一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別公開了一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法。該方法以環(huán)狀芽孢桿菌為生產(chǎn)菌種，其特征為，從試管斜面上挑取1-2環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)制得活化后的液體種子；將液體種子接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，依次加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，培養(yǎng)制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)過濾、萃取、靜置分相，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)的連續(xù)化、規(guī)?；?；并且4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，極具工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利說明】一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法。
[0002](二)【背景技術(shù)】
4-乙烯基愈創(chuàng)木酹(4-Vinylguaiacol,4_VG)又名2-甲氧基-4-乙烯基苯酹、對乙烯基愈創(chuàng)木酚，分子式為C9HltlO2,分子量為150.18，為無色或淡黃色的油狀液體，略帶甜味，呈發(fā)酵香氣。4-VG是一種能產(chǎn)生特殊香味或丁香類香味的揮發(fā)性酚類物質(zhì)，其感覺閾值很低，僅為0.3mg/L，它能提高食品的感官品質(zhì)，對酒類、醬油、干酪、飲料等食品的自然香氣有很大影響。4-VG是一種常用的高檔香料，主要用于食品以增加其香味成份，還用于煙草、日化、醫(yī)藥、香精合成等行業(yè)。在釀酒行業(yè)，4-VG是以小麥類為原輔料的上面發(fā)酵啤酒中必不可少的香味物質(zhì)，也是醬香型白酒和葡萄酒中的一種重要的風(fēng)味物質(zhì)。
[0003]4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)方法有從植物中直接提取法、化學(xué)合成法和生物合成法三種。植物提取法是從菊科、旋花科等植物中提取，但由于原料供應(yīng)有限，且植物中4-VG的含量較低，導(dǎo)致提取工藝成本較高而難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004]化學(xué)合成法是常用的生產(chǎn)4-VG的方法，如中國專利文獻(xiàn)CN 101885669 A(申請?zhí)?01010229531.X)公開了一種4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的制備方法，步驟為:(I)向反應(yīng)器中依次投入喹啉、阿魏酸和作為阻聚劑的對苯二酚，加熱，溫度升高到180-185°C時(shí)，反應(yīng)4-5小時(shí)左右；(2 )將上述反應(yīng)液中加入溶劑苯，并加入鹽酸，攪拌均勻，靜置分層，檢測水相pH值為中性為止，最后加入干燥劑無水氯化鈣；(3)將干燥后的溶液放入蒸餾器中，常壓將作為溶劑的苯蒸出，然后連接上真空泵在100°C以下的氣相溫度下將產(chǎn)品蒸出，即可包裝市售。但化學(xué)合成法普遍存在較嚴(yán)峻的環(huán)保問題，反應(yīng)條件一般較劇烈，對設(shè)備要求較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)品收率低；并且由于產(chǎn)品中含有原料、副產(chǎn)物、溶劑等物質(zhì)的殘留物，因此該方法得到的4-VG無法直接添加到食品中。`
[0005]隨著人們對綠色產(chǎn)品要求的日益提高，利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)4-VG的方法具有產(chǎn)品綠色天然、安全可靠、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的重視。生物合成法是通過培養(yǎng)含有阿魏酸脫羧酶的微生物細(xì)胞或通過采用阿魏酸脫羧酶制劑進(jìn)行催化合成4-VG的方法。與植物提取法和化學(xué)合成方相比，生物合成法具有原料來源廣泛、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品收率高、生產(chǎn)成本低、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的特點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)有效和極有產(chǎn)業(yè)化前景的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)方法。
[0006]如中國專利文獻(xiàn)CN 102776246 A(申請?zhí)?01210288911.X)公開了一種生物轉(zhuǎn)化制備天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，該方法以芽孢桿菌feci77心sp.HY3CCTCCM2012247為生物催化劑，以天然阿魏酸為底物，通過微生物轉(zhuǎn)化制備天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。其生產(chǎn)過程包括:(I)斜面培養(yǎng)，(2)制備種子培養(yǎng)液，(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)，(4)轉(zhuǎn)化。該發(fā)明是在微生物的作用下將天然阿魏酸轉(zhuǎn)化制備4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，但天然阿魏酸是從植物(如谷糠、阿魏等沖提取得到的，由于提取成本較高，因此采用該方法生產(chǎn)4-VG的成本也較聞。[0007]許多微生物(如參與酒類釀造的酵母菌、細(xì)菌、真菌等)能夠利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，但由于這些微生物細(xì)胞內(nèi)的阿魏酸脫羧酶活性較低，產(chǎn)生的4-VG含量較低(一般在2.0-5.0mg/L),因而不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0008](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種產(chǎn)率高、成本低、能夠規(guī)?；a(chǎn)的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法。
