重組菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，特別設(shè)及重組菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心鄉(xiāng)氨酸化-￥曰1；[]16)，化學(xué)名稱為心〇-氨基異戊酸，分子式為〔5出1顯2，相對分子 質(zhì)量為117.15。呈白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味苦，在水中溶解度:25 °C為88.5g/L，50°C 為96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙酸，丙酬。等電點為5.96，烙點315°(：。
[0003] 心鄉(xiāng)氨酸化-Val)是人體八種必需氨基酸之一，又是Ξ種支鏈氨基酸（包括鄉(xiāng)氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸)之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地 位。可W廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等。
[0004] 醫(yī)藥工業(yè)中，可作氨基酸輸液、綜合氨基酸制劑的主要成分，可治療肝功能衰竭、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能素亂。如缺乏可引起神經(jīng)障礙、停止發(fā)育、體重下降、貧血等。
[0005] 食品工業(yè)中，可用作食品添加劑、營養(yǎng)增補液及風(fēng)味劑等。米制糕餅中添加鄉(xiāng)氨酸 (Ig/kg)，產(chǎn)品有芝麻香，用于面包亦能改善風(fēng)味。心鄉(xiāng)氨酸也可用作氨基酸能量飲料與運 動員飲料，有形成肌肉、強化肝功能、減輕肌肉疲勞等作用。
[0006] 飼料工業(yè)中，對動物的乳腺組織分泌乳汁有重要的促進作用。將其用于維雞飼料 中，可提高維雞對雞新城疫病毒的免疫能力。而且心鄉(xiāng)氨酸是動物飼料中的一種限制性氨 基酸，所鄉(xiāng)氨酸可作為飼料添加劑改善動物日糧中氨基酸含量的不足。
[0007] k鄉(xiāng)氨酸的生產(chǎn)方法有Ξ種:提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法。提取法和化學(xué) 合成法由于原料來源受限制、生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境，難W實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法 生產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是目前生產(chǎn)k 鄉(xiāng)氨酸最主要的方法。通過菌株的選育，W解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和阻遏，達到過量積 累心鄉(xiāng)氨酸的目的，是微生物發(fā)酵法工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的手段。
[000引棒桿菌是用于生產(chǎn)L-氨基酸的代表性微生物，特別是谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌（Corynebacterium pekinense)和黃色短桿 菌(Breviabacterium flavum)。為了改善運些微生物的1^-鄉(xiāng)氨酸生產(chǎn)能力，可W通過傳統(tǒng) 誘變和代謝工程等方法對生產(chǎn)菌株進行不斷地改造。
[0009] 傳統(tǒng)誘變育種，是指通過對特定出發(fā)菌株進行物理、化學(xué)或二者合并地誘變處理， 再選育出營養(yǎng)缺陷型和/或氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，W解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制 或阻遏作用，從而達到過量積累某種氨基酸的目的。
[0010] 代謝工程育種，就是在對代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上采用基因工程技術(shù)改造細胞 代謝系統(tǒng)W提高產(chǎn)物得率或改進細胞性能。主要包括如下手段:對原有代謝途徑的改造、新 代謝途徑的構(gòu)建、組學(xué)規(guī)模的代謝關(guān)鍵途徑或祀點的識別。通過理性的代謝工程構(gòu)建氨基 酸生產(chǎn)菌株，正逐漸成為氨基酸育種的主要策略。
