一種用于檢測egfr基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，公開了一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，利用鉗夾技術封閉野生型EGFR基因序列，從而提高sanger測序法的靈敏度和EGFR基因突變的檢出率。本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全，不需要較多昂貴試劑的使用，經濟高效；同時還具有操作時間短的優(yōu)點，整個檢測過程可在4～6小時內完成。
【專利說明】—種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]EGFR (epidermal growth factor receptor)即表皮生長因子受體，正常情況下包埋在細胞表面的細胞膜中，是一種對腫瘤細胞的繁殖、生長、修復和存活等起重要作用的膜蛋白。
[0003]目前臨床上治療癌癥的部分靶向藥物如單抗類藥物(愛必妥Eribtux、西妥昔單抗Cectibix/帕尼單抗Panitumumab)、小分子類藥物(易瑞沙Iressa/吉非替尼Gefitinib、特羅凱Tarceva/尼羅替尼Erlotinib),通過阻斷EGFR的活性抑制其磷酸化和信號傳導,從而起到抗腫瘤作用，同時也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。
[0004]易瑞沙和特羅凱是近年來開發(fā)的兩種特異性較高的治療非小細胞肺癌的腫瘤靶向治療藥物，它們都屬于表面生長因子受體(EGFR)-絡氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物，該類藥物通過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中必須的表皮生長因子受體絡氨酸激酶活性而阻斷腫瘤細胞的信號傳導，抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移、血管生成并促進腫瘤細胞的凋亡。
[0005]臨床實踐顯示易瑞沙和特羅凱這兩種藥物療效存在很大的個體差異，僅有25%-35%的個體很有很好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因絡氨酸激酶區(qū)域存在多種突變，這些突變主要集中在外顯子18~21上，其中以19號外顯子內缺失突變以及21號外顯子L858R最為常見，這些突變能夠很好地預測易瑞沙和特羅凱的治療效果，為腫瘤用藥提供指導依據(jù)。
[0006]目前用于基因突變檢測的方法有Sanger測序法、高效液相色譜法、實時熒光定量PCR法等。Sanger基因測序技術經過了 30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經可以對長達1，OOObp的DNA片段進行測序，而且對每一個堿基的讀取準確率高達99.999%。由于具有很高的讀取準確率，Sanger法測序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標準。
[0007]腫瘤組織中，EGFR野生型細胞與突變型細胞混雜，而Sanger測序法的靈敏度僅為10~20%，即當突變型細胞占整體檢測細胞的10~20%時才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測序法的應用。
[0008]肽核酸(peptide nucleic acids, PNA) 一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結構。由于PM不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補DNA具有I個堿基不匹配時，其溶解溫度會下降8 V~20°C，2個堿基不匹配時則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優(yōu)點，近十年來，人們?yōu)槠湓谠S多高【技術領域】找到了用途。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明采用PNA鉗夾技術封閉野生型EGFR基因序列，從而提高檢測EGFR基因熱點突變的敏感度和突變檢出率。
[0010]為解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn):
[0011]一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒，包括PCR反應液、PCR引物、探針、PNA試劑、酶消化液、測序反應液、磁珠和產物純化液，所述PCR反應液包含PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶，所述PCR弓丨物包括4對相互獨立的引物，第一對引物的正向引物序列為SEQ.1D N0.1，反向引物序列為SEQ.1D N0.2，第二對引物的正向引物為SEQ.1D N0.3，反向引物為SEQ.1D N0.4，第三對引物的正向引物為SEQ.1D N0.5，反向引物為SEQ.1D N0.6，第四對引物的正向引物為SEQ.1D N0.7，反向引物為SEQ.1D N0.8 ;所述探針包括4組相互獨立的探針，第一組探針的序列為SEQ.1D N0.9，第二組探針的序列為SEQ.1D N0.10，第三組探針的序列為SEQ.1D N0.11，第四組探針的序列為SEQ.1D N0.12，所述四組探針的5’端的熒光基團均為FAM，3’端的熒光基團均為BHQl ;所述PNA試劑包含五組相互獨立的PNA試劑，第一組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1DN0.13，第二組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.14，第三組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.15，第四組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.16，第五組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.17 ;所述測序反應液中含有Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。