人乳頭瘤病毒基因,及載體,菌株,表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及經(jīng)畢赤酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化的52，31和45型人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1的基因，含有這些基因的載體、菌株，其制備方法，以及表達(dá)方法。
【專利說明】人乳頭瘤病毒基因，及載體，菌株，表達(dá)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本領(lǐng)域涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)密碼子優(yōu)化而適于在畢赤 酵母中表達(dá)的HPV52, HPV31，HPV45型人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1的基因，W及含有該基 因的載體、菌株及表達(dá)該基因的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大婦科惡性腫瘤，全球每年有超過50萬的婦女被 診斷出患有宮頸癌，27萬婦女死于此病，年齡標(biāo)準(zhǔn)化感染率達(dá)10.5%。早在80年代初， Harald zur Hausen就發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒化uman papilloma virus，HPV)的感染與宮頸癌 發(fā)病有關(guān)，后續(xù)的大量研究也已證明HPV與宮頸癌及其癌前病變有密切聯(lián)系。到目前為止， 已發(fā)現(xiàn)了百余種HPV基因型，其中約40種可W感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型別為 冊￥16、18、31、33、45、52和58,90%^上的宮頸癌與它們有關(guān)。
[0003] 根據(jù)2010年W冊的報告，HPV52是世界范圍內(nèi)宮頸癌中檢測率占第7位的高危型 另ij，主要與亞洲地區(qū)的宮頸癌相關(guān)，而在宮頸高度病變中檢出率排在第3位。與HPV16和 HPV18型不同的是HPV52的分布有一定的地理偏向性。亞洲HPV感染型別中，HPV52型檢出 率較高，我國進(jìn)行的多項(xiàng)研究表明HPV52型也屬比較常見的型別。
[0004] 根據(jù)2010年W冊的報告，HPV31是世界范圍內(nèi)宮頸癌中檢測率占第6位的高危型 另IJ，而在宮頸高度病變中檢出率排在第2位。HPV31被認(rèn)為是宮頸鱗狀細(xì)胞癌中最普遍的4 種高危型之一，在無癥狀的病人中廣泛存在。具體來說HPV31型主要與宮頸上皮內(nèi)異型增 生病變和宮頸癌的形成相關(guān)。
[0005] HPV45在中國婦女中HPV感染亞型的發(fā)生率為2. 3%，屬于在中國發(fā)生率較高的 HPV亞型（Qiina Human Papillomavirus and Related Cancers'Fact 化eet2010，WH0/IC0 Information Centre on HPV and Cervical Cancer, Sepl5,2010)。
[0006] HPV是無包膜二十面體對稱病毒，其病毒基因組DM為閉合環(huán)狀，長度約 7200-8000bp,由早期編碼區(qū)（early region)、晚期編碼區(qū)（late region)和位于兩者之間 的長調(diào)控區(qū)（long control region)組成。其中晚期編碼區(qū)含兩個開放閱讀框（0RF)，編碼 病毒衣殼蛋白L1和L2。L1蛋白分子量約55kDa，為主要衣殼蛋白，W 72個五聚體的形式支 撐整個病毒衣殼結(jié)構(gòu)，在不同型別中氨基酸序列高度保守，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。 L2蛋白分子量較小，多位于L1蛋白內(nèi)部。
[0007] 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、原核表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)都 可W通過單獨(dú)表達(dá)主要衣殼蛋白L1或聯(lián)合表達(dá)L1+L2的方式獲得病毒樣顆粒（VLP)。L1 單獨(dú)表達(dá)得到的VLP與天然病毒衣殼結(jié)構(gòu)類似，可用于誘導(dǎo)與保護(hù)免受病毒侵襲有關(guān)的高 效價病毒中和抗體應(yīng)答。
[000引因此，鑒于L1蛋白于不同基因型別內(nèi)部高度保守，并且能夠單獨(dú)表達(dá)形成VLP，W L1蛋白作為HPV疫苗研發(fā)的目標(biāo)蛋白具有較高的可行性。不過，W表達(dá)重組病毒蛋白得到 的VLP作為HPV疫苗的商業(yè)化開發(fā)與生產(chǎn)需要解決許多技術(shù)問題，其中首先需要解決的技 術(shù)問題就是如何提高重組病毒蛋白的表達(dá)水平。而LI蛋白在大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病 毒等表達(dá)系統(tǒng)中，往往受到該些生物體內(nèi)氨基酸密碼子使用頻率的限制導(dǎo)致表達(dá)水平較低 甚至無表達(dá)。如Merck公司的美國專利No. 7, 498, 036中記載，野生型VLP蛋白在釀酒酵母 中的表達(dá)量為35 y g/mg (破菌上清液中的VLP/破菌上清液總蛋白）左右。
