以適當(dāng)增加靶基因上游序列+靶基因下游序列的長度，甚至可以加入其它元件，因此，有利于適當(dāng)增加噬菌體包裝的有效DNA片段長度?；蚯贸螅钣行У臋z測方法之一是進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然而，以往的//漢基因具有的轉(zhuǎn)錄終止子具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)使PCR很難進(jìn)行。有發(fā)明將Zfes等序列加到Hyg兩側(cè)，而Res等序列需要人工表達(dá)一種外源蛋白來識別并作用后才可將?解離。即實(shí)際操作中，先將帶的序列的質(zhì)粒導(dǎo)入分枝桿菌,等篩選到序列插入基因組后的分枝桿菌，再導(dǎo)入另外一個(gè)可以表達(dá)解離蛋白的質(zhì)粒，再經(jīng)過篩選，可以得到?丟失的分枝桿菌。許多實(shí)驗(yàn)往往還需要繼續(xù)篩選表達(dá)解離蛋白的質(zhì)粒丟失的菌株。因此，非常繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。有些類似的系統(tǒng)在分枝桿菌中抗性基因丟失的效率極低。dif序列加到Hyg兩側(cè)便于?基因的解離，最近幾年才見報(bào)道。其優(yōu)勢在于，不需要人工表達(dá)外源蛋白來實(shí)現(xiàn)抗性基因的解離，因?yàn)榉种U菌本身就編碼這樣的蛋白，因此，省去了很多不必要的麻煩。而且該系統(tǒng)的效率非常高，兼容性好(例如，慢速生長的結(jié)核分枝桿菌的i/i/序列在快速生長的恥垢分枝桿菌中同樣起作用)。然而，在采用i/i/序列體系的研究中，其所用?抗性基因，片段長(1.7kb)，帶有復(fù)雜的3’端2級結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有常見的酶切位點(diǎn)，兩端可用酶切位點(diǎn)少，且構(gòu)建的抗性表達(dá)盒不能夠“通用”。[0004]所以，如果能夠構(gòu)建在分枝桿菌中帶有自動(dòng)解離功能的更短小、易于遺傳操作的帶有多克隆位點(diǎn)的通用抗性表達(dá)盒，且可以不產(chǎn)生極性效應(yīng)，將會極大簡化多種分枝桿菌的遺傳操作。在進(jìn)行分枝桿菌遺傳操作時(shí)候，因?yàn)槔每剐员磉_(dá)盒帶入的抗性基因可自動(dòng)解離，所以后續(xù)的遺傳操作時(shí)將不會受到抗性基因選擇的限制，而且，不帶抗性基因的突變株也使得多種遺傳研究更為可能，將為分枝桿菌的基因工程研究提供強(qiáng)有力的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種經(jīng)精簡且自帶人工啟動(dòng)子的潮霉素抗性基因Hyg0
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的重組質(zhì)粒。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種精簡改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒，其含有精簡改造后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因兩端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精簡改造后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，difl和dif2序列分別如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。在此將該抗性表達(dá)盒命名為抗性表達(dá)
合”
[0010]優(yōu)選的，所述抗性表達(dá)盒兩端還添加了多重酶切位點(diǎn)。
[0011]所述抗性表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示。
[0012]含有以上所述抗性表達(dá)盒的重組質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0013]一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的重組質(zhì)粒，其含有:啟動(dòng)子、噬菌體整合位點(diǎn)、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達(dá)盒、復(fù)制起始位點(diǎn)。
[0014]按順時(shí)針方向，噬菌體整合位點(diǎn)、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達(dá)盒依次連
接在一起。
[0015]所述啟動(dòng)子為LacZ啟動(dòng)子或BLA啟動(dòng)子,所述復(fù)制起始位點(diǎn)為大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。
[0016]優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒的的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明精簡后的場叉基因序列由原來的1.7kb縮短至Ikb左右，去掉了轉(zhuǎn)錄終止子，較長的天然啟動(dòng)子等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，便于PCR擴(kuò)增，內(nèi)部酶切位點(diǎn)更少(常見酶切位點(diǎn)已被定點(diǎn)突變掉)，同時(shí)，Hyg自帶短的人工啟動(dòng)子,在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達(dá),定向插入時(shí)不影響下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0018]( 2 )本發(fā)明的抗性表達(dá)盒在精簡后的Hyg基因兩端添加了 dif序列，可以在分枝桿菌中自動(dòng)解離。?基因丟失后，被破壞的基因仍可繼續(xù)表達(dá)縮短的小肽，不影響下游基因的翻譯，從而可有效避免極性效應(yīng)。[0019](3)本發(fā)明的抗性表達(dá)盒兩端還添加了多重酶切位點(diǎn)，使得該表達(dá)盒既可以插入到特定序列中，還便于在其兩側(cè)定向添加其他序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為質(zhì)粒pU⑶HmKE的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為質(zhì)粒pUCDHmKE酶切位點(diǎn)圖；
