多級(jí)pcr檢測(cè)病原體的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了多級(jí)PCR檢測(cè)病原體的方法和試劑盒。本發(fā)明方法通過(guò)在全封閉體系中，用兩對(duì)或多對(duì)所述病原體特異性引物，通過(guò)多級(jí)PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中的病原體的核酸物質(zhì)，并通過(guò)測(cè)序等方法準(zhǔn)確地確定病原體的種類或型別。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了在全封閉體系內(nèi)、可簡(jiǎn)便地在多級(jí)PCR過(guò)程中對(duì)各級(jí)之間實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的按需轉(zhuǎn)移，從而根本上消除了PCR的交叉干擾，使作為臨床檢測(cè)的極度靈敏的、但卻又無(wú)法廣泛實(shí)際應(yīng)用的多級(jí)PCR反應(yīng)，能夠在普通醫(yī)院環(huán)境中進(jìn)行。
【專利說(shuō)明】多級(jí)PCR檢測(cè)病原體的方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物和檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及多級(jí)PCR檢測(cè)病原體的方法和試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病原體導(dǎo)致人類或其他動(dòng)物患病的主要原因。以HPV為例，人乳頭瘤病毒是乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)的成員，是具有8000bp環(huán)狀基因組的DNA腫瘤病毒。已知，人乳頭瘤病毒(HPV)與某些腫瘤的發(fā)病率顯示強(qiáng)烈的相關(guān)。
[0003]HPV在99%宮頸癌病人中可檢測(cè)到。以流行病學(xué)資料為基礎(chǔ)，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宮頸癌中不會(huì)造成相同的風(fēng)險(xiǎn)水平。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)基因型可分為低風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)和聞風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，除了這些，也存在未分類的基因型。因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)在很大的范圍內(nèi)變化，并且HPV感染的發(fā)病率很高，所以確定基因型極為重要。
[0004]該病原體(如病毒)的目前主要檢測(cè)方法有:特異性PCR(Type-specific PCR)法:該法根據(jù)E6、E7基因的變異區(qū)設(shè)計(jì)型特異性的引物進(jìn)行PCR分析(Walboomers，1999)，其靈敏度大約在幾十至數(shù)百個(gè)HPV拷貝每反應(yīng)，隨HPV型別不同而稍有差異。然而，因?yàn)槊糠輼颖径夹枰瑫r(shí)作多份PCR，則導(dǎo)致無(wú)法高通量的使用。
[0005]PCR是涉及通過(guò)多個(gè)循環(huán)，指數(shù)擴(kuò)增某種多核苷酸序列的技術(shù)。PCR技術(shù)是眾所周知的，并且已經(jīng)被廣泛使用。
[0006]PCR技術(shù)一般包括以下步驟`:變性多核苷酸，然后將至少一對(duì)引物寡核苷酸退火到變性的多核苷酸上(使引物與變性的多核苷酸模板雜交)。退火步驟之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的變性多核苷酸作為合成模板，催化合成一條新的摻入了引物寡核苷酸的多核苷酸鏈。這一系列步驟(變性、引物退火和引物延伸)構(gòu)成一個(gè)PCR循環(huán)。
[0007]隨著循環(huán)的重復(fù)，新合成的多核苷酸的量指數(shù)增加，因?yàn)橛奢^早循環(huán)新合成的多核苷酸可用作后續(xù)循環(huán)的合成模板。
[0008]DNA的變性一般發(fā)生在約90-95°C，引物一般在約40_60°C退火至變性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步驟一般在約70-75°C進(jìn)行。因此，在PCR循環(huán)中，必須改變反應(yīng)混合物(反應(yīng)體系)的溫度，在多循環(huán)PCR實(shí)驗(yàn)中要多次改變。
[0009]PCR技術(shù)具有廣泛的生物學(xué)應(yīng)用，包括例如，DNA序列分析、探針產(chǎn)生、克隆核酸序列、定位誘變、檢測(cè)基因突變、診斷病毒感染、分子“指紋分析”和監(jiān)測(cè)生物液體和其他來(lái)源中的污染微生物。
[0010]然而,在實(shí)際應(yīng)用中，無(wú)論的常規(guī)PCR反應(yīng)還是多重PCR反應(yīng)體系,如果環(huán)境或操作過(guò)程中引入極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。為了防止污染，一些實(shí)驗(yàn)不得不在高度潔凈的操作設(shè)備或操作室進(jìn)行。
[0011]在PCR反應(yīng)過(guò)程中，各種試驗(yàn)條件控制不當(dāng)很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，降低其靈敏度和特異性。
[0012]此外，現(xiàn)有PCR技術(shù)能夠檢測(cè)的靈敏度還難以令人滿意，尤其是在對(duì)含量極低的核酸樣品(如僅含1-10個(gè)拷貝目標(biāo)序列的樣品)。在活檢、尸檢樣品中檢測(cè)病原體(如HPV)時(shí)，因無(wú)關(guān)核酸物質(zhì)的存在，檢測(cè)靈敏度一直難以提高。
[0013]沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)是有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，其原體具有感染性，侵入細(xì)胞后發(fā)育形成始體也稱為網(wǎng)狀體，不具感染性，在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)和復(fù)制約24~40小時(shí)后，轉(zhuǎn)化為原體，并釋放到細(xì)胞外，再感染新的宿主細(xì)胞。
[0014]沙眼衣原體是引起非淋菌性尿道炎的主要病原體，可由宮頸上行到子宮和輸卵管可引起無(wú)癥狀的上生殖道感染，導(dǎo)致異位妊娠、原發(fā)性不育。臨床表現(xiàn)為婦女的子宮頸管炎，子宮內(nèi)膜炎，急性輸卵管炎和盆腔炎。孕婦患有沙眼衣原體感染時(shí)，還可能引起胎兒流產(chǎn)，早產(chǎn)和新生兒感染沙眼衣原體性結(jié)膜炎，沙眼衣原體性肺炎。
[0015]在國(guó)外的一些研究中，從11%的無(wú)癥狀士兵，11%城市急診部門無(wú)癥狀男性和7%無(wú)癥狀的大學(xué)生中分離到沙眼衣原體。近年來(lái)，沙眼衣原體感染患者有明顯的上升趨勢(shì)，耐藥率顯著增加。
[0016]目前，沙眼衣原體主要依靠宮頸分泌物實(shí)驗(yàn)室檢查。常用的檢測(cè)方法有兩種。一是細(xì)胞培養(yǎng)，該方法特異性高達(dá)100%，但沙眼衣原體細(xì)胞無(wú)法人工培養(yǎng)，只能用傳代細(xì)胞或原代細(xì)胞培養(yǎng)，造成檢測(cè)的困難。二是抗原檢測(cè)法，包括直接熒光抗體法及酶免疫分析。此外，還有一些基于核酸的檢測(cè)方法，和不基于核酸的檢測(cè)方法如Gen-Probe Pace2C system等。
[0017]然而，現(xiàn)有的檢測(cè)方法對(duì)低宮頸癌發(fā)病人群需做大量的陰道鏡，且陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，常常導(dǎo)致漏檢。而且，某些核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)一些變異株會(huì)失效。如對(duì)沙眼衣原體377bp刪除的變異株就無(wú)法使用現(xiàn)有手段進(jìn)行檢測(cè)。再次，沙眼衣原體檢測(cè)的重復(fù)性差，核酸檢測(cè)(NAA)對(duì)疾病盛行率較低的人群進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，得到難以接受的低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，必須通過(guò)多次試驗(yàn)減少誤差。最后，核酸測(cè)試方法很容易造成交叉反應(yīng)(Cross-reaction),造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。
[0018]綜上所述，本領(lǐng)域目前尚缺乏一種準(zhǔn)確，快速，高效的沙眼衣原體檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明的目的就是提供一種靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強(qiáng)的PCR反應(yīng)設(shè)備和方法。
[0020]本發(fā)明的第一方面，提供了一種鑒別病原體種類或型別的方法，包括步驟:
[0021](a)在封閉的第一級(jí)PCR反應(yīng)腔或隔室中，以含有或可能含有病原體核酸的樣本為模板，通過(guò)所述病原體特異性的第一引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物Pi ；
[0022](b)將第一擴(kuò)增產(chǎn)物從第一級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第二級(jí)PCR隔室中，作為第二級(jí)PCR的模板，并在封閉的第二級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第二引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2 ；