[0009] 因此，本領(lǐng)域中需要一種高水平表達(dá)HPV5化1，HPV31L1，和HPV45L1基因的方法， 所述方法應(yīng)該能夠高水平地、操作簡便和低成本地表達(dá)HPV5化1，HPV31L1，和HPV45L1基 因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種能夠在畢赤酵母中 表達(dá)的HPV52，HPV31，HPV45基因，所述基因具有SEQ ID N0;2，SEQ ID N0;4,和SEQ ID NO: 6所示的核巧酸序列。
[0011] 利用畢赤酵母作為表達(dá)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)量高、操作簡便、成本低等 特點(diǎn)，并且相較于更高等的昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞而言更利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于 不同物種間氨基酸密碼子使用頻率不一，在利用畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的時候，往往根據(jù) 目的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化調(diào)整后得到更利于翻譯的DNA序列。因此，本發(fā)明 的經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的HPV52, HPV31，HPV45基因在畢赤酵母中可W獲得較高的表達(dá)水平， 更有利于針對HPV52, HPV31，HPV45的預(yù)防性疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。如本申請實(shí)施例所示，本 發(fā)明的密碼子優(yōu)化過的HPV52, HPV31，HPV45基因在畢赤酵母中的表達(dá)量分別可最高達(dá)約 140 y g/mg，110 y g/mg，150 y g/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液總蛋白）。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種在畢赤酵母中表達(dá)HPV L1基因的方法，包括 下述步驟：
[0013] (1)將本發(fā)明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因分別各自克隆入表達(dá)載體中；
[0014] (2)將步驟（1)所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株中；
[0015] (3)使用抗生素對步驟（2)所得的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行篩選，獲得生長情況最好的一個 或多個菌株；
[0016] (4)通過測試HPV52，HPV31，HPV45L1基因的表達(dá)量對步驟（3)所得的菌株進(jìn)行進(jìn) 一步篩選，獲得表達(dá)量最高的一個或多個菌株；
[0017] (5)使用步驟（4)所得的菌株進(jìn)行表達(dá)，分別獲得HPV52, HPV31，HPV45L1蛋白。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，所述步驟（1)中所述的表達(dá)載體為pPICZaB載 體，并且所述步驟（3)中使用的抗生素為Zeocin。。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，所述步驟（2)中使用的畢赤酵母菌株為畢赤酵 母X-33菌株。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，所述步驟（4)中測試HPV52, HPV31，HPV45L1基 因的表達(dá)量的操作是通過Western blot方法進(jìn)行的。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，所述步驟巧）中的表達(dá)步驟為在發(fā)酵罐中進(jìn)行 的發(fā)酵步驟。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的第H方面，提供了含有本發(fā)明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因的表達(dá) 載體。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，所述含有本發(fā)明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因 的表達(dá)載體來源于pPICZ a B載體。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了含有本發(fā)明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因或表達(dá) 載體的畢赤酵母菌株，所述菌株能夠高水平地表達(dá)生產(chǎn)HPV52, HPV31，HPV45L1蛋白，更利 于針對HPV52, HPV31，和HPV45的預(yù)防性疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[00巧]圖1顯示了冊￥5211基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。冊￥520.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒 定雙酶切結(jié)果1 ;表達(dá)質(zhì)?；痠ndlll+Kpnl) ;2 ;DNA Marker。