[0011] 3-憐酸甘油醒脫氨酶是中屯、碳代謝途徑中設(shè)及的一個酶。在棒狀桿菌中，它W gapA的形式存在，WNAD作為輔酶，將3-憐酸甘油醒轉(zhuǎn)化為1，3-二憐酸甘油酸，而P泌基因編 碼的酶再將1，3-二憐酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-憐酸甘油酸。與之相反，在鏈球菌和芽抱桿菌中，它 W非憐酸化的NADP依賴型GADPH(非憐酸化的NADP依賴型3-憐酸甘油醒脫氨酶，下文中稱為 gapN)形式存在，其WNADP作為輔酶，將3-憐酸甘油醒轉(zhuǎn)化為3-憐酸甘油酸，并產(chǎn)生NADPH。 該過程是個單步的過程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影響。
[0012] 甘油醒3-憐酸脫氨酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，EC 1.2.1.9)是一種NADP+依賴型的氧化還原酶，它可逆地催化甘油醒3-憐酸反應(yīng)生成1，3二憐 酸甘油酸，如下所示：
[0013] glyceraldehyde 3-phosphate+phosphate+NADP^ = 3-phosph〇-glyceroy1 地os地ate+NADPH+H+
[0014] 來源于變形鏈球菌（streptococcus mutans)ATCC25175的甘油醒3-憐酸脫氨酶具 有良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。NADH和NADra是細胞內(nèi)重要的輔酶，參與糖、 月旨、蛋白質(zhì)Ξ類物質(zhì)代謝的絕大部分氧化還原反應(yīng)，NAD/NADH和NADP/NADPH分別是其對應(yīng) 的氧化還原對。
[0015] 將來源于變形鏈球菌的亮甘油醒3-憐酸脫氨酶編碼基因 gapN導(dǎo)入到棒桿菌或黃 桿菌中，其編碼產(chǎn)物可W將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，從而增加 NADPH的供應(yīng)，達到調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/ NADPH平衡的效果，轉(zhuǎn)化并表達的結(jié)果是使胞內(nèi)氧化還原平衡也相應(yīng)得到改變。
[0016] 此類相似的應(yīng)用，其他專利就是利用NADP依賴型3-憐酸甘油醒脫氨酶活性來達到 提高心賴氨酸產(chǎn)量棒狀桿菌屬菌株的方法。
[0017] 工程菌CGMCC 1.299自身的3-憐酸甘油醒脫氨酶WgapA的形式存在，WNAD作為輔 酶，將3-憐酸甘油醒轉(zhuǎn)化為1，3-二憐酸甘油酸，而P泌基因編碼的酶再將1，3-二憐酸甘油酸 轉(zhuǎn)化為3-憐酸甘油酸。此過程中產(chǎn)生的是NADH，而不能在鄉(xiāng)氨酸末端合成的四步反應(yīng)中應(yīng) 用，從而一方面造成NADH的大量積累，另一方面合成需要的NADK1又不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 有鑒于此，本發(fā)明提供重組菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)及分子改造棒桿菌 或短桿菌，并發(fā)酵生產(chǎn)k鄉(xiāng)氨酸的方法。具體地說，是將輔助因子為NADPH的甘油醒3-憐酸 脫氨酶gapN轉(zhuǎn)化導(dǎo)入棒桿菌或短桿菌中，從而獲得胞內(nèi)氧化還原平衡改變的基因工程菌。 該基因編碼的甘油醒3-憐酸脫氨酶可W將甘油醒3-憐酸轉(zhuǎn)化為1，3二憐酸甘油酸。該基因 工程菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸。
[0019] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0020] 本發(fā)明提供了重組菌株，由編碼gapN蛋白質(zhì)的gapN基因?qū)肷a(chǎn)k鄉(xiāng)氨酸的原始 菌株制得;所述原始菌株為棒桿菌或短桿菌。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株的所述原始菌株選自谷氨酸棒桿 菌(C.glutamicum)、北京棒桿菌(C.pekinense)和黃色短桿菌(B.f lavum)。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述生產(chǎn)k鄉(xiāng)氨酸的原始菌株 為保藏編號為CGMCC 1.299的谷氨酸棒桿菌。
[0023] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述編碼gapN蛋白質(zhì)的gapN基 因 W重組質(zhì)?；虿迦肴旧w的方式導(dǎo)入所述原始菌株。
[0024] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述編碼gapN蛋白質(zhì)的gapN基 因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1中自5'末端第1至1428位核巧酸所示。