[0012]上述方案中，所述PCR 緩沖液由 100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L dNTPs ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/y I ;所述4對相互獨立的引物，每對PCR引物中均含有l(wèi)Oymol/L PCR正向引物和ΙΟμπιοΙ/L PCR反向引物；所述4組相互獨立的探針，每組探針的摩爾濃度均為10 μ mol/L ;所述五組相互獨立的PNA試劑，每組PNA試劑中PNA序列的摩爾濃度均為10 μ mol/L。
[0013]上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
[0014]上述方案中，所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
[0015]上述方案中，所述測序反應液含有5XBigdye、2.5XBigdye緩沖液和3 μ mol/L的測序引物。
[0016]上述方案中，所述產物純化液為0.75M氯化鈉溶液。
[0017]上述方案中，在所述4對PCR引物的正向引物的5’端均插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述4對PCR引物的反向引物的5 ’端均插入通用Ml3序列:CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測序引物序列為:
[0018]TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0019]一種利用上述試劑盒檢測EGFR基因熱點突變的方法，具體包括如下步驟:
[0020](I)目的基因熒光定量PCR擴增:使用試劑盒中熒光定量PCR反應液、PCR引物、探針和PNA試劑，對樣品DNA進行PCR擴增反應，得到目的基因的定量結果和PCR產物；[0021 ] (2)根據(jù)步驟(1)中的定量結果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，得到純化后PCR產物；
[0022](3)使用試劑盒中的測序反應液，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行測序PCR反應，得到測序PCR產物；
[0023](4)使用試劑盒中的磁珠和產物純化液，對步驟(3)得到的測序PCR產物進行純化，得到純化后測序PCR產物；
[0024](5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產物加樣至測序儀進行序列分析，測序所得基因序列與NCBI (美國國立生物技術信息中心)數(shù)據(jù)庫中EGFR基因標準序列進行比對，并查看峰圖，判斷是否存在EGFR基因熱點突變:峰圖中EGFR基因熱點突變區(qū)域峰圖下有典型的突變套峰，或者完全為突變峰圖，可知樣本中部分或全部細胞含有EGFR熱點區(qū)域突變。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026](I)本發(fā)明試劑盒包含PNA試劑，在對樣本DNA進行PCR擴增反應中，利用PNA試劑封閉野生型BRAF基因序列，提高sanger測序法的靈敏度和BRAF基因突變的檢出率。
[0027](2)本發(fā)明檢測方法操作簡單、安全，同時不需要較多昂貴試劑的使用，經濟高效。
[0028](3)本發(fā)明檢測方法操作時間短，整個檢測過程可在4~6小時內完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為EGFR基因18外顯子突變熱點區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結合位點，方框代表探針序列或探針結合位點，下劃虛線代表PNA序列或PNA結合位點,斜體字母代表突變位點。
[0030]圖2為EGFR基因19外顯子突變熱點區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結合位點，方框代表探針序列或探針結合位點，下劃虛線代表PNA序列或PNA結合位點,斜體字母代表突變位點。
[0031]圖3為EGFR基因20外顯子突變熱點區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結合位點，方框代表探針序列或探針結合位點，下劃虛線代表PNA序列或PNA結合位點,斜體字母代表突變位點。
[0032]圖4為EGFR基因21外顯子突變熱點區(qū)域序列，其中下劃線代表引物序列或引物結合位點，方框代表探針序列或探針結合位點，下劃虛線代表PNA序列或PNA結合位點,斜體字母代表突變位點。
[0033]圖5為實施例1中EGFR基因18、19、20、21外顯子的熒光定量PCR擴增曲線。
[0034]圖6為實施例1中EGFR基因18、19、20、21外顯子的測序圖。
【具體實施方式】
[0035]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖、表格、實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于下面的實例。
