紫紅曲霉yh-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲，用該菌株制備的酯化紅曲能促進曲酒中以己酸乙酯為主的四種酯的合成，縮短曲酒的發(fā)酵周期，提高曲酒的優(yōu)質品率。本發(fā)明的紫紅曲霉（Monascuspurpureus）YH-6菌株是從洋河酒廠股份有限公司自制的大曲中分離得到的，該菌株于2013年7月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號：CGMCC?No.7959。
【專利說明】紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲
[0001]【技術領域】:
本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，具體涉及釀酒領域中的紫紅曲霉菌YH-6菌株及其用途和由該囷株制備的酷化紅曲。
[0002]【背景技術】: 紅曲霉在生長過程中能產生多種酶類，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、酯化酶等。自上世紀80年代以來，釀酒界對紅曲霉進行了廣泛的探索和應用研究，取得了突破性的進展和良好的經濟效益。紅曲霉種類較多，其中酯化紅曲主要由煙灰色紅曲霉和紫紅曲霉制成，紅曲霉胞外脂酶具有較強的催化己酸乙酯合成的能力，被稱為紅曲酶胞外己酸乙酯合成酶。酯化紅曲(紅曲霉的生物制劑)作為一種生物催化劑，在濃香型白酒發(fā)酵過程中具有重要的作用。
[0003]酯化紅曲作為強化大曲菌種在產酯生香方面具有明顯的優(yōu)勢，為提高白酒中己酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質的形成起到了不可替代的作用。因此，酯化紅曲的使用對提高己酸乙酯的含量，提高基酒優(yōu)質品率效果明顯，經濟效益顯著。此外，酯化紅曲應用于黃水處理，可降低污水處理成本，可以實現對釀酒副產物資源的再利用，使黃水中的COD、BOD含量在原有基礎上下降80%，并獲得一定經濟效益。再者，酯化紅曲對提升二級酒的檔次提供重要的技術支持。二級酒中含有大量的有機酸和醇類，酯化紅曲可以催化二級酒中的有機酸與醇類的酯化合成反應，促進酒中酯類化合物的形成，從而改善二級酒的口味和品質，增加優(yōu)級酒的產量。
[0004]雖然距酯化紅曲的發(fā)現已經有相當長的時間，不同的研究機構和釀酒企業(yè)都開展了酯化紅曲的研究，但實際大規(guī)模的生產應用在國內還很少，同時，現有的酯化紅曲存在著酯化率低的問題也沒有到很好解決，本發(fā)明將促進酯化紅曲的大規(guī)模推廣和應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的要解決的技術問題是提供一種紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲，用該菌株制備的酯化紅曲能促進曲酒中以己酸乙酯為主的四種酯的合成，縮短曲酒的發(fā)酵周期，提高曲酒的優(yōu)質品率。
[0006]本發(fā)明的紫紅曲霉(ifoftascmYH-6菌株是從洋河酒廠股份有限公司自制的大曲中分離得到的，該菌株于2013年7月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號=CGMCC N0.7959。
[0007]本發(fā)明通過以下技術方案實現:
一種紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6,保藏號為:CGMCC N0.7959。
[0008]用上述的紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6制備的酯化紅曲。
[0009]上述的紫紅曲霉菌或酯化紅曲在曲酒發(fā)酵中的用途。
[0010]所述酯化紅曲制備包括以下步驟:
(I)將I g大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集。富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化得到純菌株；將純化后的菌株儲存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存；
(2)將步驟(1)低溫保存的菌種，用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個數達到飽和；
(3)將步驟(2)的菌液以5%的接種量接入固態(tài)培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲。
[0011]所述富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為:麥芽汁培養(yǎng)基，自然pH，115 °C滅菌20min,然后再加乙醇5 %和滅過菌的乳酸4 %。。
[0012]選擇性平板培養(yǎng)基:在100 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯 1.5%，瓊脂 2 %，自然 pH，115 °C滅菌 20 min。
[0013]所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮培養(yǎng)基:麩皮100 8，乳酸0.4 mL，葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5g, KH2PO4 0.1 g, MgSO4.7H20 0.1 g，水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 5 mL。
[0014]菌種篩選步驟:
通過上述步驟(1)得到純菌株10株。將純化后的菌株儲存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存。
[0015]對得到的10株純菌株分別按上述步驟(2)和步驟(3)制備酯化紅曲，篩選的酯化力最高的紫紅曲霉菌株， 由生工生物工程(上海)有限公司進行26s RNA分子測序鑒定。分類命名為紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6。
[0016]菌落形態(tài)為:菌絲較緊密，菌絲蔓延性不強，形成圓形的菌落。菌落表面呈絨毛狀，中間有一突起，有向外呈放射狀的皺褶，邊緣較整齊。菌落干燥，無光澤，菌落顏色最初是白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落最后變?yōu)榧t褐色。打開平板，菌落具有淡雅的香氣。
[0017]以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株，生產得到酯化紅曲粗酶制劑催化己酸合成己酸乙酯具有很強的專一性和選擇性，其最適催化溫度為35 °C，最適催化pH為3.5，最適催化酒精濃度為28 %，最適己酸濃度為I %，其適合應用于濃香型白酒和黃水酯化液的生產中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為篩選出的10株紫紅曲霉菌YH-6菌株酯化能力比較示意圖。
[0019]圖2為紫紅曲霉菌YH-6菌落形態(tài)示意圖(左為菌落正面，右為菌落反面)。
[0020]圖3為紫紅曲霉菌YH-6的26S rRNA系統發(fā)育示意圖。