[0025]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述重組質(zhì)粒的制備方法為將 所述gapN基因的核巧酸序列插入出發(fā)載體pXMJ 19的多克隆位點。
[00%]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述重組菌株的保藏編號為CGMCC No. 11938。 [0027]本發(fā)明還提供了所述重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)鄉(xiāng)氨酸中的應(yīng)用。
[00%]本發(fā)明還提供了所述重組菌株的構(gòu)建方法，將編碼gapN蛋白質(zhì)的gapN基因?qū)肷?產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸的原始菌株;所述原始菌株為棒桿菌或短桿菌。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸的方法，發(fā)酵菌株為所述重組菌株或所述 構(gòu)建方法構(gòu)建的重組菌株。
[0030] 本發(fā)明保護將目標基因 W重組質(zhì)?；虿迦肴旧w等方式導(dǎo)入棒桿菌或短桿菌得 到的工程菌株;所述重組質(zhì)粒為將gapN的基因序列插入出發(fā)載體陰MJ19的多克隆位點得到 的質(zhì)粒。所述棒桿菌的編號為CGMCC 1.299。所述甘油醒3-憐酸脫氨酶編碼的核巧酸序列如 SEQ ID No. 1中自5'末端第1至1428位核巧酸所示。
[0031] 用gapN，其WNADP為輔本科，將3-憐酸甘油醒轉(zhuǎn)化為3-憐酸甘油酸，并產(chǎn)生NADPH。 而NADPH是鄉(xiāng)氨酸末端合成必須的輔助因子，每合成一分子鄉(xiāng)氨酸需要二分子的NADPH。從 而同時解決NADH的過剩與NADPH的不足，達到兩者的平衡。
[0032] 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)k鄉(xiāng)氨酸實驗結(jié)果表明：出發(fā)菌株CGMCC 1.299的心鄉(xiāng)氨酸產(chǎn)量為 3.2g/L，而本發(fā)明的工程菌MHZ-1011的^鄉(xiāng)氨酸產(chǎn)量為6.5g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高 103%，與出發(fā)菌株相比，本發(fā)明提供的保藏編號為CGMCC No. 11938的重組菌株具有極顯著 差異(P<0.01)。
[0033] 5化罐發(fā)酵生產(chǎn)k鄉(xiāng)氨酸實驗結(jié)果表明：出發(fā)菌株CGMCC1.299的心鄉(xiāng)氨酸產(chǎn)量為 7.3g/L，而本發(fā)明的工程菌MHZ-1011的レ鄉(xiāng)氨酸產(chǎn)量為18.4g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高 152%，與出發(fā)菌株相比，本發(fā)明提供的保藏編號為CGMCC No. 11938的重組菌株具有極顯著 差異(P<0.01)。
[0034] 生物保藏說明
[0035] 生物材料Μ監(jiān)-1011分類命名：谷氨酸棒桿菌，〔〇巧1166日(3161'；[11111旨1111日111；[州1]1于2015 年12月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11938。
【附圖說明】
[0036] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0037] 圖1示陰MJ19-gapN質(zhì)粒圖譜。
【具體實施方式】
[0038] 本發(fā)明公開了重組菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容， 適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例 進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng) 用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0039] 本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸的工程菌株。
[0040] 本發(fā)明的另一目的是提供利用該工程菌株生產(chǎn)心鄉(xiāng)氨酸的方法。
[0041] 本發(fā)明保護將目標基因 W重組質(zhì)?；虿迦肴旧w等方式導(dǎo)入棒桿菌或短桿菌得 到的工程菌株;所述重組質(zhì)粒為將gapN的基因序列插入出發(fā)載體陰MJ19的多克隆位點得到 的質(zhì)粒。所述棒桿菌的編號為CGMCC 1.299。所述甘油醒3-憐酸脫氨酶編碼的核巧酸