[0036]實施例1
[0037]1、試劑盒中PCR引物序列、探針序列和PNA序列的合成
[0038]1.1根據(jù)EGFR基因熱點突變區(qū)域和測序片段的要求(見圖1~圖4)，設計如下四對相互獨立的引物序列和探針序列，并用人工合成的方法合成:
【權利要求】
1.一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液、PCR引物、探針、PNA試劑、酶消化液、測序反應液、磁珠和產物純化液，所述PCR反應液包含PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶，所述PCR弓丨物包括4對相互獨立的引物，第一對引物的正向引物序列為SEQ.1D N0.1，反向引物序列為SEQ.1D N0.2，第二對引物的正向引物為SEQ.1DN0.3，反向引物為SEQ.1D N0.4，第三對引物的正向引物為SEQ.1D N0.5，反向引物為SEQ.1DN0.6，第四對引物的正向引物為SEQ.1D N0.7，反向引物為SEQ.1D N0.8 ;所述探針包括4組相互獨立的探針，第一組探針的序列為SEQ.1D N0.9，第二組探針的序列為SEQ.1D N0.10，第三組探針的序列為SEQ.1D N0.11，第四組探針的序列為SEQ.1D N0.12，所述四組探針的5’端的熒光基團均為FAM，3’端的熒光基團均為BHQl ;所述PNA試劑包含五組相互獨立的PNA試劑，第一組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.13，第二組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.14，第三組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.15，第四組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.16，第五組PNA試劑中PNA序列為SEQ.1D N0.17 ;所述測序反應液中含有Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。
2.根據(jù)權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由lOOmmol/LTris-HCl,500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2 組成；所述 dNTPs 的摩爾濃度為 2.5mmol/L dNTPs ;所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μ I ;所述4對相互獨立的引物，每對PCR引物中均含有10ymol/L PCR正向引物和lOymol/L PCR反向引物；所述4組相互獨立的探針，每組探針的摩爾濃度均為10 μ mo I/L ;所述五組相互獨立的PNA試劑，每組PNA試劑中PNA序列的摩爾濃度均為lOymol/L。
3.根據(jù)權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶I和堿性磷酸酶。
4.根據(jù)權利要求3所述試劑盒，其特征在于所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5:2。
5.根據(jù)權利要求1所述 試劑盒，其特征在于，所述測序反應液含有5XBigdye、2.5 XBigdye緩沖液和3μπι01/1的測序引物。
6.根據(jù)權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產物純化液為0.75Μ氯化鈉溶液。
7.根據(jù)權利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述4對PCR引物的正向引物的5’端均插入通用Μ13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述4對PCR引物的反向引物的5’端插入通用 M13 序列:CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測序引物序列為:TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一種使用權利要求1~7所述試劑盒檢測EGFR基因熱點突變的方法，其特征在于它包括如下步驟: (1)目的基因熒光定量PCR擴增:使用試劑盒中的PCR反應液、PCR引物、探針和PNA試劑，對樣品DNA進行PCR擴增反應，得到目的基因的熒光定量結果和PCR產物； (2)根據(jù)步驟(1)中的定量結果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，得到純化后PCR產物； (3)使用試劑盒中的測序反應液，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行測序PCR反應，得到測序PCR產物； (4)使用試劑盒中的磁珠和產物純化液，對步驟(3)得到的測序PCR產物進行純化，得到純化后測序PCR產物；(5)將步驟(4)得到的純化后測序PCR產物加樣至測序儀進行序列分析，測序所得基因序列與EGFR基因標準序列進行比對，并查看峰圖，判斷是否存在EGFR基因熱點突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484551SQ201310469439
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權日:2013年10月9日
【發(fā)明者】葉倫, 李雪梅, 付金玲, 陳剛 申請人:武漢康錄生物技術有限公司