一種人類環(huán)氧合酶-2的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于增加人環(huán)氧合酶-2的表達在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，并檢測優(yōu)先和獨立的DNA組成的人類環(huán)氧合酶-2的cDNA連接到3'側(cè)翼序列的人類環(huán)氧合酶-1方法測量cyclogenase-2在樣品。
【專利說明】一種人類環(huán)氧合酶-2
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種人類環(huán)氧合酶-2。
_2] 發(fā)明背景
本發(fā)明包括一種人類環(huán)氧合酶-2蛋白包括人類高表達環(huán)氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳動物表達載體系統(tǒng)的高水平表達。
[0003]發(fā)揮非留體類抗炎藥的抗炎，止痛和退熱活性，并抑制激素誘導(dǎo)的子宮收縮和某些類型癌的生長，通過抑制前列腺素G / H合成酶，也被稱為環(huán)氧合酶。直到最近，只有一種形式的環(huán)氧合酶其特征在于，這對應(yīng)于環(huán)氧合酶-l(COX-l)，最初在牛的儲精囊中確定的構(gòu)成enyme。最近一種可誘導(dǎo)形式的環(huán)氧合酶(環(huán)氧合酶_2; C0X-2))的基因已被克隆，測序，其特征在于從雞，小鼠和人源。cyclooxygnase-2是不同于這也被克隆,測序,其特征在于從綿羊，小鼠和人源的環(huán)氧合酶-1。環(huán)氧合酶-2的是快速和容易的代理，包括有絲分裂原，內(nèi)毒素，激素，細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)的一些。由于前列腺素的生理和病理作用，我們得出的結(jié)論是本構(gòu)酶，環(huán)氧合酶-1，負(fù)責(zé)大部分基底的內(nèi)源性前列腺素釋放，因此其生理功能是非常重要的，其中包括維護胃腸道的完整性和腎的血流量。與此相反，可誘導(dǎo)形式的酶，環(huán)氧合酶-2主要負(fù)責(zé)迅速誘導(dǎo)的酶會發(fā)生響應(yīng)劑作為抗炎劑，激素，生長因子和細(xì)胞因子等的病理作用的前列腺素。因此，環(huán)氧合酶-2的選擇性抑制劑將有類似的傳統(tǒng)的非留體類抗炎藥(NSAID)的抗炎，解熱和鎮(zhèn)痛性質(zhì)，會抑制激素誘導(dǎo)的子宮收縮，將具有潛在的抗癌作用，但也將有能力都會下降，誘發(fā)一些機制為基礎(chǔ)的副作用。特別是，這種選擇性抑制劑應(yīng)該有一個潛在的胃腸道毒性，腎的副作用降低的潛力，減少出血時間的影響，可能是阿司匹林敏感的哮喘患者的能力下降，誘發(fā)哮喘發(fā)作減少。
[0004]因此，本發(fā)明的一個目的是提供檢測和材料，以識別和評估的藥物是有效的抑制齊U，環(huán)氧合酶-2和環(huán)氧合酶-2的活性。
[0005]這也是本發(fā)明的一個目的是提供檢測和材料，來識別和評估優(yōu)先或選擇性地抑制環(huán)氧合酶-2超過環(huán)氧合酶-1和環(huán)加氧酶-1活性和C0X-2活性的藥物制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明包括一種人類環(huán)氧合酶-2蛋白包括人類高表達環(huán)氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳動物表達載體系統(tǒng)的高水平表達。
[0007]本發(fā)明還包括檢測，以確定和評估的藥物是有效的抑制劑，環(huán)氧合酶-2和環(huán)氧合酶-2的活性。本發(fā)明還包括檢測，以確定和評估的藥物制劑，優(yōu)選地或選擇性地抑制環(huán)氧合酶-2和環(huán)氧合酶-2超過環(huán)氧合酶-1和環(huán)氧化酶-1活性的活性。
[0008]本發(fā)明還包括重組DNA分子，其中的核苷酸序列編碼人環(huán)氧合酶-2蛋白編碼基因的3’側(cè)翼序列連接到人的環(huán)氧合酶-l，C0X-2/C0X-l核苷酸序列的融合和系統(tǒng)的表達載體的人類環(huán)氧合酶-2蛋白的表達增強。

【具體實施方式】
[0009]在一個實施例中，本發(fā)明包括一個用于確定檢測環(huán)氧合酶-2的活性的樣品，包括以下步驟:(a)將(I)的人骨肉瘤細(xì)胞的制備，(2)的樣品中，樣品包括一個假定的環(huán)氧合酶-2的抑制劑，和(3)花生四烯酸，以及(b)確定在步驟(a)中產(chǎn)生的前列腺素的量E.sub.2。
