一種具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種富硒稻米副產(chǎn)品加工領(lǐng)域，特別涉及一種具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制備方法。該方法利用富硒大米加工副產(chǎn)物碎米，通過研磨、過篩、脫脂，制成脫脂富硒米粉，用氫氧化鈉溶液堿提離心后，收集上清液，用稀鹽酸溶液酸沉，離心后取沉淀水洗后凍干。所得大米蛋白用胰蛋白酶酶解后凍干，獲得即得硒含量為0.3～0.4mg/kg的大米酶解肽。在細胞免疫功能實驗中，大米酶解硒多肽具有良好的促進巨噬細胞增殖和吞噬中性紅的能力。本發(fā)明的大米硒多肽，營養(yǎng)成分天然，富含微量元素硒，適合用于提高機體免疫功能的食品輔料、營養(yǎng)強化劑或保健食品，制備方法簡單、可靠。
【專利說明】一種具有免疫活性的大米酶解砸多肽的制備方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種富硒稻米副產(chǎn)品加工領(lǐng)域，特別涉及一種具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制備方法，屬于功能性食品加工領(lǐng)域。
二、【背景技術(shù)】
[0002]硒是一種人類和動物必需的微量營養(yǎng)元素，已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點。近年來，一些學者發(fā)現(xiàn)硒對腫瘤生長有一定的抑制作用，且硒缺乏與某些疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究表明，硒亦是某些參與細胞抗氧化作用的含硒酶的活性中心，如谷胱甘肽過氧化物酶、氧化還原酶等。大米中的硒大多以蛋白硒結(jié)合形式存在，有學者通過硒的形態(tài)分析研究，發(fā)現(xiàn)富砸大米中砸王要以砸代甲硫氣fe (SeMet)形式存在。SeMet作為砸在生命體系中的王要存在形式具有很高的生物活性，且SeMet具有高于亞硒酸鈉一倍的生物利用率。
[0003]堿法提取和酶法制備等方法己被公認為較為適用的提取大米蛋白的方法，其中，堿法提取是蛋白質(zhì)提取方法中最常見的一種。通過這種方法可將超過80%的大米蛋白提取出來，其原理主要是用稀堿溶液將不溶于水的大米蛋白溶解并隨后用酸溶液使之在等電點沉淀。堿法提取是著眼于破壞大米谷蛋白中氫鍵、酰胺鍵、疏水相互作用等，使得蛋白質(zhì)分子量減小并提高蛋白提取率。近來有報道稱這種提取方法提高了大米蛋白體外和體內(nèi)的可消化度，這和對蛋白質(zhì)主體結(jié)構(gòu)、氨基酸組成的修飾作用有關(guān)。
[0004]大米蛋白經(jīng)過酶解后所生成的氨基酸殘基或小分子肽不論是體內(nèi)活性還是體外活性都要顯著高于未酶解的大米蛋白，很多研究都利用體外酶解來獲取更具活性的蛋白。體外酶解具有條件溫和、不破壞營養(yǎng)成分等優(yōu)點，且特定蛋白酶對大米蛋白中肽鏈的降解作用可產(chǎn)生多種具有抗氧化活性或免疫活性的肽。大米蛋白生物活性相關(guān)的研究數(shù)據(jù)并不多，但已有的分析研究卻足以證實，大米蛋白酶解物具有抗氧化、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫作用等特點。谷物肽免疫活性測定方法亦可分為體內(nèi)測定和體外測定兩種，體外測定方法有:脾細胞增殖能力測定、巨噬細胞吞噬能力測定等，體內(nèi)免疫活性測定方法則包括抗體生成細胞含量測定、血清中溶血素HC50值測定等，有學者甚至研究了谷物肽對人體免疫系統(tǒng)的影響。
[0005]富硒碎米作為富硒大米副產(chǎn)物，未能得到充分利用，造成資源浪費，因此，提取富硒碎米含硒蛋白、制備具有免疫活性的硒多肽更利于富硒大米的綜合利用。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制備方法，有效利用了富硒稻米加工的副產(chǎn)品——富硒碎米，可用于食品輔料或營養(yǎng)強化劑。
[0008]技術(shù)方案
[0009]本發(fā)明的制備一種具有免疫活性的大米酶解多肽的制備方法是通過以下步驟實現(xiàn)的:[0010](I)原料預處理:取新鮮富硒碎米，研磨，過100目篩；
[0011](2)脫脂:用正己燒，料液比為1: 3~1: 6，在磁力攪拌器(79-1，常州國華電器有限公司)上脫脂兩次，每次4h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜；
[0012](3)堿提:用濃度為0.05mol/L~0.07mol/L的NaOH溶液，料液比1: 10~I: 20，溫度35~45°C，時間2h~4h，堿提2次，離心，合并上清液；
