黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法及其在肝癌治療中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，該方法包括以下步驟：⑴將黃蘑菇干燥粉碎后進(jìn)行水提并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮提取并離心收集濾液；濾液經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物；⑵丙酮提取物用正己烷-乙酸乙酯混合液溶解后過濾，得到含丙酮提取物的樣品溶液；含丙酮提取物的樣品溶液在制備色譜上分離，即得Fr1、Fr2、……、Fr13、Fr14共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品；⑶將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。本發(fā)明不但工藝簡(jiǎn)單，而且易于實(shí)施。同時(shí)，本發(fā)明所得的活性組分可應(yīng)用于肝癌治療中。
【專利說明】黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法及其在肝癌治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物化學(xué)及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法及其在肝癌治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。我國(guó)肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，發(fā)病年齡趨于年輕化。目前我國(guó)肝癌年死亡率為20/10萬左右，位居我國(guó)各種惡性腫瘤死亡率的第2位，并且近10年來一直呈上升趨勢(shì)。肝癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手，其危險(xiǎn)性不容忽視。[0003]研究表明，一些中藥復(fù)方或單味藥的有效成分能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其抗癌療效與中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。高等真菌中普遍存在多糖、留醇、生物堿、萜類、酶類具有提高人體免疫力、抗腫瘤、抗菌等生物功效的活性組分；其中1，3-β -D-葡聚糖被鑒定為抗腫瘤、抗艾滋病或免疫刺激性化合物；單萜、倍半萜、雙萜、三萜和類固醇具有保肝、排毒、降血壓和膽固醇等醫(yī)藥活性；真菌多糖是具有明顯的協(xié)同作用的免疫增強(qiáng)劑，如香菇多糖具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性，免疫作用和對(duì)膽固醇的溶解作用，并能使載癌狀態(tài)和因使用化療藥物而降低的活體免疫機(jī)能恢復(fù)，與各種藥物亦有協(xié)同作用。在高等真菌中還存在許多結(jié)構(gòu)新穎的物質(zhì)，這些物質(zhì)具有顯著的生理功效，如從口蘑、楊樹菇、金針菇、斑玉蕈等高等真菌中分離得到的各種凝集素，已被證實(shí)具有重要的醫(yī)學(xué)功能。
[0004]肝癌起病隱匿，病程進(jìn)展快，手術(shù)切除率低，對(duì)常規(guī)放化療手段缺乏敏感，死亡率高。因此，從高等真菌中尋找新的抗肝癌治療藥物意義重大。
[0005]黃蘑菇是生長(zhǎng)于青藏高原的珍稀野生食藥用菌。目前有限的定性研究表明，黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體中含有較豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、生物堿和少量有機(jī)酸、黃酮、強(qiáng)心苷、甾體三萜類、苷類、皂苷、揮發(fā)油、香豆素萜類、鞣質(zhì)、酚類化合物等，該類化合物具有抗流感、防治神經(jīng)炎、腳氣病、促進(jìn)兒童發(fā)育、抗氧化及抗腫瘤等生物活性。
[0006]制備液相色譜是近些年發(fā)展起來的分離純化技術(shù)。隨著天然藥物現(xiàn)代化的迅速發(fā)展，制備液相色譜作為一種快速高效的分離標(biāo)準(zhǔn)化組分的技術(shù)而備受天然產(chǎn)物化學(xué)各領(lǐng)域的青睞。目前很多樣品組分只能用制備液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，正相制備型高效液相色譜是制備色譜中應(yīng)用較多的分離質(zhì)量均一、穩(wěn)定、可靠組分的方法之一。
[0007]中國(guó)專利申請(qǐng)CN 200910154901.5《生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法》涉及了黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸；中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710069803.2《一種黃綠蜜環(huán)菌纖溶酶及其生產(chǎn)方法》涉及了黃綠蜜環(huán)菌代謝合成纖溶酶；中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710066667.1《一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化對(duì)羥基苯甲醇合成天麻素的方法》涉及了黃綠蜜環(huán)菌通過生物轉(zhuǎn)化合成天麻素；中國(guó)專利申請(qǐng)CN200610155189.7《一種黃綠蜜環(huán)菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用》、在審專利《一種抗癌的黃綠蜜環(huán)菌多糖及提取工藝》、《一種黃綠蜜環(huán)菌的深層發(fā)酵及其應(yīng)用》主要涉及黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)及多糖提取工藝。并未涉及黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體化學(xué)成分。上述文獻(xiàn)關(guān)于黃綠蜜環(huán)菌的研究，主要集中在生物轉(zhuǎn)化上，對(duì)黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體化學(xué)成分的研究很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝簡(jiǎn)單、易于實(shí)施的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法。
[0009]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供該黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法在肝癌治療中的應(yīng)用。
[0010]為解決上述問題，本發(fā)明所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，包括以下步驟:
⑴將黃蘑菇經(jīng)干燥粉碎后，按Ig:4mL^20 mL的料液比用分析純水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并離心收集濾液；所述濾液經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物；
⑵所述丙酮提取物中加入其體積的1飛倍正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣 品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以ΙΟμπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品；
⑶將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按下述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選:
①確認(rèn)iCelligence測(cè)試系統(tǒng)正確連接，37°C、5%C02培養(yǎng)箱工作正常；
②8孔細(xì)胞板內(nèi)按150μ L/孔加入培養(yǎng)基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測(cè)試臺(tái)上測(cè)基線；所述培養(yǎng)基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基；
③將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品中的每個(gè)組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；
④將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞H印G2，用胰酶按常規(guī)方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細(xì)胞重懸于所述培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)至2.85 X IO4個(gè)/mL，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個(gè)細(xì)胞的量將所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞H印G2懸液接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，室溫放置30 min ；