[0010]為了本說明書的目的，人骨肉瘤細(xì)胞旨在包括，但不限于市售的人骨肉瘤細(xì)胞系，如那些可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，美國馬里蘭州羅克維爾，如骨肉瘤143B(ATTCCRL 8303 )和骨肉瘤143B PML BK TK (ATCC CRL 8304，我們發(fā)現(xiàn)骨肉瘤143.98.2，它最初是由威廉.薩格登博士，癌癥研究麥克安德爾實驗室，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校，獲得有用?，F(xiàn)在我們已經(jīng)在布達佩斯條約“與ATCC骨肉瘤143.98.2存款項下的鑒別骨肉瘤143.98.2(ATCC CRL 11226)于 1992 年 12 月 22 日。
[0011]為了本說明書的目的，應(yīng)被定義為骨肉瘤細(xì)胞的制備人骨肉瘤細(xì)胞的單層或懸浮液的水溶液，其中的一部分會催化的合成的前列腺素E.sub.2 (PGE.sub.2)。此外，該制劑含有緩沖液如Hank氏平衡鹽溶液。
[0012]于本實施例中是屬人骨肉瘤細(xì)胞是從骨肉瘤的細(xì)胞類型，包括骨肉瘤143B和143B PML BK TK 143的家庭。我們已經(jīng)使用了骨肉瘤143.98.2。
[0013]為了本說明書的目的還包括骨肉瘤細(xì)胞的制備人骨肉瘤微粒，其中的一部分會催化合成PGE.sub.2。的微?？梢酝ㄟ^以下方式獲得，從這里所公開的任何骨肉瘤細(xì)胞系，如下所述。
[0014]第二實施例，本發(fā)明包括一種組合物，該組合物包括(a)的骨肉瘤細(xì)胞的制備，具有約103，約109骨肉瘤細(xì)胞，每毫升的細(xì)胞制備物，及(b) 0.1 50之間的。mu.1無過氧化物的花生四烯酸的每毫升的細(xì)胞準(zhǔn)備。
[0015]通常情況下，細(xì)胞的制備將作為單層生長，使用的8.2.times.10.sup.42.times.10.sup.6每孔細(xì)胞的等分試樣(約I毫升工作容積)中所描述的下面的協(xié)議。花生四烯酸是通常使用的量為I至20微升每孔約I毫升的工作容積。
[0016]骨肉瘤微粒時使用的，而不是全部的細(xì)胞，細(xì)胞制劑一般含有50至500微克每毫升的細(xì)胞制備的微粒體蛋白?；ㄉ南┧崾峭ǔＪ褂玫牧繛镮至20。每毫升的細(xì)胞制備mu.1 酸。
[0017]第三實施例，本發(fā)明包括一個用于確定檢測的環(huán)氧合酶-1活性的樣品，包括以下步驟:(a)將(I)的細(xì)胞制備，表達環(huán)氧合酶-1的細(xì)胞，但不表達環(huán)氧合酶_2，(2)樣品，樣品包括一個假定環(huán)加氧酶-1抑制劑，(3)花生四烯酸，以及(b)確定在步驟(a)中產(chǎn)生的量PGE.sub.2。
【權(quán)利要求】
1.生產(chǎn)人類環(huán)氧合酶-2，包括:Ca)轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的表達載體的編碼人環(huán)氧合酶-2; (b)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，及(c)從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中回收人環(huán)氧合酶-2; 編碼人環(huán)氧合酶-2的表達載體包括一個第一位置97至1909的序列的核苷酸序列，它包括其中；ID; NO:19或簡并變體和第二個核苷酸序列，包含SEQ ; ID; NO:13，它的3’的第二個核苷酸序列的5’末端的第一個核苷酸序列所附帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中哺乳動物細(xì)胞是選自下列組成的組:CV-1細(xì)胞，COS-1 細(xì)胞，COS-7 細(xì)胞，3T3 細(xì)胞，NIH/3T3 細(xì)胞，HeLa 細(xì)胞，C127I 細(xì)胞，BS-C-1 細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中選自下列組成的組:牛痘病毒表達載體的哺乳動物的質(zhì)粒表達載體，該表達載體。
【文檔編號】C12N9/02GK104513815SQ201310448689
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】陳晴川 申請人:上海滿益科技有限公司