[0023](c)任選地，將上一步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物Pi從第i級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第i+Ι級(jí)PCR隔室中，作為第i+Ι級(jí)PCR的模板，并在封閉的第i+Ι級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第i + I引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第i+Ι擴(kuò)增產(chǎn)物Pi + 1，其中i為> 2的正整數(shù)；本步驟可進(jìn)行一次或多次；
[0024](d)對(duì)上一步驟中獲得的所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2或所述第i + I擴(kuò)增產(chǎn)物Pi+1，進(jìn)行測(cè)序，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列；和
[0025](e)將測(cè)得的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與病原體標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別出病原體的種類或型別。
[0026]較佳地，所述病原體選自下組:病毒、立克次體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、衣原體。
[0027]在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)和(C)中，將第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pj從第j級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第j + I級(jí)PCR隔室過(guò)程中，第j級(jí)PCR隔室和第j + I級(jí)PCR隔室都處于封閉狀態(tài)，其中j為> I的正整數(shù)，并且在第j級(jí)PCR隔室和第j + I級(jí)PCR隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從Pj級(jí)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至Pj+1級(jí)隔室(或下游隔室)。
[0028]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)、(b)和(C)的整個(gè)過(guò)程中，所有的PCR隔室都處于封閉狀態(tài)。[0029]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，第一級(jí)PCR隔室中放置有可攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，從而在PCR反應(yīng)過(guò)程中或之后，形成攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的固體顆粒是磁性微球。
[0031]在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)和(C)中，利用磁鐵或電磁鐵，通過(guò)所述攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，將第j擴(kuò)增產(chǎn)物P」從第j級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第j + I級(jí)PCR隔室，其中j為≥1的正整數(shù)。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的病原體選自下組:病毒、立克次體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、衣原體；
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌包括衣原體目(Chlamydiales)細(xì)菌；較佳地,所述的細(xì)菌為衣原體科(Chlamydiaceae)細(xì)菌；更佳地,所述的細(xì)菌為衣原體屬(Chlamydia)細(xì)菌；最佳地，所述的細(xì)菌為沙眼衣原體。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌包括螺旋體目(Spirochaetales)細(xì)菌；較佳地，所述的細(xì)菌為螺旋體科(SpiiOChaetes)細(xì)菌；更佳地，所述的細(xì)菌為疏螺旋體屬(Chlamydia)細(xì)菌；最佳地，所述的細(xì)菌為韋氏包柔螺旋體。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)菌包括奈瑟菌目(Neisseriales)細(xì)菌,較佳地為奈瑟菌科(Neisseriaceae)細(xì)菌,更佳地為奈瑟菌屬(Neisseria)細(xì)菌,最佳地為淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述病原體為包括病毒；較佳地為HPV。
[0037]在另一優(yōu)選例中，被檢測(cè)的病原體選自下組:沙眼衣原體、韋氏包柔螺旋體、淋病奈瑟氏菌；并且所述的第一引物對(duì)選自下組:C trachomatis HiFi外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNATech N0.5005)、LD1/LD2、C trachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.4003) ?
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述的第二引物對(duì)選自下組:
[0039]C trachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.5006)、TEC1/LD2、Ctrachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.4004) ?
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的第一引物對(duì)和第二引物對(duì)是針對(duì)同一病原體的。例如，Ctrachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.5005) + C trachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.5006) ;LD1/LD2 + TEC1/LD2 ;或C trachomatis HiFi外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.4003) +C trachomatis HiFi 外側(cè)引物對(duì)(HiFi DNA Tech N0.4004) ?[0041]在另一優(yōu)選例中，當(dāng)i=2時(shí)，所述的第三引物對(duì)與第二引物對(duì)相同。
[0042]在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中，將C trachomatis HiFi DNA測(cè)序引物N0.8009、TECl、Gonococcal opa HiFi DNA測(cè)序引物N0.7008作為引物，進(jìn)行測(cè)序。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括:用步驟(dl)替換步驟(d)和(e):
[0044](dl)對(duì)上一步驟中獲得的所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2或所述第i + I擴(kuò)增產(chǎn)物Pi+1，用病原體種類或型別特異性探針進(jìn)行雜交，并根據(jù)雜交結(jié)果鑒別出病原體的種類或型別。
[0045]在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，病原體是HPV，并且所述的HPV標(biāo)準(zhǔn)序列包括選自下組的一種或多種 HPV 型別的標(biāo)準(zhǔn)序列:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82、26、53、6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、和 81。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的HPV標(biāo)準(zhǔn)序列包括已知的所有HPV型別的標(biāo)準(zhǔn)序列。
[0047]在另一優(yōu)選例中，步驟(a)、(b)和(C)在多級(jí)PCR反應(yīng)管中進(jìn)行，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)管包括η個(gè)隔室，其中η為2-5000的任一正整數(shù)。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)管包括M個(gè)多級(jí)組，各多級(jí)組分別具有2、3、4或5個(gè)相互連通的隔室，其中M為1-1000的任一正整數(shù)。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的PCR反應(yīng)管的隔室呈直鏈構(gòu)型、支鏈構(gòu)型、或環(huán)形構(gòu)型；和/或
[0051]所述的隔室呈矩陣排列，`所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2_100的正整數(shù)，b為
2-100的正整數(shù)。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的隔室具有腔蓋(20)，并且對(duì)于相互連通的多個(gè)隔室而言，當(dāng)各自的腔蓋全部蓋上后，就構(gòu)成一個(gè)封閉空間。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述連接通道位于反應(yīng)腔或隔室上部。
[0054]在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述上游隔室蓋上腔蓋后，所述連接通道在上游隔室的入口隔室上部，并且位于腔蓋下沿下方，從而使得攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒被抬升從而離開(kāi)位于隔室下方的反應(yīng)體系后，進(jìn)入所述入口，經(jīng)過(guò)連接通道，再通過(guò)所述連接通道在下游隔室的出口，進(jìn)入下游隔室。
[0055]本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于特異性擴(kuò)增病原體的PCR反應(yīng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:
[0056](i)多級(jí)PCR反應(yīng)管，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)；
[0057](ii)固體顆粒，所述固體顆粒位于所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的至少一個(gè)上游隔室中，并且在所述上游隔室內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，所述固體顆粒能吸附在擴(kuò)增過(guò)程中形成的擴(kuò)增產(chǎn)物；以及
[0058](ii1-1)用于特異性擴(kuò)增所述病原體的多個(gè)引物對(duì)，所述的各引物對(duì)分別位于不同的容器中，并且在PCR擴(kuò)增時(shí)各所述引物對(duì)被分別置于第j級(jí)PCR隔室中，從而在第j級(jí)PCR隔室中用所述的第j引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，形成第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pp其中j為> I的正整數(shù)；或
[0059](ii1-2)分別位于第j級(jí)PCR隔室中的所述病原體特異性的第j引物對(duì)，從而在第j級(jí)PCR隔室中用所述的第j引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，形成第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pp其中j為≥1的正整數(shù)。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述病原體選自下組:病毒、立克次體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、衣原體。[0061 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的固體顆粒是磁性微球。
[0062]在另一優(yōu)選例中，各PCR隔室中引物對(duì)是不同的。
[0063]本發(fā)明的第三方面，提供了一種對(duì)病原體的核酸物質(zhì)進(jìn)行多級(jí)PCR反應(yīng)方法，所述方法包括步驟:[0064](a)提供一多級(jí)PCR反應(yīng)管，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)；
[0065](b)在所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的PCR反應(yīng)隔室中加入進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑，形成液相PCR反應(yīng)體系，并且在一個(gè)或多個(gè)上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，但在下游隔室中不加入PCR模板材料，并且各隔室內(nèi)的液相PCR反應(yīng)體系互不連通且互不接觸；
[0066](c)封閉所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的上游隔室和下游隔室，從而對(duì)于相互連通的多個(gè)隔室而言，當(dāng)各自的腔蓋全部蓋上后，構(gòu)成一個(gè)封閉空間；
[0067](d)在上游隔室Rl中，用所述病原體特異性的第一引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Pl以及吸附有所述第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Pl的固體顆粒；
[0068](e)抬升所述吸附PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，離開(kāi)位于所述上游隔室下方的液相PCR反應(yīng)體系后，進(jìn)入所述連接通道的入口，經(jīng)過(guò)連接通道，進(jìn)入位于所述上游隔室下游的另一下游隔室R2，作為所述下游隔室中的PCR模板材料；
[0069](f)在所述下游隔室R2中，用所述病原體特異性的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物P2 ；
[0070](g)任選的，將上一步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物Pi從第i級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第i+Ι級(jí)PCR隔室中，作為第i+Ι級(jí)PCR的模板，并在封閉的第i+Ι級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第i + I引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第i+Ι擴(kuò)增產(chǎn)物Pi + 1，其中i為> 2的正整數(shù)；并且本步驟可進(jìn)行一次或多次。
[0071]較佳地，所述病原體選自下組:病毒、立克次體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、衣原體。
[0072]在另一優(yōu)選例中，所述的進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑選自下組:PCR引物、緩沖液、dNTP、聚合酶、鎂離子。
[0073]在另一優(yōu)選例中，位于所述上游隔室中的PCR引物或引物對(duì)與位于所述下游隔室中PCR引物或引物對(duì)，是不同的或相同的。
[0074]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括:
[0075](g)當(dāng)所述多級(jí)PCR反應(yīng)管具有下游隔室Ri時(shí)，其中i為≥2的正整數(shù)，
[0076]則在下游隔室Ri中進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成吸附有第i級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒；和
[0077]將所述吸附有第i級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒通過(guò)另一連接通道轉(zhuǎn)移至次一級(jí)的下游隔室Ri+1，并在所述下游隔室Ri+1中進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而形成第i+Ι級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和任選的形成吸附有第i+1級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒；
[0078](h)任選地重復(fù)步驟(g) 一次或多次。
[0079]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:對(duì)上一步驟中獲得的所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2或所述第i +1擴(kuò)增產(chǎn)物Pi+1進(jìn)行檢測(cè)；
[0080]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括探針雜交、測(cè)序、和/或電泳。
[0081]較佳地，所述檢測(cè)包括測(cè)序和/或用所述病原體種類或型別特異性探針進(jìn)行雜交。
[0082]在另一優(yōu)選例中，在所述下游隔室Ri中也放置用于吸附擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒。
[0083]在另一優(yōu)選例中，所述的PCR模板材料包括:生物組織樣品、器官樣品、穿刺樣品、細(xì)胞樣品、核酸抽提物、血液、血清、體液、唾液、毛發(fā)、糞便樣品、羊水樣品、尿液、分泌物、培養(yǎng)液、食品樣品、疫苗、土壤樣品、水樣、和空氣樣品。
[0084]在另一優(yōu)選例中，所述的多級(jí)PCR反應(yīng)在PCR自動(dòng)擴(kuò)增設(shè)備(儀)上進(jìn)行；和/或所述的固體顆粒是磁性微球。
[0085]在另一優(yōu)選例中，所述PCR擴(kuò)增設(shè)備包括:
[0086]用于放置PCR反應(yīng)管的反應(yīng)孔，其中所述PCR反應(yīng)管包括多級(jí)PCR反應(yīng)管，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)；
[0087]用于控制所述反應(yīng)孔溫度的控溫裝置，從而使得反應(yīng)管的隔室內(nèi)能夠進(jìn)行預(yù)定的PCR反應(yīng)；和
[0088]用于控制攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從上游隔室通過(guò)所述連接通道轉(zhuǎn)移至下游隔室的控制裝置。
[0089]在另一優(yōu)選例中，所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。
[0090]在另一優(yōu)選例中，所述的各反應(yīng)孔設(shè)有獨(dú)立的控溫裝置。
[0091]在另一優(yōu)選例中，所述的設(shè)備還設(shè)有自動(dòng)控制磁場(chǎng)的裝置，用于控制磁鐵的移動(dòng)或控制電磁鐵的開(kāi)啟/移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)磁性微球同步和自動(dòng)可控轉(zhuǎn)移。
[0092]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0093]圖1顯示了現(xiàn)有技術(shù)中PCR反應(yīng)管的示意圖。
[0094]圖2顯示了本發(fā)明一種多級(jí)PCR反應(yīng)管(已加入液相PCR反應(yīng)體系)的示意圖。
[0095]圖3顯示了本發(fā)明一種多級(jí)PCR反應(yīng)管(未加入液相PCR反應(yīng)體系)的示意圖。
[0096]圖4顯示了本發(fā)明另一種多級(jí)PCR反應(yīng)管(三聯(lián)體)的示意圖。
[0097]圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例6中樣品測(cè)序結(jié)果與沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)基因的比對(duì)圖。