[0026] 圖2顯示了破菌后的HPV52L1上清液Western-blot鑒定。Western-blot鑒定 5化 1'誘導(dǎo)表達(dá)情況，1-8 ;重組表達(dá)菌株；9 ;PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 : 空宿主菌。
[0027] 圖3顯示了 HPV52L1蛋白樣品SDS-PAGE電泳圖。HPV52L1純化后病毒樣顆粒 SDS-PAGE電泳檢定，IMarker ;2HPV52L1最終純化后病毒樣顆粒。
[0028] 圖4顯示了 HPV52L1蛋白樣品中呈現(xiàn)病毒樣顆粒電鏡照片。HPV52L1純化后病毒 樣顆粒電鏡照片。
[0029] 圖 5 顯示了 HPV31L1-PPIC ZaB 雙酶切鑒定結(jié)果。1 ;DNA Marker ;2,3,6,8 : 31L1-PPIC ZaB單克隆質(zhì)粒；4,5,7,9 ;31Ll-pPIC ZaB單克隆質(zhì)粒雙酶切（KpnI/BstBI)。
[0030] 圖6顯示了 HPV31L1誘導(dǎo)表達(dá)情況Western-blot鑒定。1-8 ;重組表達(dá)菌株；9 : 陽性蛋白原液；10 ;F*ageRuler Prestained Protein Ladder。
[0031] 圖7顯示了 HPV31L1純化后病毒樣顆粒SDS-PAGE電泳檢定。IMarker ;2純化后 HPV3IL1
[0032] 圖8顯示了 HPV31L1純化后病毒樣顆粒電鏡照片
[0033] 圖9顯示了 HPV4化10. 8 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切結(jié)果。1 ;表達(dá)質(zhì)粒 化indlll+Kpnl 雙酶切）；2 ;DNA Marker
[0034] 圖10顯示了 HPV4化IWestern-blot鑒定45L1'誘導(dǎo)表達(dá)情況。1 ;空宿主菌；2-8， 10 ;重組表達(dá)菌株；9 ;PageRuler Prestained Protein Ladder
[00巧]圖11顯示了 HPV4化1純化后SDS-PAGE電泳檢定。1HPV4化1蛋白；2Marker
[0036] 圖12顯示了 HPV45L1純化后病毒樣顆粒電鏡照片
[0037] 序列說明
[0038] SEQ ID NO ;1為野生型HPV52L1氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO ;2為本發(fā)明的HPV52L1基因的核巧酸序列。
[0040] SEQ ID NO ;3為野生型HPV31L1氨基酸序列。
[0041] SEQ ID NO ;4為本發(fā)明的HPV31L1基因的核巧酸序列。
[0042] SEQ ID NO ;5為野生型HPV45L1氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO ;6為本發(fā)明的HPV45L1基因的核巧酸序列。
[0044] SEQ ID N0;7HPV5化1基因的核巧酸序列正向引物。
[0045] SEQ ID NO ;8HPV52L1基因的核巧酸序列反向引物。
[0046] SEQ ID NO ;9HPV45L1基因的核巧酸序列正向引物。
[0047] SEQ ID N0;10HPV4化1基因的核巧酸序列反向引物。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 通過W下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，W便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā) 明。下述實(shí)施例僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù) 字（如數(shù)量、溫度等）的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會存在一些誤差和偏差。除非另有說明，溫 度W C為單位或者為環(huán)境溫度，壓力接近或等于大氣壓。除非另有說明，在下述各實(shí)施例中 用到的限制性內(nèi)切酶均購自New化gland Biol油公司。應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另有說明，下 述各實(shí)施例中所用到的儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域的常規(guī)設(shè)備。除非另有說明，所使用的培養(yǎng)基 均為市售可得的常規(guī)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知其中的成分及含量。為了簡便起見，在 本文中有可能使用各種通用的縮寫，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠理解其含義。
[004引 實(shí)施例
[0050] 實(shí)施例1 ;HPV52L1密碼子優(yōu)化設(shè)計