⑤將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品分兩批按每孔加5μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液的量接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，并置于所述iCelligence測(cè)試臺(tái)，放入所述培養(yǎng)箱中開始檢測(cè)；45 h后得到兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖；其中縱坐標(biāo)為細(xì)胞指數(shù)(cell index)，橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)效應(yīng)(RTCA)；
⑥根據(jù)所述兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖，當(dāng)細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)上升平緩或不上升的趨勢(shì)，則說明細(xì)胞分裂減緩或停止，即細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0011]所述步驟⑴中減壓濃縮的條件是指真空度為0.03、.1 MPa，溫度為3(T80 °C。
[0012]所述步驟⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷與乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。[0013]所述步驟⑵中制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260X50 mm ;采用A為正己烷、B為乙酸乙酯的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離:0~15 min, 100%A~100%A ; 15~35 min,60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm ;上樣量為1.0 g。
[0014]如上所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法所得的活性組分在肝癌治療中的應(yīng)用，其特征在于:該活性組分作為有效成分按常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的任何載體制成各類藥用制劑。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明采用溶劑提取、離心、工業(yè)制備色譜等常規(guī)方法，從黃蘑菇中分離得到了具有抗肝癌活性的標(biāo)準(zhǔn)化組分(參見圖1、圖2)，不但工藝簡(jiǎn)單，而且易于實(shí)施。
[0016]2、本發(fā)明利用iCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)，可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞貼壁和增殖過程，提供高信息量的細(xì)胞效應(yīng)圖譜，提供大量、重要的動(dòng)態(tài)反應(yīng)信息；無標(biāo)記、無創(chuàng)傷的電子檢測(cè)不會(huì)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)和分析；可高準(zhǔn)確/精確度的定量衡量細(xì)胞生長(zhǎng)，提供高于2個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程自動(dòng)收集數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)分析，大大改善僅僅在最終點(diǎn)分析的結(jié)果；在培養(yǎng)孔中檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)量，達(dá)到了活細(xì)胞品質(zhì)控制的目的(參見圖3、圖4)。
[0017]3、本發(fā)明以細(xì)胞生長(zhǎng)曲線為基本指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)化組分對(duì)貼壁、繁殖等細(xì)胞生理活性的影響，結(jié)果直觀、易判斷；所得的活性組分可用于研發(fā)制備抗肝癌治療藥物。
[0018]4、本發(fā)明拓展了抗肝癌藥物的原料來源，擴(kuò)大了黃蘑菇的用途，使黃蘑菇成為抗肝癌藥物的有效組分原料，顯著提高黃蘑菇的附加值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0020]圖1為本發(fā)明黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分的色譜分離圖A。
[0021]圖2為本發(fā)明黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分的色譜分離圖B。
[0022]圖3為本發(fā)明黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分的抗肝癌活性檢測(cè)圖A。
[0023]圖4為本發(fā)明黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分的抗肝癌活性檢測(cè)圖B。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1 黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，包括以下步驟:
⑴將黃蘑菇經(jīng)干燥粉碎后，按Ig:4mL的料液比用分析純水在40°C提取3次，每次10h，并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮按Ig: ImL的料液比在10°C提取3次，每次72h，并離心收集濾液；濾液在真空度為0.03 MPa、溫度為30°C的條件下經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物。
[0025]⑵丙酮提取物中加入其體積的I倍正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；含丙酮提取物的樣品溶液在以ΙΟμπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品。
[0026]其中:
制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260X50 mm;采用A為正己烷、B為乙酸乙酯的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min,0%Α、%Α ;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm ;上樣量為1.0 g。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷與乙酸乙酯按I mL:0.1 mL的比例混合的溶液。
[0027]⑶將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按下述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選:
①確認(rèn)iCelligence測(cè)試系統(tǒng)正確連接，37°C、5%C02培養(yǎng)箱工作正常。
[0028]②8孔細(xì)胞板內(nèi)按150 μ L/孔加入培養(yǎng)基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測(cè)試臺(tái)上測(cè)基線。[0029]其中:培養(yǎng)基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0030]③將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品中的每個(gè)組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液(即每mLDMSO中含有5 mg組分樣品)。
[0031]④將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞H印G2，用胰酶按常規(guī)方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)至2.85 X IO4個(gè)/mL，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個(gè)細(xì)胞的量將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞ifepG2懸液接種入8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，室溫放置30 min。
[0032]⑤將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品分兩批按每孔加5 μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液的量接種入8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，并置于iCelligence測(cè)試臺(tái)，放入培養(yǎng)箱中開始檢測(cè)；45 h后得到兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖；其中縱坐標(biāo)為細(xì)胞指數(shù)(cell index)，橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)效應(yīng)(RTCA)。