[0013](4)酸沉:將所得蛋白質(zhì)水解液放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至等電點(4.5~5.0),待沉淀析出，再離心，水洗2次；
[0014](5)凍干:將上述所得蛋白質(zhì)用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干(FD-1C，西班牙Telstar公司)24小時，取出后裝入自封袋。
[0015](6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 8~1: 10，底物濃度50~70g/L，pH8.5~9.0，溫度40~50°C的條件下酶解2h~3h，離心收集上清液；
[0016](7)凍干:將上述所得酶解液用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0017]有益效果
[0018](I)本發(fā)明有效利用了富硒稻米加工副產(chǎn)品一富硒碎米，不僅避免浪費，而且制備出了具有免疫活性的大米硒多肽。
[0019](2)本發(fā)明制備所得大米硒多肽硒含量比普通大米蛋白酶解物的含量高，可用作營養(yǎng)輔料或營養(yǎng)強化劑，具有較高`的利用價值。表1為普通大米、富硒碎米原料、大米硒多肽硒含量。
[0020]表1大米及酶解肽的蛋白質(zhì)和硒含量
[0021]
普通大米產(chǎn)品富硒碎米產(chǎn)品
產(chǎn)品 -
原料蛋白酶解肽原料蛋白酶解硒肽
蛋白質(zhì)含量
(%)8.3%81.2%-85.6%8.2% 80.3%-83.3%
砸含量
(Λ、 0.05~0.06 0.09-0.13 0.09-0.10 0.35~0.40
(mg/kg)___
[0022](3)本發(fā)明制備所得大米硒多肽具有高于普通大米蛋白酶解物的免疫活性，具有較高的利用價值。在濃度10-100 μ g/mL范圍內(nèi)，大米硒多肽的巨噬細胞增殖率和巨噬細胞吞噬率均顯著高于普通大米蛋白酶解物(P < 0.05)。在100μ g/mL時，大米硒多肽的巨噬細胞增殖率和巨噬細胞吞噬率分別達到60%和76% (見圖1和圖2)。
四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明所得富硒大米硒多肽與普通大米酶解肽對巨噬細胞增殖率的影響對照圖；
[0024]圖2是本發(fā)明所得富硒大米硒多肽與普通大米酶解肽對巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響對照圖。
[0025]發(fā)明的【具體實施方式】[0026]實施例1
[0027](I)原料預處理:將同一批次富硒碎米用粉碎機研磨，之后過100目篩。[0028](2)脫脂:用正己烷，料液比為1: 5，在磁力攪拌器上脫脂兩次，每次3h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜。
[0029](3)堿提:將脫脂富硒大米粉用NaOH濃度為0.07mol/L，料液比1: 15，溫度40°C，時間3h，堿提2次，離心，合并上清液。
[0030](4)酸沉:將所得蛋白質(zhì)水解液放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至等電點(4.5)，待沉淀析出，再離心，水洗2次。
[0031](5)凍干:將上述所得蛋白質(zhì)用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0032](6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 8，底物濃度50g/L，pH9.0，溫度40°C的條件下酶解3h，離心收集上清液；
[0033](7)凍干:將上述所得酶解液用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0034]實施例2
[0035](I)原料預處理:將同一批次富硒碎米用粉碎機研磨，之后過100目篩。
[0036](2)脫脂:用正己烷，料液比為1: 6，在磁力攪拌器上脫脂兩次，每次4h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜。
[0037](3)堿提:將脫脂富硒大米粉用NaOH濃度為0.07mol/L，料液比1: 10，溫度40°C，時間4h，堿提2次，離心，合并上清液。
[0038](4)酸沉:將所得蛋白質(zhì)水解液放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至等電點(4.5)，待沉淀析出，再離心，水洗2次。
[0039](5)凍干:將上述所得蛋白質(zhì)用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0040](6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 9，底物濃度60g/L，pH9.0，溫度45°C的條件下酶解3h，離心收集上清液；