[0098]圖6顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中樣品測(cè)序結(jié)果與伯氏疏螺旋體(B.burgdorferisensu stricto)基因的比對(duì)圖。
[0099]圖7顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中樣品測(cè)序結(jié)果與淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的比對(duì)圖。
[0100]圖8顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中檢測(cè)和區(qū)分致病萊姆菌及非致病萊姆菌的示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0101]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次開(kāi)發(fā)了一種靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強(qiáng)的多級(jí)PCR反應(yīng)管、設(shè)備、系統(tǒng)和方法。實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明的多級(jí)PCR反應(yīng)管以及對(duì)病原體種類或型別的分析方法，不僅可以使得檢測(cè)靈敏度達(dá)到1-2個(gè)拷貝，而且具有極其優(yōu)異的抗污染和抗干擾能力。此外，本發(fā)明的設(shè)備還可在封閉反應(yīng)體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的定量或半定量轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0102]術(shù)語(yǔ)
[0103]術(shù)語(yǔ)“探針”指一組與互補(bǔ)和部分互補(bǔ)核酸顯示序列特異雜交的寡核苷酸。為實(shí)施雜交后的步驟，或?yàn)楦淖兯鼈兊碾s交特性，可修飾寡核苷酸的結(jié)構(gòu)。
[0104]術(shù)語(yǔ)“型特異性探針”指一組在嚴(yán)謹(jǐn)條件下僅與與它們精確互補(bǔ)的靶區(qū)域結(jié)合的寡核苷酸。適用于這種需要的雜交條件在本領(lǐng)域已眾所周知(見(jiàn),如Sambrook等，1985,Molecular Cloning Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.USA)。一般地，在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為低于特異序列的解鏈溫度(Tm)約5°C。Tm是在存在適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)靶分子時(shí)，50%探針是結(jié)合狀態(tài)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH下)。降低雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性(例如提高鹽濃度或降低溫度)將允許與非精確互補(bǔ)序列結(jié)合。假如為非精確互補(bǔ)模板，`不與模板中的模板核酸結(jié)合的核苷酸是“錯(cuò)配核苷酸”。
[0105]術(shù)語(yǔ)“引物”指在一定條件下可作為DNA合成(啟動(dòng))起始點(diǎn)的核苷酸，其中在該條件下，與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成在核酸模板上得到誘導(dǎo)，即在四種不同核苷三磷酸和用于聚合的試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下、在適當(dāng)?shù)木彌_液和適合的溫度下。引物優(yōu)選為單鏈DNA分子。引物的適當(dāng)長(zhǎng)度一般為15-40個(gè)核苷酸。引物不需要反映模板的確切序列，因此，通過(guò)改變結(jié)合(反應(yīng))溫度，類似的靶分子組可作為合成(一致擴(kuò)增子)的模板。為使它可與固相結(jié)合以及為了其它目的，具有化學(xué)特征的基團(tuán)可連接至引物寡核苷酸。
[0106]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“引物”也指一組連續(xù)相關(guān)的寡核苷酸，其中該組寡核苷酸可引發(fā)某組模板序列(如上所述)。另外，該組的成員由這樣的寡核苷酸組成，所述寡核苷酸可與一組給定模板核酸中的一些或所有成員形成錯(cuò)配。但在適當(dāng)?shù)臈l件下，這些引物也可參與啟動(dòng)。術(shù)語(yǔ)“一致引物(consensus primer) ”指可用于引發(fā)相關(guān)模板核酸的特定區(qū)域的引物或引物組。這些區(qū)域的特征是，它們的變異性顯著低于全部核酸的變異性，即它們是保守的，因此在這些序列上所選擇的一致引物可引發(fā)模板核酸序列的所有組。一致引物不必要是單一引物，它可是一組引物。
[0107]術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定聚合酶”指在熱變性溫度下保持相對(duì)穩(wěn)定、并可催化核苷三磷酸聚合以形成與靶序列的一條核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的酶。純化的熱穩(wěn)定聚合酶可用常規(guī)方法制備或購(gòu)得(如購(gòu)自Applera)。
[0108]雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是優(yōu)選的擴(kuò)增方法，但可使用其他任何方法中擴(kuò)增感興趣的基因組區(qū)域和寡核苷酸。例如，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Wu和Wallacel989，Genomics4:560-569)、TAS 擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh 等，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173-1177)和自我維持的序列復(fù)制(Guatelli 等，1990,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-1878)也可用于革巴序列的正確擴(kuò)增。
[0109]病原體
[0110]在本發(fā)明中，適用的病原體沒(méi)有特別限制，可以是已知或未知的各種病原體，其中包括(但并不限于):病毒、立克次體、細(xì)菌、衣原體、螺旋體、寄生蟲(chóng)等。
[0111]代表性的例子包括(但并不限于):HIV病毒、?？刹《?、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、單純皰疹病毒、肺炎支原體、風(fēng)疹病毒、副流感病毒、流感病毒、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、痢疾桿菌、淋病細(xì)菌、麻疹病毒、梅毒螺旋體、幽門螺桿菌等。
[0112]沙眼衣原體
[0113]沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)屬于衣原體的一種,是有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，其原體具有感染性，侵入細(xì)胞后發(fā)育形成始體也稱為網(wǎng)狀體，不具感染性，在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)和復(fù)制約24~40小時(shí)后，轉(zhuǎn)化為原體，并釋放到細(xì)胞外，再感染新的宿主細(xì)胞。
[0114]沙眼衣原體是引起非淋菌性尿道炎的主要病原體，可由宮頸上行到子宮和輸卵管可引起無(wú)癥狀的上生殖道感染，導(dǎo)致異位妊娠、原發(fā)性不育。臨床表現(xiàn)為婦女子宮頸管炎，子宮內(nèi)膜炎，急性輸卵管炎和盆腔炎。孕婦患有沙眼衣原體感染時(shí)，還可能引起胎兒流產(chǎn)，早產(chǎn)和新生兒感染沙眼衣原體性結(jié)膜炎，`沙眼衣原體性肺炎等疾病。
[0115]目前，沙眼衣原體的檢測(cè)主要依靠宮頸分泌物實(shí)驗(yàn)室檢查，如細(xì)胞培養(yǎng)、抗原檢測(cè)法等。
[0116]韋氏包柔螺旋體
[0117]偉氏包柔螺旋體(Borrelia burgdorefi),在分類學(xué)上為螺旋體屬的一種,它是一種單細(xì)胞的革蘭氏陰性螺旋體，是導(dǎo)致萊姆病的病因。韋氏包柔螺旋體感染的癥狀早期以慢性游走性紅斑(ECM)為主，中期表現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)及心臟異常，晚期主要是關(guān)節(jié)炎。導(dǎo)致的損害有神經(jīng)系統(tǒng)損害、循環(huán)系統(tǒng)損害、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損害等，少部分患者有消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)損咅的癥狀。
[0118]目前，韋氏包柔螺旋體的檢測(cè)主要有血清學(xué)檢查，如檢測(cè)特異性抗體IgG和IgM ；或病原學(xué)檢查如直接檢查和分離培養(yǎng)伯氏疏螺旋體、檢測(cè)伯氏疏螺旋體獨(dú)有的DNA序列
坐寸ο
[0119]淋病奈瑟氏菌
[0120]淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)可引起泌尿生殖系統(tǒng)化膿性炎性疾病?？筛腥灸虻?、子宮頸內(nèi)膜、也可侵犯直腸、眼結(jié)膜和咽部。女性可發(fā)生前庭大腺炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔炎；男性可發(fā)生附睪炎和前列腺炎；造成不孕或不育。并可經(jīng)血行播散，引起菌血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肝炎等。如治療不徹底，可擴(kuò)散至生殖系統(tǒng)。胎兒可經(jīng)產(chǎn)道感染造成新生兒淋病性急性結(jié)膜炎。
[0121]目前，淋病奈瑟氏菌的檢測(cè)主要采取尿道膿性分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢等手段。
[0122]病原體特異性引物
[0123]在本發(fā)明中，一類優(yōu)選的引物是簡(jiǎn)并/通用引物PCR。通過(guò)針對(duì)高保守基因或區(qū)域設(shè)計(jì)引物，可以擴(kuò)增病原體，隨后使用型特異性探針雜交分型，可區(qū)分多種型別。