[0009]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，以菌種保藏編號為CGMCCN0.8044的環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans) HG12菌株為生產(chǎn)菌種,包括如下步驟:(O從試管斜面上挑取1-2環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，在35-40°C、120-160r/min條件下，培養(yǎng)12_16h，制得活化后的液體種子；
(2)將液體種子按體積比為3-5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵10-12h，加入木聚糖酶，繼續(xù)發(fā)酵10_12h，加入阿魏酸酯酶，再發(fā)酵60-72h制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；
(3)將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，向?yàn)V出液中加入萃取劑，混合均與，靜置分相，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品O
[0010]本發(fā)明涉及的環(huán)`狀芽孢桿菌{Bacillus circulans) HG12菌株是從中國白酒廠釀造醬香型白酒用的高溫大曲中分離，并經(jīng)過紫外線誘變篩選獲得，已于2013年8月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC N0.8044。
[0011]本發(fā)明的環(huán)狀芽孢桿菌(ifeci77i/5.HG12菌株的微生物學(xué)特征是:菌落呈乳白色、有褶皺、無光澤、表面不光滑；菌體呈桿狀、直或接近直、單個(gè)或成鏈狀，細(xì)胞大小約為(0.6-1.0) MmX (1.8-3.8) Mm，產(chǎn)芽孢、孢囊膨大、芽孢橢圓形、芽孢中生到端生；革蘭氏陽性、兼性厭氧、有機(jī)化能異養(yǎng)菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖產(chǎn)酸，V-P反應(yīng)陰性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，可水解酪蛋白、明膠和淀粉，不利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，在培養(yǎng)溫度為55°C下生長；可發(fā)酵小麥麩皮、小麥、大麥、高粱的一種或幾種組合制成的液體培養(yǎng)基和固態(tài)培養(yǎng)基，產(chǎn)生明顯的醬香香氣。
[0012]本發(fā)明的更優(yōu)方案為:
步驟(1)中，液體種子培養(yǎng)基的組分為:葡糖糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏
10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0-7.2，蒸餾水定容。
[0013]步驟(2)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基為:小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于100°C下、蒸煮 10_20min,調(diào) pH 值為 6.0-6.5,121°C下、滅菌 30min。
[0014]步驟(2)中，菌體的發(fā)酵條件為37-40°C、160-200r/min。
[0015]步驟(3)中，微孔濾膜的工作壓力為0.05-0.1MPa，微孔濾膜的孔徑為0.2-0.4Mm。
[0016]步驟(3)中，萃取劑為乙酸丁酯，其用量為濾出液體積比的20-30%。
[0017]步驟(2)中，木聚糖酶的用量為10.0_20.0U/g麩皮，阿魏酸酯酶的用量為
5.0-10.0U/g 麩皮。
[0018]本發(fā)明使用的環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株來源于醬香型白酒高溫大曲并經(jīng)過紫外線誘變選育獲得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脫羧酶，能將發(fā)酵液中的阿魏酸脫羧生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚且生成率高；HG12菌株發(fā)酵性能優(yōu)良，其發(fā)酵液中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濃度高；HG12菌株的發(fā)酵產(chǎn)物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚符合相關(guān)食品安全法規(guī)，安全無毒害，屬于綠色安全食品。
[0019]本發(fā)明米用小麥麩皮為原料,小麥麩皮中含有豐富的阿魏酸，在高溫蒸煮以及木聚糖酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，其含有的阿魏酸幾乎全部釋放到發(fā)酵液中，為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)提供了天然原料；小麥麩皮營養(yǎng)豐富，含有25-30%的淀粉、15%左右的蛋白質(zhì)以及多種微量元素，能充分滿足HG12菌株的生長要求；小麥麩皮來源廣泛、價(jià)格低廉，用其為原料發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)成本低。
[0020]本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)的連續(xù)化、規(guī)模化；并且4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，極具工業(yè)化應(yīng)用前景。
[0021](四)【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體描述或作進(jìn)一步說明，目的在于更好地理解本發(fā)明的方法，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。
[0022]本發(fā)明中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量的測定步驟如下:
精密稱取4-乙烯基愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用色譜純甲醇溶解并定容到25mL，制得濃度為lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。用色譜純甲醇將標(biāo)準(zhǔn)母液進(jìn)行稀釋，制得質(zhì)量體積濃度依次為0.02,0.2、1.0,2.0,4.0Pg/mL的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用0.22Mffl的有機(jī)濾膜過濾，過濾液分別用高效液相色譜儀(購自上海天普分析儀器有限公司)進(jìn)樣測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、濃度值(X，Kg/mL)為橫坐標(biāo)，制作4-乙烯基愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得該曲線的回歸方程為:y=3.973X+9.522(R2=0.9995)，其中:y為峰面積，x為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的質(zhì)量濃度(Pg/mL)，R2為相關(guān)系數(shù)。峰面積Y的變化與4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的質(zhì)量濃度成線性關(guān)系，其擬合度達(dá)0.9995。
[0023]將含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酹的發(fā)酵液在8000r/min下、離心20min,取上清液,用0.22Mm的水性濾膜過濾，將過濾液稀釋成質(zhì)量濃度為0.01-4.0Pg/mL的樣品溶液，用高效液相色譜儀進(jìn)樣測定，得到樣品溶液的峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濃度。
[0024]高效液相色譜儀的測定條件為:C18色譜柱(Agilent HC-C18, 250mmX4mm, 5Mm),流動相為水:甲醇:磷酸=540:450:10 (v/v/v)，流速為lmL/min，進(jìn)樣量為15μ?，操作溫度為30°C。熒光檢測器條件為激發(fā)波長270nm、發(fā)射波長315nm。
[0025]原料來源:小麥麩皮市售，乙酸丁酯購自上海譜振生物科技有限公司，4-乙烯基愈創(chuàng)木酹標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司，阿魏酸酯酶購自愛爾蘭Megazyme公司，木聚糖酶購自諾維信公司，甲醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
[0026]實(shí)施例1
一種利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酹的方法，步驟如下:
(I)用接種環(huán)從菌株試管斜面上挑取I環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株接種到IOmL的液體種子培養(yǎng)基中，在37°C、120r/min條件下，培養(yǎng)14h，制得活化后的液體種子。
[0027](2)將步驟(1)制得的液體種子按5% (v/v)的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在40°C、200r/min下培養(yǎng)12h，加入木聚糖酶，其用量為20.0U/g麩皮；在40°〇、200r/min下繼續(xù)培養(yǎng)12h，加入阿魏酸酯酶，其用量為10.0U/g麩皮；再在40°C、200r/min下繼續(xù)培養(yǎng)72h，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0028](3)將步驟(2)制得的含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液在0.1MPa壓力下用孔徑為0.2Mm的微孔濾膜過濾除菌，收集濾出液，向?yàn)V出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量為濾出液體積百分比的30% (v/v)，混合均勻，靜置分相，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的萃取液。將萃取液在100°C、667Pa下蒸發(fā)，制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.239g。
[0029]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量為1.22g/L。
[0030]所述步驟(1)中的液體種子培養(yǎng)基組分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0, NaCl 5.0, pH 7.2，蒸餾水定容。
[0031]所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基:小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于10CTC下、蒸煮 IOmin,調(diào) pH 值為 6.0,121°C下、滅菌 30min。
[0032]實(shí)施例2
如實(shí)施例1所述的利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，將步驟(1)制 得的液體種子按5% (v/v)的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，木聚糖酶的用量為10.0U/g麩皮，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0033]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量為1.18g/L。
[0034]在此條件下制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.231g。
[0035]實(shí)施例3
如實(shí)施例1所述的利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，將步驟(1)制得的液體種子按5% (v/v)的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，阿魏酸酯酶的用量為5.0U/g麩皮，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0036]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量為1.12g/L。