圖3為質(zhì)粒pU⑶HmKE的構(gòu)建流程圖；
圖4為整合型質(zhì)粒pMH94DHmKE的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5為整合型質(zhì)粒pMH94DHmKE的構(gòu)建流程圖；
圖6為整合質(zhì)粒pblDHCiGn的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖7為質(zhì)粒pblDHCiGn的構(gòu)建流程圖；
圖8為dif-Ω HYG-?Τ表達(dá)盒與以往在分枝桿菌遺傳操作中常用的含有潮霉素(HYG)抗性基因0--")的片段的比較簡圖(Pl，P2，P3:假定的Hyg啟動(dòng)子；Pa:假定的場叉人工啟動(dòng)子，它覆蓋了表達(dá)盒中的?/i/V，常用的酶切位點(diǎn):El，EcoRI (在我們的
dif-Ω WLQ-dif 表達(dá)盒中被去除了)，Nt，AfoiI ；Sp,SpeIE5, BcoRY ；M,NdeI ；H,
NindlII ；Χο,Ι?οΙ ；C,ClaI ；Xb,IbaI 各，Smal ；Nc, AfcoI ；P,PstI ；Nh, Me1-,Y,, KpnO ；
圖 9 為存在于 pUCDHmke 質(zhì)粒中的歷.ζ?(1ΠΙ-ΖΑοΙ-1-歷/?dllI 在 i/i/正鏈(A)
和負(fù)鏈(B)中的序列及其對應(yīng)表達(dá)的多肽的分析(它們是表達(dá)盒Vl解離后留在基因組中的序列.Spel-Bamm-Eco-N-Eco認(rèn)\-Nde\-mndl\\-Xho\-dif-Xho\-mnAIll-Ncol-Pstl-Nhel (存在于pblDHCln中)在i/i/負(fù)鏈中的序列及其對應(yīng)表達(dá)的多肽的分析(C)，這是Jif-QHYG-Ji/表達(dá)盒V2解離后留在基因組中的序列，由三種讀碼框編碼的氨基酸用藍(lán)色的大寫字母表示，劃線部分表示在可讀通的讀碼框中的dif序列編碼的氨基酸，星號(*)表示終止子)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0022]以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
`[0023]以下實(shí)施例中PCR反應(yīng)所用的pfu酶、dNTP以及相關(guān)試劑均購買自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素購自羅氏公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5a購買于廣州東盛生物科技有限公司，貨號為C1042 ;DNA連接反應(yīng)均采用Takara寶生物公司的T4 DNA連接試劑盒，型號:D6020A ;質(zhì)粒DNA提取試劑盒(BSC01M1)、DNA回收試劑盒(BSC02M1)、PCR純化試劑盒(BSC03M1)購自博日生物公司。
[0024]以下實(shí)施例中所用到的PCR引物和DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。
[0025]實(shí)施例1構(gòu)建質(zhì)粒pU⑶HmKE
質(zhì)粒PU⑶HmKE的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，酶切位點(diǎn)圖見圖2，其含有上述的抗性表達(dá)盒。由圖1可見，質(zhì)粒PUCDHmKE按順時(shí)針方向依次含有:大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(pMBl0ri,?Τ-ΩΗΥ6-?Τ抗性表達(dá)盒，啟動(dòng)子P (BLA)(用于啟動(dòng)氨芐青霉素抗性基因Amp即WaA氨芐青霉素抗性基因辦?/7可用于質(zhì)粒篩選。
[0026]所述dif- Ω HYG-?Τ抗性表達(dá)盒上含有精簡改造后的潮霉素抗性基因Qfyg、,如SEQ ID N0:1所述，該基因上的第24~73bp為啟動(dòng)子序列(Pr)，用于啟動(dòng)場?基因的表達(dá)。
?基因序列兩端連接的必了序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0027]另外在dif-amG-dif抗性表達(dá)盒的兩端分別依次連接歷fldIII酶切位點(diǎn)UXoI酶切位點(diǎn)、油al酶切位點(diǎn)，此3個(gè)酶切位點(diǎn)可用來切下質(zhì)粒上的dif-QmG-dif抗性表達(dá)盒。
[0028]質(zhì)粒pU⑶HmKE的構(gòu)建流程圖見圖3，本流程中將使用到質(zhì)粒pNBVl (由美國約翰霍普金斯大學(xué)William Bishai實(shí)驗(yàn)室惠贈，質(zhì)粒圖譜見圖3，具體構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)I。質(zhì)粒pNBVl中含有原始潮霉素抗性基因(場叉*)，約長1.7kb。
[0029]具體方法如下:
1.質(zhì)粒pUCDis的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶治7/?1和歷‘/ III消化質(zhì)粒pUC19 (商品質(zhì)粒)，純化回收試劑盒回收
2.6kb的片段；
合成DNA片段?/i/V和dif2 (如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，由上海捷瑞生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成)，合成的?/i/V兩端帶有III和油<31酶切位點(diǎn)，i/i/J?兩端帶有油<31和命/?1酶切位點(diǎn)，所以，將difl和dif2以及純化回收后的質(zhì)粒pUC19 (Kpnl和Hindlll雙酶切)進(jìn)行三片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質(zhì)粒PU⑶is。
[0030]2.質(zhì)粒 pUCDHmKE 的構(gòu)建
擴(kuò)增片段場叉:本步驟以質(zhì)粒PNBVl為模板，用引物Hygf2 (5’ -TGTCTAGACCGGCCGTGCGGAATTAA-3，)(SEQ ID NO: 9)和 Hygr727(5，-ATTCTAGATCAGGCGCCGGGGGCGGTGTC-3’)(SEQ ID NO: 10)進(jìn)行擴(kuò)增。這對引物可從質(zhì)粒pNBVl中擴(kuò)增出約1.1kb的射片段，比原來的1.7kb明顯精簡了，且精簡后的?基因依然可以表達(dá)并行使抗性基因的作用，其效率與原始質(zhì)粒中H-基因表達(dá)抗性的效率相當(dāng)。
[0031]擴(kuò)增所得片段的兩端帶有酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增獲得的片段用消化，獲得 ?片段切)，大小約為1.lkb。
[0032]將上一步中構(gòu)建的質(zhì)粒pU⑶is用ZhI消化，將以上酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收4.0kb片段，即為pUCDI片段C?al切)。
[0033]將pUCDI片段C?al切)和Hyg片段C?al切)進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，利用含潮霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質(zhì)粒PUCDH。將此質(zhì)粒中的位點(diǎn)和
位點(diǎn)進(jìn)行突變，去除掉這2個(gè)酶切位點(diǎn)，即得質(zhì)粒pU⑶HmKE，其序列如SEQ ID NO: 2所示，其第426bp~1553bp為長1128bp的dif- Ω HYG-?Τ抗性表達(dá)盒，抗性表達(dá)盒兩端為HindIII酶切位點(diǎn)aagctt和ZAoI酶切位點(diǎn)ctcgag。dif- Ω WYG-dif抗性表達(dá)盒中所含有的場?片段如SEQ ID N0:1所示。該?片段去掉了轉(zhuǎn)錄終止子，較長的天然啟動(dòng)子等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，便于PCR擴(kuò)增，內(nèi)部酶切位點(diǎn)更少(常見酶切位點(diǎn)已被定點(diǎn)突變掉)，同時(shí)，場Y自帶短的人工啟動(dòng)子，在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達(dá)，定向插入時(shí)不影響下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0034]實(shí)施例2整合型質(zhì)粒pMH94DHmKE的構(gòu)建及應(yīng)用
整合型質(zhì)粒pMH94DHmKE的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4，質(zhì)粒pMH94DHmKE按順時(shí)針方向依次含有=LacZ啟動(dòng)子(可用于藍(lán)白斑篩選，以及啟動(dòng)后面整個(gè)質(zhì)粒骨架的表達(dá))、噬菌體整合位點(diǎn)a?W、整合酶基因(可表達(dá)出整合酶，使質(zhì)粒通過aii/M立點(diǎn)整合入分枝桿菌基因組)，dif- Ω YiYG-dif抗性表達(dá)盒,大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(orii?)，氨節(jié)青霉素抗性基因辦?/?(用于質(zhì)粒篩選)。dif-QmG-dif抗性表達(dá)盒兩端分別依次連接VifldIII酶切位點(diǎn)、通ol酶切位點(diǎn)，可用于切下質(zhì)粒上的?///-ΩΗΥ6-ο?/抗性表達(dá)盒。
[0035]整合型質(zhì)粒pMH94DHmKE的構(gòu)建流程見圖5，本構(gòu)建流程中所用到的質(zhì)粒pMH94由由美國約翰霍普金斯大學(xué)William Bishai實(shí)驗(yàn)室惠贈，質(zhì)粒圖譜見圖5，具體構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)2。
[0036]具體操作如下:
1.將質(zhì)粒PMH94與實(shí)施例1構(gòu)建的質(zhì)粒pUCDHmKE用HindiII消化，回收pMH94消化所得的大小約為6.0 kb的片段、pUCDHmKE消化所得的大小約為1.1 kb的片段，將兩個(gè)片段進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含潮霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質(zhì)粒 pMH94DHmKE。