[0041](7)凍干:將上述所得酶解液用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0042]實施例3
[0043](I)原料預處理:將同一批次富硒碎米用粉碎機研磨，之后過100目篩。
[0044](2)脫脂:用正己烷，料液比為1: 5，在磁力攪拌器上脫脂兩次，每次3h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜。
[0045](3)堿提:將脫脂富硒大米粉用NaOH濃度為0.07mol/L，料液比1: 20，溫度40°C，時間4h，堿提2次，離心，合并上清液。
[0046](4)酸沉:將所得蛋白質(zhì)水解液放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至等電點(4.5)，待沉淀析出，再離心，水洗2次。
[0047](5)凍干:將上述所得蛋白質(zhì)用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20CC下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
[0048](6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 10，底物濃度60g/L，pH8.5，溫度50°C的條件下酶解3h，離心收集上清液；
[0049] (7)凍干:將上述所得酶解液用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在_20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
【權(quán)利要求】
1.一種具有免疫活性的大米酶解多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件: (1)原料預處理:取新鮮富硒碎米，研磨，過100目篩； ⑵脫脂:用正己燒，料液比為1: 3~1: 6，在磁力攪拌器(79-1，常州國華電器有限公司)上脫脂兩次，每次4h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜； (3)堿提:用濃度為0.05mol/L~0.07mol/L的NaOH溶液，料液比1: 10~1: 20，溫度35~45°C，時間2h~3h，堿提2次，離心，合并上清液； (4)酸沉:將所得蛋白質(zhì)水解液放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至等電點(4.5~5.0)，待沉淀析出，再離心,水洗2次； (5)凍干:將上述所得蛋白質(zhì)用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干(FD-1C，西班牙Telstar公司)24小時，取出后裝入自封袋； (6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 8~1: 10，底物濃度50~70g/L，pH8.5~9.0，溫度40~50°C的條件下酶解2h~3h，離心收集上清液； (7)凍干:將上述所得酶解液用培養(yǎng)皿裝好放入冰箱，在-20°C下預凍一夜，第二天放進冷凍干燥機凍干24小時，取出后裝入自封袋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米硒多肽制備方法，其特征在于(2)脫脂:用正己烷，料液比為1: 3~1: 6，在磁力攪拌器上脫脂兩次，每次4h，離心，將沉淀放在通風櫥中風干一夜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米硒多肽制備方法，其特征在于(3)堿提:將脫脂富硒大米粉用NaOH濃度為0.05~0.0711101/1，料液比1: 10~1: 20，溫度35~45°C，時間2~4h0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米硒多肽制備方法，其特征在于(6)酶解:將上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶與底物濃度比1: 8~1: 10，底物濃度50~70g/L，pH8.5~9.0，溫度40~50 °C的條件下酶解2h~3h。
【文檔編號】C12P21/06GK103497984SQ201310386081
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】方勇, 胡秋輝, 羅佩竹, 徐衛(wèi)東, 高德泉, 陳曦, 陳悅, 徐迅, 李友良, 邱偉芬, 楊文建, 馬寧, 鞠興榮 申請人:南京財經(jīng)大學, 江蘇雙兔食品股份有限公司