[0037]在此條件下制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.219g。
[0038]實(shí)施例4
如實(shí)施例1所述的利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，將步驟(1)制得的液體種子按5% (v/v)的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，木聚糖酶的用量為10.0U/g麩皮，阿魏酸酯酶的用量為5.0U/g麩皮，制得含有
4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0039]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量為1.06g/L。
[0040]在此條件下制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.208g。
[0041]實(shí)施例5
一種利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酹的方法，步驟如下:
Cl)同實(shí)施例1的步驟(1)。
[0042](2)將步驟(1)制得的液體種子按3% (v/v)的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、160r/min下培養(yǎng)10h，加入木聚糖酶，其用量為20.0U/g麩皮；在37°C、 160r/min下繼續(xù)培養(yǎng)10h，加入阿魏酸酯酶，其用量為10.0U/g麩皮；再在37°C、160r/min下繼續(xù)培養(yǎng)60h，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0043](3)將步驟(2)制得的含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液在0.05MPa壓力下用孔徑為0.4Mm的微孔濾膜過濾除菌，收集濾出液；向?yàn)V出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量為濾出液體積百分比的25% (v/v)，混合均勻，靜置分相，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的萃取液；將萃取液在100°C、667Pa下蒸發(fā)，制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.217g。
[0044]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量為1.13g/L。
[0045]所述步驟(1)中的液體種子培養(yǎng)基組分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，NaCl 5.0, pH 7.0，蒸餾水定容。
[0046]所述步驟(2)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基:小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于 10CTC下、蒸煮 20min,調(diào) pH 值為 6.5,121°C下、滅菌 30min。
[0047]實(shí)施例6
如實(shí)施例1所述的利用環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(3)中，向?yàn)V出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量為濾出液體積百分比的20%(v/v)。
[0048]制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品0.232g。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，以菌種保藏編號為CGMCCN0.8044的環(huán)狀芽孢桿菌心circulans) HG12菌株為生產(chǎn)菌種，其特征為，包括如下步驟:(I)從試管斜面上挑取1-2環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，在35-40°C、120-160r/min條件下，培養(yǎng)12_16h，制得活化后的液體種子；(2)將液體種子按體積比為3-5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵10-12h，加入木聚糖酶，繼續(xù)發(fā)酵10-12h，加入阿魏酸酯酶，再發(fā)酵60-72h制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；(3)將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，向?yàn)V出液中加入萃取劑，混合均與，靜置分相，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征為，步驟(1)中，液體種子培養(yǎng)基的組分為:葡糖糖10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0-7.2，蒸餾水定容。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征為，步驟(2)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基為:小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于100°C下、蒸煮 10-20min，調(diào) pH 值為 6.0-6.5，121°C下、滅菌 30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(2)中，菌體的發(fā)酵條件為37-40°C、160-200r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(3)中，微孔濾膜的工作壓力為0.05-0.1MPa，微孔濾膜的孔徑為0.2-0.4Mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(3)中，萃取劑為乙酸丁酯，其用量為濾出液體積比的20-30%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(2)中，木聚糖酶的用量為10.0-20.0U/g麩皮，阿魏酸酯酶的用量為5.0-10.0U/g麩皮。
【文檔編號】C12P7/22GK103789357SQ201310413429
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】董永勝 申請人:齊魯工業(yè)大學(xué)