[0037]2.將質(zhì)粒pMH94DHmKE通過電轉(zhuǎn)化的方法將其分別轉(zhuǎn)入結(jié)核分枝桿菌(H37Rv結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株，由廣州市胸科醫(yī)院惠贈)和恥垢分枝桿菌(ATCC 700044)，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化株。
[0038]將所得轉(zhuǎn)化株于37°C孵箱中孵育12小時(shí)，充分復(fù)活細(xì)菌并使其抗性表達(dá)。用帶濾芯的槍尖吹吸混勻后，分裝至小管中，10000 rpm離心I分鐘沉淀轉(zhuǎn)化菌，棄上清，用0.6 mL7H9培養(yǎng)基重懸后，以500 μ?/板鋪于7Η11含相應(yīng)抗生素(150 μ g/mL HYG)培養(yǎng)板中。同時(shí)稀釋一百倍后，500 KL/板鋪板。避光于37度孵箱培養(yǎng)。
[0039]在含有潮霉素(HYG)的平板上可獲得含有pMH94DHmKE質(zhì)粒的結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌，此步證明了本發(fā)明的dif- Ω HYG-ο?/抗性表達(dá)盒可成功在分枝桿菌中表達(dá)。
[0040]將獲得的帶有pMH94DHmKE質(zhì)粒的結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)化株進(jìn)行液體傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)3天后(對于恥垢分枝桿菌)或14天后(對于結(jié)核分枝桿菌)，將培養(yǎng)的菌液進(jìn)行稀釋后鋪平板，所得的平板上約有80%的菌落丟失了 Hyg抗性，即無法在含有潮霉素(HYG)的平板上生長,此步證明了本專利中的ο?/-ΩΗΥ6-ο?/抗性表達(dá)盒可成功在分枝桿菌中自動(dòng)解離，且有較高的效率。
[0041]實(shí)施例3整合質(zhì)粒pblDHCiGn的構(gòu)建及其應(yīng)用
整合質(zhì)粒pblDHCiGn中，抗性表達(dá)盒以兩側(cè)帶有雙酶切位點(diǎn)的形式存在，此質(zhì)粒的構(gòu)建是為了證明在此種形式下，抗性表達(dá)盒依然有效。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖6，按順時(shí)針方向，其依次含有:啟動(dòng)子P(BLA)(用于啟動(dòng)后面辦的表達(dá))、氨芐青霉素抗性基因辦 (可用于質(zhì)粒篩選)、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、噬菌體整合位、整合酶基因Int (可表達(dá)出整合酶，使質(zhì)粒通過ai#位點(diǎn)整合入分枝桿菌基因組)、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達(dá)盒、增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因effP。dif-QmG-dif抗性表達(dá)盒兩端連接不同的酶切位點(diǎn)。[0042]質(zhì)粒pblDHCiGn的構(gòu)建流程見圖7，該流程中所用到的質(zhì)粒pblueINT由美國約翰霍普金斯大學(xué)，Eric Nuermberger教授惠贈,其質(zhì)粒圖譜見圖7,具體構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)3，序列如SEQ ID NO:3所示。
[0043]具體構(gòu)建步驟如下:
1.構(gòu)建質(zhì)粒pblDHCln:用限制性內(nèi)切酶治7/?1和feMlI消化質(zhì)粒pblueINT，回收2.9kb 的功能片段 A ；以質(zhì)粒 pUCDHmKE 為模板，用引物 Hygcf (5’-GCTGGTACCGCTAGCGCTGCAGCCATGGCAAGCTTCTCGAGTAAG-3’)(SEQ ID NO:11)和Hygcr (5’-GCAGGATCCGATATCGAATTCCATATGCCCAAGCTTCTCGAGACT-3’ ) (SEQ ID NO: 12)擴(kuò)增出 1.2 kb 的 ?/i/-Ω HYG-1/i/ 片段(兩端分別帶有治奶1和酶切位點(diǎn))，再經(jīng)過酶切后，與功能片段A進(jìn)行連接，得到4.1kb的質(zhì)粒 pblDHCln。
[0044]2.構(gòu)建質(zhì)粒pblDHCGn:用限制性內(nèi)切酶AfcoI和命/?1消化質(zhì)粒pblDHCln，回收4.1kb的功能片段B ;以質(zhì)粒pEGFP-Nl (商品質(zhì)粒)為模板，用引物GYF_f(5，-GGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，)(SEQ ID NO:13)和 GYF-r(5，_ GCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’)(SEQ ID NO: 14)擴(kuò)增出 734 bp 的片段，經(jīng)過酶切后，與功能片段B進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pblDHCGn。
[0045]3.構(gòu)建質(zhì)粒pblDHCiGn:用限制性內(nèi)切酶SpeI和EcoRI消化質(zhì)粒pblDHCGn，回收4.7kb的功能片段C ;用限制性內(nèi)切酶尬a I和&0RI消化質(zhì)粒pblueINT，回收2.1kb的
片段，與功能片段C進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pblDHCiGn，其序列如SEQ ID NO:4所示。