[0051] 根據(jù)野生型 HPV52L1 氨基酸序列（GenBank ;CAA52590. 1，SEQ ID NO ;1)和畢赤酵 母偏愛性密碼子，合成52L1序列。將野生型HPV5化IDNA序列進(jìn)行改造，所有密碼子均采用 畢赤酵母中使用頻率較高或最高的密碼子，并考慮二級結(jié)構(gòu)的形成W及酶切位點(diǎn)的選擇， 最終得到本發(fā)明的HPV52L1基因的核巧酸序列SEQ ID NO ;2。
[0052] 實(shí)施例2 ;HPV52L1重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0053] 合成所得的52L1序列通過下列方法克隆入pPICZal地aB載體（Invitrogen)。W PCR的方式擴(kuò)增得到兩端分別帶有BstBI和化nl的52L1DNA片段，PCR引物；正向引物；5'C AGGTGATCTTCGMACGATGAGTGTTTGGAGAC3,炬S巧I) (SEQ ID NO ;7);反向引物；5，ATTGGTACCC TATTATCTTTTAACT3'（Kpnl) (SEQ ID NO ;8)。PCR 程序；94°C 5 分鐘，94°C 30 砂、55°C 30 砂、 72°C 1分50砂循環(huán)30次，72°C 10分鐘，1(TC 10分鐘，運(yùn)行結(jié)束。PCR產(chǎn)物W瓊脂糖凝膠 電泳鑒定并回收1500bp處條帶（Qiagen gel extraction kit)?；厥掌闻cpPICZal地aB WBstBI和化nl (New化gland Biol油）聯(lián)合酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分別回收約 1500bp和3600bp片段?；厥蘸?2L1與pPICZal地aB W摩爾比為5 : 1的比例用T4連接 酶（Takara)16°C過夜連接，第二天連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli D冊a，涂布于低鹽LB平板（含 25ug/mL Zeocin)，37°C過夜培養(yǎng)。挑取部分轉(zhuǎn)化后克隆抽提質(zhì)粒，雙酶切化indlll+Kpnl) 鑒定，瓊脂糖電泳檢測（圖1)。鑒定所得陽性重組克隆經(jīng)DM測序驗(yàn)證正確后保存，此重組 載體命名為pPIC巧化1。
[0054] 實(shí)施例3 ;HPV52L1重組表達(dá)菌株構(gòu)建與表達(dá)
[00巧]W SacI線性化pPIC巧化1，酶切反應(yīng)結(jié)束后酷；氯仿去除蛋白，再加入2. 5倍體積 無水己醇，1/10體積3M NaAc (抑5. 2)沉淀DNA，所得沉淀經(jīng)75%己醇洗涂、烘干后W少量無 菌dd&O溶解沉淀，電轉(zhuǎn)畢赤酵母宿主菌（Invitrogen)，涂布于YPDS平板（含180 y g/mL Zeocin)，3(TC培養(yǎng)3天，得數(shù)百克隆。從中挑取數(shù)十克隆接種于Yro平板（含1500yg/mL Zeocin)，篩選質(zhì)粒高拷貝菌株，3(TC培養(yǎng)2天。部分克隆生長較快，挑取生長情況最好的數(shù) 個克隆接種于5mL YTO液體培養(yǎng)基，24小時后更換BMMY培養(yǎng)基，0. 5%甲醇誘導(dǎo)48小時后 收集菌體。菌體經(jīng)玻璃珠破碎后，離也所得上清液W Western-blot鑒定（圖2)，所用一抗 為自制兔多抗。取表達(dá)量最高的菌株凍存于-8(TC，作為發(fā)酵罐培養(yǎng)工作種子。
[005引實(shí)施例4 ;HPV5化1重組蛋白的發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0057] 從工作種子庫取1支菌種甘油凍存管，即實(shí)施例3所得的表達(dá)HPV5化1的基因 工程菌，融化后吸取lOOuL接入5血YTO培養(yǎng)基，280轉(zhuǎn)/分鐘（rpm)，3(TC培養(yǎng)20小 時。菌體密度達(dá)ODe。。約為1-2。鏡檢無雜菌污染。將檢驗(yàn)合格的活化液ImL接入500mL YTO培養(yǎng)基，280巧m，3(TC培養(yǎng)20小時。菌體密度達(dá)ODe。。約為2-6。鏡檢無雜菌污染。發(fā) 酵用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基 BSMl(K2S〇4273g，M拆〇4l09g，CaS〇4 ? 2&017. 6g，H3PO44OO. 5mL，K0冊2g, 甘油600g，PTM160血，泡敵1血，去離子水加至15L)，不含有抗生素，配制后在3化發(fā)酵罐 (Bioengineering公司）中進(jìn)行實(shí)罐滅菌。滅菌條件為12TC，30分鐘，消后冷至30°C。將上 述活化后種液: 15接種于罐內(nèi)。發(fā)酵溫度為30. 0 + 0. 5°C，初始P冊.00 + 0. 05,起始轉(zhuǎn) 速 300巧m 培養(yǎng)，通氣量 0. 5vvm，DO (溶氧值）100 %，添加 PTM1 (CuS〇4 ? 5&06. Og，NalO. 008g, MnS〇43. Og, NaMo〇4〇. 2g, H3BO3O. 02g, &1SO42O. Og, C0CI2O. 5g, FeS〇4 ? 7&065. Og, biotinO. 2g, H2S〇45.0mU去離子水加至IL)痕量鹽類。初始增殖階段大約24小時左右，維持溶氧值不 低于20%，當(dāng)碳源消耗完畢時，溶氧值迅速地上升，菌體濕重達(dá)到約lOOg/L。初始兩小時 W每小時200mL/h的速率補(bǔ)加體積百分比50%的甘油溶液（每升添加12mL PTM1)。補(bǔ)料 兩小時后改為300mLA。通過調(diào)節(jié)攬拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓（<0.8bar)使溶氧水平維持在 30% W上。補(bǔ)加約4小時，菌體濕重約200g/L時，停止補(bǔ)料，溶氧值上升。同時將抑值控 制調(diào)為6. 00 + 0. 05,開始加入甲醇（每升添加12血PTM1)誘導(dǎo)。最初甲醇加入量控制在 30mLA。緩慢增加甲醇的加入量，甲醇誘導(dǎo)4小時后將補(bǔ)料速度設(shè)定為90mLA。維持溶氧 值高于體積百分比20%，溫度維持在3(TC，抑值控制為6. 00 + 0. 05。誘導(dǎo)40小時發(fā)酵結(jié) 束時放出發(fā)酵液。4°C離也收集菌體，菌體濕重達(dá)390g/L。