[0033]⑥根據(jù)兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖，當(dāng)細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)上升平緩或不上升的趨勢(shì)，則說明細(xì)胞分裂減緩或停止，即細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第U、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0034]實(shí)施例2 黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，包括以下步驟:
⑴將黃蘑菇經(jīng)干燥粉碎后，按Ig:20 mL的料液比用分析純水在90°C提取3次，每次Ih,并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮按Ig:20 mL的料液比在80°C提取3次，每次5h，并離心收集濾液；濾液在真空度為0.1 MPa、溫度為80°C的條件下經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物。
[0035]⑵丙酮提取物中加入其體積的6倍正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過
0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；含丙酮提取物的樣品溶液在以ΙΟμπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品。
[0036]其中:
制備色譜分離的條件同實(shí)施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷與乙酸乙酯按I mL: 10 mL的比例混合的溶液。
[0037]⑶將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選，確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0038]實(shí)施例3 黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，包括以下步驟:⑴將黃蘑菇經(jīng)干燥粉碎后，按Ig:12 mL的料液比用分析純水在65°C提取3次，每次
5.5h，并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮按Ig: IOmL的料液比在45°C提取3次，每次38h，并離心收集濾液；濾液在真空度為0.06 MPa、溫度為55°C的條件下經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物。
[0039]⑵丙酮提取物中加入其體積的3.5倍正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；含丙酮提取物的樣品溶液在以10 μ m硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr IO、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品。
[0040]其中:
制備色譜分離的條件同實(shí)施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷與乙酸乙酯按I mL:5 mL的比例混合的溶液。
[0041]⑶將14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選，確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0042]上述實(shí)施例廣3中黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法所得的活性組分作為有效成分按常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的任何載體制成各類藥用制劑應(yīng)用于肝癌治療中。
【權(quán)利要求】
1.黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，包括以下步驟: ⑴將黃蘑菇經(jīng)干燥粉碎后，按Ig:4mL^20 mL的料液比用分析純水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并離心收集菌渣，該菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并離心收集濾液；所述濾液經(jīng)減壓濃縮至膏狀，即得丙酮提取物； ⑵所述丙酮提取物中加入其體積的1飛倍正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以ΙΟμπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品； ⑶將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按下述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選: ①確認(rèn)iCelligence測(cè)試系統(tǒng)正確連接，37°C、5%C02培養(yǎng)箱工作正常； ②8孔細(xì)胞板內(nèi)按150μ L/孔加入培養(yǎng)基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測(cè)試臺(tái)上測(cè)基線；所述培養(yǎng)基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基； ③將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品中的每個(gè)組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液； ④將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞H印G2，用胰酶按常規(guī)方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細(xì)胞重懸于所述培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)至2.85 X IO4個(gè)/mL，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個(gè)細(xì)胞的量將所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞H印G2懸液接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，室溫放置30 min ；` ⑤將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品分兩批按每孔加5μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液的量接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，并置于所述iCelligence測(cè)試臺(tái)，放入所述培養(yǎng)箱中開始檢測(cè)；45 h后得到兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖；其中縱坐標(biāo)為細(xì)胞指數(shù)，橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)效應(yīng)； ⑥根據(jù)所述兩張黃蘑菇抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖，當(dāng)細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)上升平緩或不上升的趨勢(shì)，則說明細(xì)胞分裂減緩或停止，即細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
2.如權(quán)利要求1所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，其特征在于:所述步驟⑴中減壓濃縮的條件是指真空度為0.03~0.1 MPa，溫度為30~80 °C。
3.如權(quán)利要求1所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，其特征在于:所述步驟⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷與乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法，其特征在于:所述步驟⑵中制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260X50 mm;采用A為正己烷、B為乙酸乙酯的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm ;上樣量為1.0 g。
5.如權(quán)利要求1所述的黃蘑菇標(biāo)準(zhǔn)化組分制法所得的活性組分在肝癌治療中的應(yīng)用，其特征在于:該活性組分作為有效成分按常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的任何載體制成各類藥用制劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103494844SQ201310469545
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】王啟蘭, 黨軍, 陶燕鐸, 梅麗娟, 史強(qiáng)強(qiáng), 顧朋嬡, 馬琳, 李園園 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所