[0021]圖4為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與時間曲線示意圖。
[0022]圖5為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與溫度曲線示意圖。
[0023]圖6為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與pH值曲線示意圖。
[0024]圖7為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與酒精濃度曲線示意圖。[0025]圖8為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與己酸濃度曲線示意圖。
[0026]【具體實施方式】:
實施例1
三丁酸甘油酯、己酸、乙酸、乳酸、丁酸、乙醇等化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。麩皮由農貿市場上購買。大曲粉為洋河酒廠股份有限公司自制。
[0027]準備以下培養(yǎng)基備用
富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為:麥芽汁培養(yǎng)基，自然pH，115 °C滅菌20 min，然后再加乙醇5 %和滅過菌的乳酸4 %。。均為體積百分比。
[0028]選擇性平板培養(yǎng)基:在100 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，瓊脂2 %，自然pH，115 °C滅菌20 min。均為體積百分比。
[0029]麩皮培養(yǎng)基:麩皮100 g，乳酸0.4 mL,葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO4 0.1g, MgSO4.7H20 0.1 g，水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 2.5 mL。
[0030]菌種篩選步驟:
(1)將Ig大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有 富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集。富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化直至得到純菌株(共得到10株)。將純化后的菌株儲存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 V冰箱保存。
[0031]對得到的10株純菌株分別制備酯化紅曲，制備步驟如下:
(2)將低溫保存菌種用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個數達到飽和。
[0032](3)將步驟(2)的菌液以5 %的接種量接入麩皮培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲麩曲。
[0033]得到10種酯化紅曲麩曲，對其酯化力進行篩選，步驟如下:
(4)稱取相當于5 g干曲量的步驟(3)酯化紅曲麩曲，加入100 mL含I %己酸，20 %乙醇的酯化體系中(其余為水)，32 °C酯化100 h，加水50 mL蒸餾，接餾出液100 mL，最后用氣相色譜檢測反應體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義為每100 mL餾出液中含己酸乙酯多少毫克。篩選酯化力最高的紫紅曲霉菌株。其中6號菌株制成的酯化紅曲麩曲，酯化力最高(180啤/ 100 mL)，如圖1所示。該菌株經生工生物工程(上海)有限公司鑒定，將其命名為紫紅曲霉菌YH-6。該菌株于2013年7月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號=CGMCC N0.7959。
[0034]紫紅曲霉菌YH-6菌落形態(tài):菌絲較緊密，菌絲蔓延性不強，形成圓形的菌落。菌落表面呈絨毛狀，中間有一突起，有向外呈放射狀的皺褶，邊緣較整齊如圖2所示(左為菌落正面，右為菌落反面)。菌落干燥，無光澤，菌落顏色最初是白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落最后變?yōu)榧t褐色。打開平板，菌落具有淡雅的香氣。
[0035]紫紅曲霉菌YH-6，由生工生物工程(上海)有限公司進行26s RNA分子測序鑒定。
[0036]利用PCR測序技術，得到待鑒定紫紅曲霉菌YH-6菌株的587 bp 26S rRNA基因D1/D2保守序列，結果如下:
【權利要求】
1.一種紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6,保藏號為:CGMCC N0.7959。
2.用權利要求1所述的紫紅曲霉菌YH-6制備的酯化紅曲。
3.權利要求1所述的紫紅曲霉菌或權利要求2所述的酯化紅曲在曲酒發(fā)酵中的用途。
4.如權利要求2所述的酯化紅曲，其特征在于所述酯化紅曲制備包括以下步驟: (1)將Ig大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集，富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化得到純菌株；將純化后的菌株儲存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存； (2)將步驟(1)低溫保存的菌種，用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個數達到飽和； (3)將步驟(2)的菌液以5%的接種量接入固態(tài)培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲。
5.如權利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:所述富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為麥芽汁培養(yǎng)基，115 °C滅菌20 min，然后再加乙醇5 %和滅過菌的乳酸4 %。。
6.如權利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:選擇性平板培養(yǎng)基為在100mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，瓊脂2 %，115 °C滅菌20 min。
7.如權利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮培養(yǎng)基，由以下組分組成，麩皮 100 g，乳酸 0.4 mL，葡萄糖 0.5 g，蛋白胨 1.5 g, KH2PO4 0.1 g, MgSO4.7H20·0.1 g,水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 2.5 mL。
【文檔編號】C12G3/02GK103589647SQ201310402204
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權日:2013年9月6日
【發(fā)明者】胡沂淮 申請人:胡沂淮