[005引 實(shí)施例5 ;HPV52L1蛋白純化
[0059] 收集的菌體破菌（破菌緩沖液；200mM MOPS, pH7. 0,0. 7化C1，0. 05% Tween-80) 離也后，取破菌后上清液經(jīng)過層析方法純化，得到自組裝成病毒樣顆粒的LI蛋白，具體 步驟如下；將表達(dá)HPV5化1VLP的畢赤酵母細(xì)胞，按1 : 5加入破菌緩沖液混合，充分混 勻后，高壓破碎W上細(xì)胞息液，并重復(fù)操作，使90 %的細(xì)胞破碎。將高壓破碎的破菌液， 于9000巧m，30min，1(TC離也分離，收集離也后上清液。將經(jīng)過離也澄清的破菌上清液通 過P0R0S50HS(Applied Biosystems公司層析柱進(jìn)行初步純化，洗脫方式為；100%緩沖 液A(0.5M化Cl，50mMM0PS抑7.0,0.05%Tween-80)至100%的緩沖液B(1.5M化Cl， 50mM MOPS抑7. 0,0.05% Tween-80)的線性梯度洗脫，收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE， Western-blot 檢測。
[0060] 將含有HPV52L1蛋白的洗脫組分合并后，使用CHT炬I0-RAD Typell)層析柱 進(jìn)一步純化，洗脫方式為；1〇〇%緩沖液A巧mM PB，0. 6M化Cl，50mM MOPSp冊.5,0. 05% Tween-80)至100%的緩沖液B(200mMPB，0.6M化Cl，p冊.5,0.05%Tween-80)的線性梯 度洗脫。收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE和Western-blot檢測，將含有HPV5化IVLP的組 分合并，即為最后的純化樣品。SDS-PA(iE電泳檢測L1蛋白純度，掃描結(jié)果顯示純化的病毒 樣顆粒純度大于90% (圖3)。經(jīng)過電鏡（上海復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系電鏡室）觀察純化樣品中 呈現(xiàn)病毒樣顆粒（圖4)，結(jié)果顯示顆粒直徑在60-100nm之間。
[0061] 實(shí)施例6 ;本發(fā)明的HPV52L1重組蛋白的表達(dá)量測定
[0062] 本實(shí)施例根據(jù)化a壯ord法測得的發(fā)酵后菌體破菌上清液中總蛋白含量和Elisa 夾也法測得的HPV5化IVLP的表達(dá)量，計算得到HPV5化IVLP在破菌后總蛋白中的含量。具 體步驟如下：
[0063] 1.使用化a壯ord法測定發(fā)酵菌體破菌上清液中總蛋白含量
[0064] 使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000Bra壯ord protein quantitation reagent試劑盒進(jìn)行測定。
[0065] 在7支 1. 5ml EP管內(nèi)一次加0y l，10y l，20y l，40y l，80y l，100y 1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品 (0. 5mg/ml)和實(shí)施例4中獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清液40 y 1 (稀釋100倍），用水補(bǔ)足至 總體積為100 yl，混勻。每一濃度設(shè)3個平行樣。每管加入900 yl Bra壯ord solution, 立即混勻，室溫放置10分鐘后分別測定ODggg光吸收值。根據(jù)6組BSA標(biāo)準(zhǔn)品作出蛋白濃 度對吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算得到線性方程式，再根據(jù)破菌上清液所得光吸收值與標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性方程式計算出發(fā)酵菌體破菌上清液的總蛋白含量。
[0066] 2.用Elisa夾也法測定HPV5化1VLP在發(fā)酵后菌體破菌上清液中的含量
[0067] 使用純化的HPV5化1VLP做標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，誘導(dǎo)前的菌體作為陰性對照。
[0068] 用包被液（1.6g化2〇)3,2. 95g NaHC〇3)將兔抗HPV5化1VLP多抗稀釋2000倍， 然后向酶標(biāo)板的各凹孔中各加入0. 1ml稀釋后的兔多抗，4°C過夜。移去包被液，用0. 3ml PBST(PBS，抑7. 0,0. 05% Tween-20)洗涂凹孔，再用0. 3ml封閉液巧％脫脂奶粉+PBST)于 37°C保溫2小時。