[0124]以HPV為例，在本發(fā)明中，常用的引物包括簡(jiǎn)并引物MY09/11 (Bosch，1995)及其改進(jìn)型PGMY09/11 (Gravitt PE, 1998), SPF1/2 (Reesink-Peters N，2001)，通用引物GP5/6 (DeRoda Husman AM, 1995)和 GP5+/6+(Hutchinson, 1994)，SPF1/2 的極限靈敏度達(dá)到約
1-1Ofg(20-200 個(gè)拷貝)。
[0125]PCR產(chǎn)物還可通過(guò)各自不同的常規(guī)手段進(jìn)行進(jìn)一步分析:例如序列分析，限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP，Wang TS，1999)，以及使用特異性的探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交(LaconiS，2001)等。
[0126]多級(jí)PCR反應(yīng)管
[0127]本發(fā)明還提供了一種多級(jí)PCR反應(yīng)管，所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的PCR反應(yīng)腔或隔室(10) (compartment)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)。
[0128]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明反應(yīng)管”、“多級(jí)PCR反應(yīng)管”、“PCR多級(jí)反應(yīng)管”、“多級(jí)PCR反應(yīng)管”、“級(jí)聯(lián)PCR反應(yīng)管”可互換使用，指具有至少二個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、PCR反應(yīng)隔室的PCR反應(yīng)管，并且在所述PCR反應(yīng)隔室之間設(shè)有允許攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒通過(guò)的轉(zhuǎn)移通道。
[0129]在本發(fā)明中，對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)移通道進(jìn)行連通的任何兩個(gè)PCR反應(yīng)隔室，可將其中先進(jìn)行PCR反應(yīng)的反應(yīng)隔室稱為“上游隔室”、“上游反應(yīng)隔室”或“上游PCR反應(yīng)隔室”，而將另一 PCR反應(yīng)隔室稱為“下游隔室”、“下游反應(yīng)隔室”或“下游PCR反應(yīng)隔室”。
[0130]參見(jiàn)圖2和圖3。圖中示出的本發(fā)明多級(jí)PCR反應(yīng)管包括二個(gè)可封閉的PCR反應(yīng)腔或隔室(10) (compartment)。各隔室10設(shè)有腔蓋(20)。較佳地，所述腔蓋通過(guò)連接件(22)與隔室本體連為一體。
[0131]此外，在兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從通過(guò)一個(gè)隔室(即上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(即下游隔室)。
[0132]當(dāng)所述隔室豎直放置時(shí)，所述的連接通道可以是水平的或傾斜的。通常，連接通道的傾斜角度(連接通道與水平線的夾角)為0-30度，較佳地為0-15度，更佳地為0-10度。
[0133]當(dāng)連接通道呈現(xiàn)一定傾斜角度時(shí)，來(lái)自上游隔室的、攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆?？煞奖愕亟柚亓蛲獠渴┘拥拇艌?chǎng)力，從連接通道的入口端滾向或滑向連接通道的出口端，從而進(jìn)入下游隔室。
[0134]在本發(fā)明中，所述連接通道的內(nèi)徑和長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，只要能夠讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒通過(guò)即可。
[0135]典型地，連接通道的內(nèi)徑為0.1-20臟，較佳地為0.2-10mm，更佳地為0.2_5mm。[0136]典型地，連接通道的長(zhǎng)度為0.1-100_，較佳地0.2_50mm。
[0137]在本發(fā)明中，連接通道可以是已封閉的或可封閉的。例如，當(dāng)多級(jí)PCR反應(yīng)管的腔蓋與隔室腔體是分離式時(shí)，可將腔蓋制成一體式的上蓋，該上蓋不僅具有對(duì)應(yīng)于隔室腔體的腔蓋，而且還具有對(duì)應(yīng)于連接通道的密封蓋。這樣，當(dāng)蓋上所述上蓋時(shí)，不僅封閉了各隔室，還封閉了相應(yīng)的連接通道，從而形成封閉的反應(yīng)空間。
[0138]在本發(fā)明中，一體式的上蓋特別適用于當(dāng)隔室具有aXb矩陣結(jié)構(gòu)的情況。
[0139]本發(fā)明多級(jí)PCR反應(yīng)管的隔室大小沒(méi)有特別限制。通常，單個(gè)PCR隔室的容積約為10-10000微升，較佳地20-2000微升，更佳地30-1000微升，最佳地40-500微升。
[0140]本發(fā)明多級(jí)PCR反應(yīng)管的隔室形狀沒(méi)有特別限制，可以是圓柱形、圓錐形、或其他類似形狀。
[0141]本發(fā)明多級(jí)PCR反應(yīng)管的材質(zhì)沒(méi)有特別限制，可以是塑料、玻璃或可透過(guò)磁場(chǎng)的其他材料。優(yōu)選塑料，例如聚丙烯塑料等。
[0142]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)管包括η個(gè)隔室，其中η為2-5000的任一正整數(shù)；較佳地，η為2-500的任一正整數(shù)。
[0143]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)管包括M個(gè)多級(jí)組，各多級(jí)組分別具有2、3、4或5個(gè)相互連通的隔室，其中M為1-1000的任一正整數(shù)。
[0144]在另一優(yōu)選例中，M為 192、96、48、24、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或 I。
[0145]在另一優(yōu)選例中，所述的PCR反應(yīng)管的隔室呈直鏈構(gòu)型、支鏈構(gòu)型、或環(huán)形構(gòu)型。較佳地，呈“一”字構(gòu)型、“V”字構(gòu)型、或“□”或“〇”字等構(gòu)型。
`[0146]在另一優(yōu)選例中，所述的各隔室為串聯(lián)設(shè)置。
[0147]在另一優(yōu)選例中，所述的隔室呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2_100的正整數(shù)，b為2-100的正整數(shù)。
[0148]在另一優(yōu)選例中，所述的矩陣為6X8、6X16、8X12、12X16矩陣。
[0149]在另一優(yōu)選例中，所述腔蓋為密封蓋。
[0150]在另一優(yōu)選例中，所述腔蓋與隔室是一體化的；更佳地，上述腔蓋通過(guò)連接件
(22)與隔室腔體連接。
[0151 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的腔蓋與隔室腔體是分離的。
[0152]在另一優(yōu)選例中，所述多個(gè)或全部腔蓋是一體的。
[0153]在另一優(yōu)選例中，所述連接通道位于反應(yīng)腔或隔室上部。
[0154]在另一優(yōu)選例中，所述的連接通道高于隔室中預(yù)定的液相PCR反應(yīng)體系的液面。
[0155]在另一優(yōu)選例中，所述的連接通道入口的下沿距離隔室上沿的距離Hl與隔室上沿與隔室底部的垂直高度H之比滿足:H1/H< 1/2，較佳地< 1/3，更佳地< 1/4，最佳地(1/5。
[0156]在另一優(yōu)選例中，所述PCR反應(yīng)管具有2個(gè)或3個(gè)互相連通的PCR隔室。
[0157]在另一優(yōu)選例中，所述的上游隔室設(shè)有引導(dǎo)板，用于引導(dǎo)攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從上游隔室進(jìn)入連接通道入口。
[0158]攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒
[0159]在本發(fā)明中，在隔室中進(jìn)行PCR反應(yīng)之中或之后，形成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的一部分會(huì)吸附或粘附于置于所述隔室的固體顆粒表面，從而形成攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒。當(dāng)所述固體顆粒從上游隔室轉(zhuǎn)移下游隔室時(shí)，所攜帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物就可作為下游隔室中的PCR模板。
[0160]在本發(fā)明中，固體顆粒的形狀沒(méi)有特別限制，可以是球形、卵圓形、圓柱形、錐形、立方形或其他形狀。固體顆粒可以是實(shí)心的、空心的、網(wǎng)格狀的或其他結(jié)構(gòu)，只要該固體顆?？梢晕交驍y帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0161]固體顆粒的材質(zhì)沒(méi)有特別限制，然而優(yōu)選的固體顆粒是磁性顆粒，如磁性微球。在本發(fā)明中，所述的磁性顆粒包括已具有磁性的顆粒以及在磁場(chǎng)作用下具有磁性的顆粒。
[0162]在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微球?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)。
[0163]在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微球是表面未修飾的、表面修飾的、或表面帶有涂層。
[0164]在本發(fā)明中，所述固體顆粒的大小沒(méi)有特別限制。通常，固體顆粒的平均粒徑為
0.01~IOmm,較佳地為0.最佳地為0.2_2mm。
[0165]所述固體顆粒的核酸吸附力受到顆粒表面積和表面性質(zhì)等因素的影響。技術(shù)人員可以購(gòu)得或用常規(guī)方法制備各種不同的能攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒。
