豆蚜特異性ss-coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豆蚜特異性SS-COI引物以及含有該引物的檢測試劑盒，根據(jù)豆蚜特有的mtDNA序列，設(shè)計了一對豆蚜特異性SS-COI引物L(fēng)FAcF和LFAcR（SEQ?ID?No.1和2），該對引物僅對豆蚜具有特異性擴增能力，擴增產(chǎn)物大小為193bp，質(zhì)粒濃度檢出限為3.99E+4，DNA濃度檢出限為0.413ng/μL。本發(fā)明采用SS-COI?PCR技術(shù)，提高了檢測準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，適于基層推廣應(yīng)用。
【專利說明】豆蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及豆蚜特異性ss-coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豆姆Aphis craccivora Koch,別名花生姆、苜猜姆,屬半翅目姆科,是豆科作物的重要害蟲，具較強的遷飛和擴散能力。豆蚜危害寄主常群集于嫩莖、幼芽、頂端嫩葉、心葉、花器及莢果處吸取汁液。受害嚴(yán)重時，植株生長不良，葉片卷縮，影響開花結(jié)實。豆蚜還能大量排泄“蜜露”，引起植物煤污病，從而影響光合作用，導(dǎo)致植株結(jié)莢減少、千粒重下降。豆蚜在田間有多種捕食性天敵(如瓢蟲、草蛉、蜘蛛等)，天敵的保護(hù)和利用是豆蚜防治的重要措施。如何對田間不同種類天敵的控制作用進(jìn)行合理評估，進(jìn)而選擇出繁殖力高、捕食能力和尋找寄主能力強、控害作用明顯的天敵資源，是進(jìn)行天敵保護(hù)合理保護(hù)與利用的基礎(chǔ)與核心。
[0003]Species-Specific-COI PCR檢測技術(shù)是在mtDNA COI技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強等優(yōu)點，為準(zhǔn)確評價天敵對獵物的捕食作用開辟了新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供豆蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)豆蚜的線粒體DNA序列，設(shè)計一對豆蚜特異性SS-COI引物，其包括:
[0006]正向引物L(fēng)FAcF: 5’ -CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3 ’
[0007]反向引物L(fēng)FAcR: 5，-AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3，。
[0008]本發(fā)明還提供含有引物L(fēng)FAcF和LFAcR的用于檢測豆蚜的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0009]本發(fā)明還提供所述引物L(fēng)FAcF和LFAcR，以及含有引物L(fēng)FAcF和LFAcR的試劑盒在檢測豆蚜中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供一種豆蚜的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)提取樣品DNA;
[0012]2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物L(fēng)FAcF和LFAcR進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)；
[0013]3)分析PCR產(chǎn)物。[0014]對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)大小為193bp的DNA擴增條帶(SEQ ID N0.3)，則判定樣品為豆蚜。
[0015]本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的豆蚜COI (JX559638)的一段基因序列，設(shè)計一對特異性引物，該引物特異性強，只對豆蚜具有擴增能力，而對我國華北棉區(qū)內(nèi)棉田中的主要昆蟲無擴增產(chǎn)物。采用本發(fā)明提供的方法和引物檢測豆蚜，準(zhǔn)確性高，可擴增出193bp大小的片段。采用SS-COI PCR技術(shù)檢測豆蚜，是對RAPD技術(shù)、RFLP技術(shù)和mtDNACOI檢測技術(shù)的補充和改進(jìn)，SS-COI PCR檢測技術(shù)操作簡單、快速、高效，一般可在5個小時內(nèi)完成檢測，且具有較高的靈敏度，質(zhì)粒濃度檢出限為3.99E+4，DNA濃度檢出限為0.413ng/ μ L。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實施例1中豆蚜特異性引物L(fēng)FAcF/LFAcR的PCR檢測結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder ; 1-114為表1中序號所對應(yīng)昆蟲的擴增結(jié)果，-為陰性對照。
[0017]圖2為本發(fā)明實施例2中豆蚜特異性引物L(fēng)FAcF/LFAcR的DNA濃度梯度檢測結(jié)果；其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5000bp ladder ;1_8為模板DNA濃度413.6ng/ μ L依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對照。
[0018]圖3為本發(fā)明實施例2中豆蚜特異性引物L(fēng)FAcF/LFAcR的質(zhì)粒濃度梯度檢測結(jié)果；其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5000bp ladder ;1_11為模板質(zhì)粒濃度3.99E+11依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對照。
【具體實施方式】
[0019]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件 ，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0020]實施例1弓丨物L(fēng)FAcF/LFAcR對豆蚜的擴增效果
[0021]I)豆蚜基因組的制備
[0022]將單頭姆蟲放入1.5ml離心管中將其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生物有限公司，北京)提取單頭蚜蟲基因組。將DNA溶液儲于_20°C備用，進(jìn)行PCR擴增時吸取I μ L溶液作為DNA模板。
[0023](2)合成檢測豆蚜的特異性SS-COI引物
[0024]特異性SS-COI引物序列如下:
[0025]LFAcF:5’-CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0026]LFAcR:5’-AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0027]2) PCR 擴增
[0028]反應(yīng)體系為20 μ L，包括:10 X EasyTaq 緩沖液 2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、正、反向引物(10 μ M)各 0.4 μ L、模板 DNAl.0 μ L、ddH2015.6μ L0
[0029]3) PCR擴增程序
[0030]94°C預(yù)變性 4min ；94°C 30sec,54°C 30sec,72°C 30sec,45 個循環(huán)；最后 72°C延伸Isec。
[0031]4) PCR產(chǎn)物鑒定
[0032]取6 μ L PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)中，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定。
[0033]5)結(jié)果
[0034]利用引物L(fēng)FAcF/LFAcR，以豆蚜DNA為模板，以豆蚜同域的59種其他昆蟲(見表1)為對照進(jìn)行Species-Specific-COI PCR擴增，結(jié)果如圖1所示，1、2泳道對應(yīng)的豆蚜擴增出了 193bp的目的條帶,說明根據(jù)豆姆線粒體DNA設(shè)計的Species-Specific-COI PCR擴增引物的特異性強?；厥丈鲜?93bp的目的條帶，進(jìn)行測序，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0035]表1引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類
【權(quán)利要求】
1.豆蚜特異性SS-COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 LFAcF:5’ -CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3’ 反向引物 LFAcR:5’ -AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測豆蚜的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測豆蚜中的應(yīng)用。
6.豆蚜的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物L(fēng)FAcF和LFAcR進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20μ I計為:
模板 DNA1.Ομ?
2,5mM dNTPs0,4μΙ
ΙΟμΜ 引物 LFAcF0.4μΙ
ΙΟμΜ 引物 LFAcR0.4μ1
5υ/μ1 Easy Taq DNA聚合酶0.2μΙ
10 χ Easy 緩沖液2.0μΙddH20補足至 20μΙ。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C4分鐘；94°C30秒，54°C 30秒，72 °C 30秒，共45個循環(huán)；72°C I秒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468677SQ201310429628
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】王倩, 楊帆, 陸宴輝, 楊益眾 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所