[0069] 用稀釋液（PBS，PH7.0) W連續(xù)二倍稀釋的方式，將實(shí)施例5中獲得的純化 HPV5化1VLP從濃度2 y g/ml梯度稀釋到0. 0625 y g/ml，W此作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。同時將實(shí)施例 4中獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清液稀釋200倍，然后分別向凹孔中加入0. 1ml梯度稀釋后的 不同濃度的HPV5化1VLP溶液或稀釋后的破菌上清液，于37C保溫1小時后，移去抗原液， 并用0.31111口851'洗涂凹孔。然后用抗體稀釋緩沖液任85，口^.0,2%脫脂奶粉）將祖8885 鼠抗HPV5化1VLP單抗（購自C肥MIC0N公司）1000倍稀釋后加入到凹孔中，每孔加0. 1ml， 37°C保溫1小時。移去單抗溶液，用0. 3ml PBST洗涂凹孔。再向各凹孔中加入用抗體稀釋 緩沖液稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgGO. 1ml，37C保溫0. 5小時。移去抗體溶液，并 用0. 3ml PBST洗涂凹孔，向凹孔中各加入0. 1ml DAB顯色液（購自Amresco公司），室溫 作用20分鐘。向每個凹孔中加入0. 05ml2M &S化終止液W終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測定 〇〇4日。吸光值。
[0070] 利用梯度稀釋的HPV5化1VLP的0〇45。的檢測結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，再通過 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線換算得HPV52L1蛋白的發(fā)酵表達(dá)量。
[0071] 本實(shí)施例的結(jié)果示于表1。由表1可W看出，本發(fā)明的HPV52L1基因的表達(dá)量最高 可達(dá)到140 y g/mg(破菌上清液中的HPV5化1VLP/破菌上清液總蛋白）。
[0072] 表1 ;本發(fā)明的HPV52L1基因的表達(dá)量
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種人乳頭瘤病毒基因，所述的基因?yàn)樘烊籐1蛋白基因經(jīng)畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu) 化，其特征在于，HPV基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,或SEQIDNO:6所 /_J、i〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV基因，其中該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠在畢赤酵母內(nèi)自組 裝成病毒樣顆粒。
3. -種在畢赤酵母中表達(dá)HPV基因的方法，包括下述步驟： A將權(quán)利要求1所述的一個HPV基因的核酸分子克隆至表達(dá)載體中； B將步驟A中所的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株中； C培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化體； D使用步驟C獲得的菌株表達(dá)重組的HPV蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征是，一種畢赤酵母表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征是，pPICZaB載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的畢赤酵母菌株，其特征是，選自畢赤酵母X-33、GS115、KM71 和SMD1168菌株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的畢赤酵母菌株，含有權(quán)利要求4或5之一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
8. -種制備抗人乳頭瘤病毒52, 31，或45型疫苗的方法，其特征是，包括采用權(quán)利要求 1-6所述的方法、菌株、載體、基因、蛋白的任一項(xiàng)，制備重組人乳頭瘤病毒52, 31，或45型L1 蛋白病毒樣顆粒，然后加入藥學(xué)上可用的疫苗佐劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是，所述的藥學(xué)上可用的疫苗佐劑為鋁佐劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，用于預(yù)防人乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的，選 自重組人乳頭瘤病毒52, 31，或45型L1蛋白病毒樣顆粒，包含其中一種或多種的組合物中 的用途。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征是，所述的疾病選自：腫瘤、宮頸上皮內(nèi)瘤樣 病變、外生殖器疣。
【文檔編號】C12N15/37GK104513826SQ201310454513
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】叢薇, 劉瑞峰, 許丹 申請人:上海澤潤生物科技有限公司