[0166]一種優(yōu)選的固體顆粒是表面親水性的或帶有羥基等親水性基團(tuán)的顆粒。這樣，不僅能夠吸附核酸分子，還可在轉(zhuǎn)移時(shí)攜帶部分反應(yīng)混合液，從而將一定量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至下游隔室。
[0167]當(dāng)顆粒大小和材質(zhì)確定后，通過(guò)常規(guī)方法，可以測(cè)定出每個(gè)固體顆粒所攜帶的PCR產(chǎn)物的數(shù)量。通常，每個(gè)顆?？蓴y帶整個(gè)`PCR反應(yīng)體系中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的約1/200-1/10，較佳地約1/100-1/15，更佳地1/50-1/20。按體積計(jì)，通常一個(gè)顆粒可攜帶0.1_2微升的反應(yīng)液體，這取決于顆粒的大小以及表面特性。
[0168]取決于需要以及固體顆粒的大小，可以在上游隔室中放置一個(gè)或多個(gè)固體顆粒。此外，可以在下游隔室中放置或不放置一個(gè)或多個(gè)固體顆粒。
[0169]當(dāng)一個(gè)隔室中有多個(gè)顆粒時(shí)，這些顆粒可以一起或分別被轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)下游隔室。
[0170]多級(jí)PCR反應(yīng)
[0171]在本發(fā)明中，對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)移通道連通的上游反應(yīng)隔室和下游PCR反應(yīng)隔室而言，通常在所述上游PCR反應(yīng)隔室進(jìn)行了 PCR反應(yīng)(“第一級(jí)PCR反應(yīng)”)之后或之中，置于反應(yīng)體系中固體顆粒會(huì)吸附一部分?jǐn)U增產(chǎn)物。將所述吸附有一部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，通過(guò)所述轉(zhuǎn)移通道從上游反應(yīng)隔室轉(zhuǎn)移至下游隔室，就可在下游隔室內(nèi)作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板，從而進(jìn)行下一級(jí)的PCR反應(yīng)。
[0172]應(yīng)理解，在本發(fā)明中，雖然會(huì)在至少兩個(gè)上游PCR反應(yīng)隔室進(jìn)行PCR反應(yīng)，然而，在某些PCR反應(yīng)隔室也可不進(jìn)行任何反應(yīng)，或不進(jìn)行PCR反應(yīng)。例如，僅進(jìn)行探針雜交、測(cè)序、電泳或其他檢測(cè)反應(yīng)。
[0173]在本發(fā)明中，對(duì)于進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑沒(méi)有特別限制，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的各種不同的PCR反應(yīng)所需的試劑。代表性的試劑包括(但并不限于):PCR引物、聚合酶；dNTP、緩沖液、鎂離子等。
[0174]在本發(fā)明中，所述的PCR反應(yīng)包括常規(guī)PCR (高溫PCR)、低溫PCR、多級(jí)PCR、雙引物PCR反應(yīng)、多引物PCR反應(yīng)、RT-PCR反應(yīng)、DNA聚合酶PCR反應(yīng)、RNA聚合酶PCR反應(yīng)。[0175]在另一優(yōu)選例中，所述PCR引物的長(zhǎng)度為12-100bp，較佳地15_50bp，更佳地18~30bpo
[0176]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系包括以下組分:10X擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物、各類DNA聚合酶、Mg2+。
[0177]在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系的各組分含量如下:10X擴(kuò)增緩沖液5~20 μ 1、4 種 dNTP 混合物 50 ~500 μ 1、PCR 引物 10 ~100 μ 1、模板 DNA0.1 ~2 μ g、Taq DNA 聚合酶 1 ~5 μ 1、Mg2+0.5 ~3mmol/L、水 50 ~200 μ 1。
[0178]在本發(fā)明中，各隔室內(nèi)的PCR引物可相同或不同。例如，對(duì)于通過(guò)兩個(gè)連接通道連通的三個(gè)PCR反應(yīng)隔室而言，第一 PCR引物對(duì)、第二 PCR引物對(duì)和第三PCR引物對(duì)分別位于不同的PCR隔室內(nèi)。一種代表性的三級(jí)PCR反應(yīng)管(三聯(lián)體)如圖4所示。
[0179]現(xiàn)結(jié)合圖2，描述本發(fā)明的代表性的多級(jí)PCR方法。該方法包括:
[0180]先在所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的PCR反應(yīng)隔室中加入進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑，形成液相PCR反應(yīng)體系31和32，并且在上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(如磁性顆粒)，但在下游隔室中不加入PCR模板材料，并且兩個(gè)隔室內(nèi)的液相PCR反應(yīng)體系31和32互不連通且互不接觸；
[0181]封閉所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的上游隔室和下游隔室，構(gòu)成一個(gè)封閉空間；
[0182]在上游隔室Rl中進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及吸附有所述第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒50 ；
[0183]抬升(如通過(guò)磁力或磁場(chǎng))所述吸附PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒50，離開(kāi)位于所述上游隔室下方的液相PCR反應(yīng)體系后，進(jìn)入所述連接通道的入口，經(jīng)過(guò)連接通道，進(jìn)入位于所述上游隔室下游的另一下游隔室R2，作為所述下游隔室中的PCR模板材料；
[0184]在所述下游隔室R2中進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0185]如果需要，可重復(fù)上述步驟:將下游隔室Ri (i為≥2的正整數(shù))中形成的吸附有第i級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，通過(guò)另一連接通道轉(zhuǎn)移至次一級(jí)的下游隔室Ri+1，并在所述下游隔室Ri+1中進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而形成第i+1級(jí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0186]與現(xiàn)有技術(shù)的PCR反應(yīng)管(圖1)相比，本發(fā)明的多級(jí)PCR反應(yīng)管可在反應(yīng)空間處于封閉的情況下，將第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物吸附于固體顆粒(如磁性微球)，然后方便地將其從上游隔室轉(zhuǎn)移至下游隔室，從而在下游隔室中將轉(zhuǎn)移的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次PCR,從而在保持高特異性的情況下，通過(guò)兩次或多次PCR反應(yīng)顯著提高了檢測(cè)靈敏度。
[0187]另外，本發(fā)明的另一顯著特點(diǎn)是在兩次或多次PCR反應(yīng)過(guò)程中，整個(gè)多級(jí)PCR反應(yīng)管或各連通的多級(jí)組處于封閉狀態(tài)，故有效防止了環(huán)境以及操作過(guò)程中引入污染源，也防止了對(duì)環(huán)境的污染，因而不必需要潔凈程度極高的操作設(shè)備或操作室。
[0188]在本發(fā)明中，雖然整個(gè)多級(jí)PCR反應(yīng)管或各連通的多級(jí)組處于封閉狀態(tài)，但仍可非常簡(jiǎn)便地利用固體顆粒在將反應(yīng)產(chǎn)物(如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)從上游隔室定量或半定量地轉(zhuǎn)移下游隔室，從而在下游進(jìn)行下一級(jí)的PCR反應(yīng)。核酸轉(zhuǎn)移量的大小，可通過(guò)調(diào)節(jié)固體顆粒的大小和數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0189]PCR擴(kuò)增設(shè)備
[0190]本發(fā)明還提供了一種可用于本發(fā)明方法的PCR擴(kuò)增設(shè)備。一種優(yōu)選設(shè)備包括:
[0191]用于放置PCR反應(yīng)管的反應(yīng)孔，其中所述PCR反應(yīng)管具有上游隔室和下游隔室，以及連接所述上游隔室和下游隔室的連接通道；
[0192]用于控制所述反應(yīng)孔溫度的控溫裝置，從而使得反應(yīng)管的隔室內(nèi)能夠進(jìn)行預(yù)定的PCR反應(yīng)；和
[0193]用于控制攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從上游隔室通過(guò)所述連接通道轉(zhuǎn)移至下游隔室的控制裝置。
[0194]通常，所述的固體顆粒是磁性微球，而所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。該磁體一般位于反應(yīng)孔的上方，其磁場(chǎng)可以覆蓋反應(yīng)孔區(qū)域的全部或部分，從而將磁性微球一次性或分批從上游隔室轉(zhuǎn)移至下游隔室。
[0195]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)孔呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為
2-100的正整數(shù)，b為2-100的正整數(shù)，以便與常規(guī)的96孔板等配合使用。
[0196]使用本發(fā)明的PCR擴(kuò)增設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量和自動(dòng)化操作。
[0197]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括:
[0198](a)靈敏度高；
[0199](b)特異性好；