[0046]將構(gòu)建得到的質(zhì)粒pblDHCiGn通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化入結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌中，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子可以觀察到eGFP的表達(dá)。由此證明了在dif-QmQ-dif抗性表達(dá)盒兩端添加了雙酶切位點(diǎn)后，Hyg的啟動(dòng)子不僅可以啟動(dòng)場?抗性基因的表達(dá)，而且可以實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)?抗性基因下游Λ./序列+酶切位點(diǎn)及其后面的基因的表達(dá)，此處綠色熒光蛋作為指示標(biāo)記。
[0047]下一步，將獲得的帶有pblDHCiGn質(zhì)粒的結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)化株進(jìn)行液體傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)3天后(對于恥垢分枝桿菌)或14天后(對于結(jié)核分枝桿菌)，將培養(yǎng)的菌液進(jìn)行稀釋后鋪平板，所得的平板上約有80%的菌落丟失了 HYG抗性，即無法在含有潮霉素(HYG)的平板上生長，由此再次證明了本發(fā)明的Jif-QHYG-Ji/抗性表達(dá)盒可成功在分枝桿菌中自動(dòng)解離，且有較高的效率。而且，丟失了 HYG抗性的轉(zhuǎn)化子依然可以觀察到綠色熒光，此設(shè)計(jì)說明了抗性表達(dá)盒的自動(dòng)解離不會對其插入后下游基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，即本發(fā)明所設(shè)計(jì)的抗性表達(dá)盒無論存在與否均不影響下游基因的表達(dá)。
[0048]參考文獻(xiàn):
[1]Howard NS, Gomez JE, Ko C，Bishai WR.Color selection with ahygromycin-resistance-based escherichia col1-mycobacterial shuttle vector.Gene 1995;166:181-182.[2]Lee MH, Pascopella L, Jacobs WR, Jr., Hatfull GF.Site-specificintegration of mycobacteriophage 15:1ntegration-proficient vectorsfor mycobacterium smegmatis, mycobacterium tuberculosis, and bacillecalmette-guerin.Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:3111-3115.[3]Zhang T, Li SY, Nuermberger EL.Autoluminescent Mycobacteriumtuberculosis for Rapid, Real-Time, Non-1nvasive Assessment of Drug and Vaccine
Efficacy.PLoS ONE.(2012)，7(1): e29774。
【權(quán)利要求】
1.一種精簡改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的抗性表達(dá)盒，含有精簡后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因兩端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精簡后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，?/i/V和序列分別如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗性表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒兩段還添加了多重酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗性表達(dá)盒，其特征在于，所述抗性表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所示。
5.含有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述抗性表達(dá)盒的重組質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
7.一種用于高效構(gòu)建無抗性標(biāo)記重組分枝桿菌的重組質(zhì)粒，其含有:啟動(dòng)子、噬菌體整合位點(diǎn)、整合酶基 因、權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的抗性表達(dá)盒、復(fù)制起始位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，按順時(shí)針方向，依次含有噬菌體整合位點(diǎn)、整合酶基因、權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的抗性表達(dá)盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述啟動(dòng)子為LacZ啟動(dòng)子或BLA啟動(dòng)子，所述復(fù)制起始位點(diǎn)為大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103451181SQ201310386264
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】張?zhí)煊? 楊峰, 鄒文英 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院