一種檢測秦川牛cfl2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應(yīng)用，其基因單核苷酸多態(tài)性包括：以包含CFL2基因的待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增秦川牛CFL2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定秦川牛CFL2基因第2213位的堿基多態(tài)性。由于這一突變位點(diǎn)與秦川牛肉用性狀（胸圍，胸寬，胸深和體重）密切關(guān)聯(lián)該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與秦川牛生長性狀密切相關(guān)分子遺傳標(biāo)記的方法，以用于秦川牛的輔助選擇和分子育種，加快秦川牛良種繁育速度。
【專利說明】—種檢測秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以秦川牛的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及一種秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在肉牛育種中，人們期望通過對生長性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。
[0003]分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection, MAS),該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。
[0004]基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。
[0005]單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander (1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有:顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。
[0006]根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類:基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(PerigenicSNPs, pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs, iSNPs)。
[0007]研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少，由于它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此，編碼區(qū)內(nèi)的cSNP的研究更受關(guān)注?；蚓幋a區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種:一種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP (Synonymous cSNP),即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP (Non-SynonymouscSNP),即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。
[0008]由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4`個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs:即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase ChainReaction-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)與 DNA 測序結(jié)合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS_PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法，但是，其檢測費(fèi)用昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強(qiáng)。
[0009]本研究檢測基因SNPs所使用的限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Length Polymorphism-PoIymerase Chain Reaction, RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后設(shè)計上下游引物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測的序列位點(diǎn)無特殊性要求。
[0010]Cofilin是一種低分子量的肌動蛋白結(jié)合蛋白，分子量為20kDa,在體內(nèi)調(diào)節(jié)肌動蛋白的裝配，該蛋白家族廣泛分布于生物體內(nèi)各種細(xì)胞內(nèi)，包括肌肉細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞。CFL2 (CofiIin2)基因是肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin家族的新成員，主要在哺乳動物的骨骼肌和心肌表達(dá).被認(rèn)為是肌肉組織肌動蛋白裝配的調(diào)節(jié)器，對正常肌肉功能和肌肉再生起著重要的作用。因此，CFL2基因遺傳變異或SNP位點(diǎn)在動物生產(chǎn)實踐中對肌肉性狀、生長發(fā)育性狀具有重要的作用。
[0011]關(guān)于動物CFL2基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于人、鼠、豬等動物，而未有秦川牛CFL2基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中國秦川牛CFL2基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如:產(chǎn)肉、生長發(fā)育等性狀)關(guān)聯(lián)的研究成為空白。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明解決的問題在于提供秦川牛CFL2基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應(yīng)用，利用PCR-RFLP方法針對其基因位點(diǎn)上的錯義突變可能導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，提前淘汰產(chǎn)生錯義突變的個體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種
群的建立。
[0013]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0014]一種秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括:
[0015]秦川牛CFL2基因第2213位為C或G的單核苷酸多態(tài)性。
[0016]上述秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為:
[0017]以包含CFL2基因的待測秦)11牛全基因組DNA為模板，以弓丨物對P為引物，PCR擴(kuò)增秦川牛CFL2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定秦川牛CFL2基因第2213位的單核苷酸多態(tài)性；[0018]所述的引物對P為:
[0019]上游引物:5’-TGCACTTGACTGCAGTTCTGTGGG-3’ 24nt ；
[0020]下游引物:5，-CACTCAATGGGGGAAAAAAGGC-3，22nt。
[0021]所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:
[0022]94°C 預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，68°C退火 30s，每個循環(huán)-1°C，72°C 延伸 25s，18個循環(huán)；941:變性308，501:退火30s，72。。延伸25s, 20個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
[0023]所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。
[0024]所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果CFL2基因第2213位堿基多態(tài)性為:CC型表現(xiàn):252bp 和 24bp ；CG 型表現(xiàn):276bp、252bp 和 24bp ；GG 型表現(xiàn):276bp。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0026]本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對黃牛CFL2基因第2213位點(diǎn)上的突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，當(dāng)位點(diǎn)由C突變?yōu)镚時，在轉(zhuǎn)錄過程相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)編碼氨基酸發(fā)生改變(肽鏈312位的脯氨酸變丙氨酸，Pro312Ala)，使具有重要生理功能的CFL2基因所編碼蛋白的空間二、三級構(gòu)型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學(xué)功倉泛。
[0027]本發(fā)明公開了 與秦川牛生長性狀相關(guān)的功能基因CFL2的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。
[0028]針對上述CFL2基因的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其檢測方法，通過設(shè)計特定的PCR引物擴(kuò)增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。
[0029]本發(fā)明對CFL2基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與秦川牛生長性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示CFL2基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。
[0030]本發(fā)明提供的檢測方法為CFL2基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國秦川牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的秦川牛種群。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為秦川牛血樣基因組DNA電泳檢測圖；
[0032]圖2為秦川牛CFL2基因PCR擴(kuò)增的276bp片段的電泳圖；
[0033]圖3為秦川牛CFL2基因第4外顯子276bp PCR產(chǎn)物的HaeIII酶切電泳檢測CFL2基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道2，3:GG基因型個體(276bp);泳道4，5:CG基因型個體(276bp，252bp，24bp);泳道 1,6:CC 基因型個體(252bp，24bp) ；M =Marker (600bp, 500bp,400bp, 300bp, 200bp, IOObp)另外，由于24bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見，但276bp和252bp片段能鑒別CC型和CG型；
[0034]圖4為秦川牛CFL2基因2213位SNP的不同基因型測序峰圖。
【具體實施方式】
[0035]本發(fā)明以CFL2基因保守序列設(shè)計引物擴(kuò)增CFL2基因第4外顯子276bp片段，以秦川?；蚪M為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測方法，使得CFL2基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的秦川牛種群提供依據(jù)。
[0036]a、秦川牛CFL2基因多態(tài)性的檢測
[0037]1、秦川牛血樣的采集及處理
[0038]取秦川牛血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0039]本發(fā)明采用秦川牛品種，具體如表1所示。
[0040]表1秦川牛樣品來源表
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括: 秦川牛CFL2基因第2213位為C或G的單核苷酸多態(tài)性。
2.一種秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 以包含CFL2基因的待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增秦川牛CFL2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定秦川牛CFL2基因第2213位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為: 上游引物:5 ’ -TGCACTTGACTGCAGTTCTGTGGG-3， 24nt ； 下游引物:5 ’ -CACTCAATGGGGGAAAAAAGGC-3 ’ 22nt。
3.如權(quán)利要求2所述的秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 程序為: 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，68。。退火30s，每個循環(huán)_1°C，72°C延伸25s，18個循環(huán)；94°C變性 30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸 25s, 20 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
4.如權(quán)利要求2所述的秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3%。
5.如權(quán)利要求2所述的秦川牛CFL2基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果CFL2基因第2213位堿基多態(tài)性為:CC型表現(xiàn):252bp和24bp ；CG 型表現(xiàn):276bp、252bp 和 24bp ；GG 型表現(xiàn):276bp。
【文檔編號】C12N15/11GK103695416SQ201310465407
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】陳宏 , 孫雨佳, 藍(lán)賢勇, 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)