[0200](c)抗干擾能力強(qiáng)；
[0201](d)操作簡(jiǎn)便。
[0202](e)可實(shí)現(xiàn)定量和半定量的轉(zhuǎn)移。在多級(jí)PCR過(guò)程中，按需在級(jí)間轉(zhuǎn)移PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。`
[0203](f)可在普通醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
[0204](g)檢測(cè)結(jié)果可靠、精確。
[0205](h)減少或消除對(duì)環(huán)境的污染。
[0206]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0207]實(shí)施例1
[0208]多級(jí)PCR反應(yīng)
[0209]在本實(shí)施例中，采用圖2所示的二聯(lián)體多級(jí)PCR反應(yīng)管，
[0210]引物如下:
[0211]MY09:5’ -CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’ (SEQ ID N0.:1)
[0212]MYll:5，-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3’ (SEQ ID N0.:2)
[0213]GP5:5’ -TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3’ (SEQ ID N0.:3)
[0214]GP6:5’ -GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’ (SEQ ID N0.:4)
[0215]其中，在上游隔室中的引物為MY09/MY11，下游隔室中的引物為GP6/MY11或GP5/MY9。
[0216]將含HPV(人乳頭狀病毒)的分泌物用常規(guī)方法抽提核酸后，經(jīng)5倍或10倍系列稀釋后，制得HPV拷貝數(shù)約為1、2、5、10、25、50、100、200的樣品。將所述樣品作為模板加入上游隔室。上游隔室Rl中分別加入25微升的常規(guī)的PCR反應(yīng)體系(其中包括DNA核酸模板、聚合酶、dNTP、引物、ddH20)和2個(gè)直徑約200nm的磁性微球(無(wú)修飾的鋼珠)。
[0217]先進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，預(yù)變性95°C，3分鐘，95°C，30S ;60°C退火30s，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。然后，75 °C再延伸10分鐘。
[0218]然后通過(guò)磁場(chǎng)，將2個(gè)磁性微球通過(guò)連接通道轉(zhuǎn)移到下游隔室，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。條件是95°C，30S ;60°C退火30s，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
[0219]對(duì)下游隔室R2中獲得的第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。然后將檢測(cè)結(jié)果與HPV標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，從而得出HPV的存在與否和種類。
[0220]檢測(cè)結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)出微量(樣品中僅含5-10個(gè)拷貝)的HPV病毒。此外，不僅靈敏度顯著提高，而且假陰性和假陽(yáng)性率都顯著低于常規(guī)PCR法(減少約10倍，即提高約I個(gè)數(shù)量級(jí))或HC2方法(減少約50%)。
[0221]實(shí)施例2
[0222]多級(jí)PCR反應(yīng)
[0223]重復(fù)實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于:使用的多級(jí)PCR反應(yīng)管包括2個(gè)多級(jí)組，各多級(jí)組分別具有2個(gè)相互連通的隔室。4個(gè)隔室呈矩形排列。這樣，可同時(shí)對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行多級(jí)PCR反應(yīng)。
[0224]實(shí)施例3 [0225]多級(jí)PCR反應(yīng)
[0226]重復(fù)實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于:使用的多級(jí)PCR反應(yīng)管包括48個(gè)多級(jí)組，各多級(jí)組分別具有2個(gè)相互連通的隔室；或使用的多級(jí)PCR反應(yīng)管包括32個(gè)多級(jí)組，各多級(jí)組分別具有3個(gè)相互連通的隔室。
[0227]96個(gè)隔室呈現(xiàn)矩形排列，與常規(guī)的96孔板對(duì)應(yīng)，該多級(jí)PCR反應(yīng)管可放置于96孔板上。這樣，可同時(shí)對(duì)48個(gè)樣品進(jìn)行二級(jí)的多級(jí)PCR反應(yīng)；或可同時(shí)對(duì)32個(gè)樣品進(jìn)行三級(jí)的多級(jí)PCR反應(yīng)。
[0228]實(shí)施例4
[0229]三級(jí)的多級(jí)PCR反應(yīng)
[0230]重復(fù)實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于:下游隔室R3中的引物為GP6/GP5。
[0231]第一級(jí)PCR:同實(shí)施例1。
[0232]第二級(jí)PCR:同實(shí)施例1。
[0233]第三級(jí)PCR:將下游隔室R2中的攜帶第二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性顆粒轉(zhuǎn)移至下游隔室R3，然后進(jìn)行第三次PCR，從而獲得第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0234]對(duì)下游隔室R3中獲得的第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。然后將檢測(cè)結(jié)果與HPV標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，從而得出HPV的存在與否和種類。
[0235]檢測(cè)結(jié)果表明，該檢測(cè)結(jié)果可以檢測(cè)樣品中僅含1-2個(gè)拷貝的HPV病毒分子。此外，不僅靈敏度顯著提高，而且假陰性和假陽(yáng)性率都顯著低于常規(guī)PCR法或HC2方法(減少約 50%)。
[0236]實(shí)施例5
[0237]HPV型別鑒定
[0238]5.1.宮頸表皮取樣:
[0239](I)臨床醫(yī)生在取檢測(cè)樣本時(shí)，用取樣刷，刮取病人樣本后，先插入一只無(wú)菌的5ml取樣管內(nèi)，取樣刷貼管壁輕旋半周，使得小部分病人樣本粘在取樣管內(nèi)；
[0240](2)確保有足夠樣本進(jìn)行多級(jí)PCR技術(shù)檢測(cè)HPV后，將取樣刷從5ml取樣管內(nèi)抽出放入檢測(cè)保存液；
[0241](3)在步驟I的5ml取樣管內(nèi)加入2ml95%乙醇，蓋上蓋子，上下振蕩取樣管數(shù)次，使得貼在管壁上的樣本保存在液體內(nèi)；
[0242](4)將步驟3的取樣管上做好標(biāo)記，使其與相應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一一對(duì)應(yīng)；
[0243](5)將步驟4的取樣管放4°C冰箱保存，待測(cè)。
[0244]5.2 多級(jí) PCR
[0245](I)第一級(jí) PCR
[0246]反應(yīng)體系20 μ L，引物ΜΥ091 μ L，引物MYl 11 μ L，病人樣本DNAl μ L和水2 μ L，總計(jì) 25 μ L ;
[0247](2)第二級(jí) PCR
[0248]反應(yīng)體系20 μ L，引物GP61 μ L，引物MYlll μ L，通過(guò)磁珠轉(zhuǎn)移的第一 PCR產(chǎn)物(約I μ L) ,/JC 2 μ L, 25 μ L0
[0249](3)第三級(jí) PCR
[0250]反應(yīng)體系20μ L，引物GP51 μ L，引物GP61 μ L，第二次PCR產(chǎn)物(約I μ L)，水2μ L，總計(jì)25 μ L0
[0251]用2%的Agarose檢測(cè)第三次PCR反應(yīng)的結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物用于測(cè)序。
[0252]5.3用于樣本質(zhì)量檢測(cè)的β血紅蛋白PCR`[0253]反應(yīng)體系20 μ L，引物B 11 μ L，引物B21yL，病人樣本DNAl μ L，水2 μ L，總計(jì)25 μ L0
[0254]B1:5’ -ACACAACTGTGTTCACTAGC(SEQ ID N0.:5)
[0255]Β2:5’ -CAACTTCATCCACGTTCACC(SEQ ID N0.:6)
[0256]5.4 測(cè)序
[0257]水13.5 μ L，5倍反應(yīng)緩沖液3.5 μ L, BigDyel.1lyL,測(cè)序引物I μ，第二次PCR產(chǎn)物I μ L，在PCR儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用Centr1-S印strip純化柱純化，純化后從PCR管內(nèi)吸取10 μ L純化產(chǎn)物至測(cè)序板，測(cè)序引物可從最后一次PCR引物中選擇，上機(jī)器測(cè)序，然后對(duì)測(cè)序結(jié)果與HPV標(biāo)準(zhǔn)序列(可獲自已公開(kāi)的公用數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行分析。所獲DNA序列以100%與基因庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)HPV基因型DNA相符作為HPV定型標(biāo)準(zhǔn)(即美國(guó)FDA有關(guān)HPV定型的最聞金標(biāo)準(zhǔn))。
[0258]結(jié)果
[0259]本發(fā)明方法，對(duì)3320個(gè)檢測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果表明:
[0260]1319個(gè)樣本是非HPV感染的，1352個(gè)樣本是高危型HPV感染，377個(gè)樣本是低危型HPV感染和272個(gè)樣本是混合感染。
[0261]表1 二種方法的結(jié)果比較
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別病原體種類或型別的方法，其特征在于，包括步驟: (a)在封閉的第一級(jí)PCR反應(yīng)腔或隔室中，以含有或可能含有病原體核酸的樣本為模板，通過(guò)所述病原體特異性的第一引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物Pl ； (b)將第一擴(kuò)增產(chǎn)物從第一級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第二級(jí)PCR隔室中，作為第二級(jí)PCR的模板，并在封閉的第二級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第二引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2 ； (c)任選地，將上一步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物Pi從第i級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第i+Ι級(jí)PCR隔室中，作為第i+Ι級(jí)PCR的模板，并在封閉的第i+Ι級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第i + I引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第i+Ι擴(kuò)增產(chǎn)物Pi +i，其中i為> 2的正整數(shù)；本步驟可進(jìn)行一次或多次； (d)對(duì)上一步驟中獲得的所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物P2或所述第i+ I擴(kuò)增產(chǎn)物Pi+1，進(jìn)行測(cè)序，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列；和 (e)將測(cè)得的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與病原體標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別出病原體的種類或型別。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)和(c)中，將第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pj從第j級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第j + I級(jí)PCR隔室過(guò)程中，第j級(jí)PCR隔室和第j + I級(jí)PCR隔室都處于封閉狀態(tài)，其中j為≤I的正整數(shù)，并且在第j級(jí)PCR隔室和第j + I級(jí)PCR隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒從Pj級(jí)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至Pj+1級(jí)隔室(或下游隔室)。
3.如權(quán)利要求1 所述的 方法，其特征在于，在步驟(a)、(b)和(C)的整個(gè)過(guò)程中，所有的PCR隔室都處于封閉狀態(tài)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，第一級(jí)PCR隔室中放置有可攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，從而在PCR反應(yīng)過(guò)程中或之后，形成攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固體顆粒是磁性微球。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(b)和(c)中，利用磁鐵或電磁鐵，通過(guò)所述攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，將第j擴(kuò)增產(chǎn)物P」從第j級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第j +I級(jí)PCR隔室，其中j為≤I的正整數(shù)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病原體選自下組:病毒、立克次體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、衣原體； 較佳地，所述的細(xì)菌包括衣原體目(Chlamydiales)細(xì)菌、括螺旋體目(Spirochaetales)細(xì)菌、 奈瑟菌目(Neisseriales)細(xì)菌； 更佳地，所述病原體選自下組:HPV、沙眼衣原體、韋氏包柔螺旋體、淋病奈瑟氏菌。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)、(b)和(c)在多級(jí)PCR反應(yīng)管中進(jìn)行，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)。
9.一種用于特異性擴(kuò)增病原體的PCR反應(yīng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括: (i)多級(jí)PCR反應(yīng)管，其中所 述反 應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)； (?)固體顆粒，所述固體顆粒位于所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的至少一個(gè)上游隔室中，并且在所述上游隔室內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，所述固體顆粒能吸附在擴(kuò)增過(guò)程中形成的擴(kuò)增產(chǎn)物；以及 (ii1-1)用于特異性擴(kuò)增所述病原體的多個(gè)引物對(duì)，所述的各引物對(duì)分別位于不同的容器中，并且在PCR擴(kuò)增時(shí)各所述引物對(duì)被分別置于第j級(jí)PCR隔室中，從而在第j級(jí)PCR隔室中用所述的第j引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，形成第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pp其中j為> I的正整數(shù)；或 (ii1-2)分別位于第j級(jí)PCR隔室中的所述病原體特異性的第j引物對(duì)，從而在第j級(jí)PCR隔室中用所述的第j引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，形成第j擴(kuò)增產(chǎn)物Pp其中j為> I的正整數(shù)。
10.一種對(duì)病原體的核酸物質(zhì)進(jìn)行多級(jí)PCR反應(yīng)方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (a)提供一多級(jí)PCR反應(yīng)管，其中所述反應(yīng)管包括二個(gè)或多個(gè)可封閉的的PCR反應(yīng)腔或隔室(10)，并且在至少兩個(gè)隔室之間設(shè)有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用于讓攜帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒(50)從一個(gè)隔室(或上游隔室)轉(zhuǎn)移至另一隔室(或下游隔室)； (b)在所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的PCR反應(yīng)隔室中加入進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑，形成液相PCR反應(yīng)體系，并且在一個(gè)或多個(gè)上游隔室中加入PCR模板材料和用于吸附擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，但在下游隔室中不加入PC`R模板材料，并且各隔室內(nèi)的液相PCR反應(yīng)體系互不連通且互不接觸； (c)封閉所述多級(jí)PCR反應(yīng)管的上游隔室和下游隔室，從而對(duì)于相互連通的多個(gè)隔室而言，當(dāng)各自的腔蓋全部蓋上后，構(gòu)成一個(gè)封閉空間； (d)在上游隔室Rl中，用所述病原體特異性的第一引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Pl以及吸附有所述第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Pl的固體顆粒； (e)抬升所述吸附PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的固體顆粒，離開(kāi)位于所述上游隔室下方的液相PCR反應(yīng)體系后，進(jìn)入所述連接通道的入口，經(jīng)過(guò)連接通道，進(jìn)入位于所述上游隔室下游的另一下游隔室R2，作為所述下游隔室中的PCR模板材料； (f)在所述下游隔室R2中，用所述病原體特異性的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，形成第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物P2 ； (g)任選的，將上一步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物Pi從第i級(jí)PCR隔室轉(zhuǎn)移至第i+Ι級(jí)PCR隔室中，作為第i+Ι級(jí)PCR的模板，并在封閉的第i+Ι級(jí)PCR隔室中，通過(guò)所述病原體特異性的第i + I引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得第i+Ι擴(kuò)增產(chǎn)物Pi +i，其中i為> 2的正整數(shù)；并且本步驟可進(jìn)行一次或多次； 較佳地，所述的多級(jí)PCR反應(yīng)在PCR自動(dòng)擴(kuò)增設(shè)備(儀)上進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103882103SQ201310489074
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】洪國(guó)藩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院