一種利用單個(gè)b細(xì)胞pcr技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用已有的豬抗體基因文庫，設(shè)計(jì)了多套引物，利用套式PCR，從單個(gè)B淋巴細(xì)胞擴(kuò)增出抗體可變區(qū)基因，進(jìn)而篩選出具有中和抗體活性的全豬源單克隆抗體。本發(fā)明首次建立了一種利用高通量單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法，相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)具有效率高、全豬源、基因多樣性好等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的提出為研究豬的抗體免疫應(yīng)答和分離治療性抗體提供了一種新的技術(shù)手段。
【專利說明】
一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備方法，特別涉及一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR抗體技 術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法，本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體是現(xiàn)代生命醫(yī)學(xué)科學(xué)的一個(gè)重要工具，廣泛應(yīng)用到診斷、治療、研究等 各個(gè)領(lǐng)域。高通量單個(gè)B細(xì)胞PCR抗體技術(shù)是目前國際最領(lǐng)先的抗體技術(shù)。主要原理為:將目 標(biāo)群體內(nèi)B細(xì)胞通過流式分選單個(gè)細(xì)胞至96孔板，然后將單個(gè)B細(xì)胞內(nèi)抗體基因利用PCR技 術(shù)克隆至表達(dá)載體內(nèi)，在哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)抗體。這種方法保留了輕重鏈 可變區(qū)的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、全天然源性。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在尋找抗腫 瘤和抗人類一些重要傳染病的中和抗體，如艾滋病，嚴(yán)重急性呼吸道綜合征，中東呼吸綜合 征及埃博拉病毒。但該技術(shù)至今還未見在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克 隆抗體的方法。
[0004] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0005] -方面，本發(fā)明提出了一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的引物 組，其包括：
[0006] (1)用于單個(gè)B淋巴細(xì)胞CDNA擴(kuò)增的引物，所述引物由一條隨機(jī)引物和4條特異性 引物組成，所述的4條特異性引物的序列分別如SEQ ID No. 1-4所示；
[0007] (2)用于重鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.5-10所示，其中SEQ ID No.5-7所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.8-10所示的引 物用于第二輪擴(kuò)增；
[0008] (3)用于輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.11-18所示，其中SEQ ID No.11-14所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.15-19所示 的引物用于第二輪擴(kuò)增；
[0009] (4)用于輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.20-25所示，其中SEQ ID No.20-22所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.23-25所示 的引物用于第二輪擴(kuò)增；
[0010] (5)用于豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如 SEQ ID No.26以及29所示；
[0011] (6)用于豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.27以及29所示；
[0012] (7)用于豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.28以及29所示；
[0013] ⑶用于CMV啟動子片段擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.30以及 31所示；
[0014] (9)用于擴(kuò)增抗體全長的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.30以及29所 不。
[0015] 此外，本發(fā)明還提出了所述的引物組在利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆 抗體中的用途。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還提出了一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的 方法，包括以下步驟：
[0017] (1)B淋巴細(xì)胞的分離和篩選
[0018]從被抗原免疫的動物外周血中分離得到淋巴細(xì)胞，采用密度梯度離心純化;將抗 原采用生物素或熒光素進(jìn)行標(biāo)記后，使其與特異性B淋巴細(xì)胞結(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行B 淋巴細(xì)胞分選，把目標(biāo)單個(gè)B淋巴細(xì)胞分離至96孔板的孔中；
[0019] ⑵擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞的cDNA
[0020] 以步驟(1)分選的單個(gè)B淋巴細(xì)胞的RNA為模板，利用隨機(jī)引物和4條特異性引物逆 轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所述的4條特異性引物的序列分別如SEQ ID No. 1-4所示；
[0021 ] (3)擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體可變區(qū)的編碼基因
[0022] a抗體重鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0023]以步驟(2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No.5-7所示的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò) 增，然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No.8-10所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，得 到抗體重鏈可變區(qū)的編碼基因片段；
[0024] b抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0025]以步驟(2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No. 11-14所示的引物進(jìn)行第一輪 擴(kuò)增，然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No. 15-19所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò) 增，得到抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)的編碼基因片段；
[0026] c抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0027]以步驟(2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No.20-22所示的引物進(jìn)行第一輪 擴(kuò)增，然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No.23-25所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò) 增，得到抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)的編碼基因片段；
[0028] (4)擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體恒定區(qū)-PolyA的編碼基因
[0029] a抗體I gG 1重鏈恒定區(qū)編碼基因 -Po 1 yA的擴(kuò)增
[0030]以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)的全基因序列的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒 為模板，利用SEQ ID No.26以及29所示的引物擴(kuò)增得到IgGl的恒定區(qū)-PolyA編碼基因片 段；
[0031 ] b抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)編碼基因 -PolyA的擴(kuò)增
[0032]以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)的全基因序列的PCDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模 板，利用SEQ ID No.27以及29所示的引物擴(kuò)增得到抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因片 段；
[0033] c抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)編碼基因 -PolyA的擴(kuò)增
[0034]以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)的全基因序列的PCDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模 板，利用SEQ ID No.28以及29所示的引物擴(kuò)增得到抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因片 段；
[0035] (5)CMV啟動子片段的擴(kuò)增：
[0036]以pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用SEQ ID如.30以及31所示的引物擴(kuò)增得到〇1^ 啟動子片段；
[0037] (6)含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長序列的擴(kuò)增：
[0038] 以擴(kuò)增得到的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)、重鏈或輕鏈的可變區(qū)以及CMV啟動子片段為 模板，利用SEQ ID No.29以及30所示的引物，擴(kuò)增得到含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的 全長序列；
[0039] (7)抗體重鏈以及輕鏈的配對轉(zhuǎn)染：
[0040]于293T細(xì)胞上，將步驟(6)獲得的含有CMV啟動子片段的重鏈和輕鏈的全長序列進(jìn) 行共同轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后收集上清，對抗體進(jìn)行篩選，即得到所述的全豬源單克隆抗體。
[0041] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)染是取步驟(6)獲得的含有CMV啟動子 片段的重鏈或輕鏈的全長序列PCR產(chǎn)物各0.6yg，加入到100μΙ DMEM中，根據(jù)QIAGEN Attractene轉(zhuǎn)染試劑的說明書操作，加入轉(zhuǎn)染試劑4.5μ1，室溫作用15min后，加入到293Τ細(xì) 胞中，轉(zhuǎn)染后72h收集上清，對抗體進(jìn)行篩選。
[0042] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，抗體重鏈可變區(qū)編碼基因第一輪擴(kuò)增的PCR程序 為:98°(：108、571€58、72 1€908,35個(gè)循環(huán);721€51^11，第二輪擴(kuò)增的？〇?程序?yàn)?95 1€51^11;98 。(：1〇8、58。〇58、72。(：111^11，35個(gè)循環(huán) ；721€511^11。
[0043] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因的第一輪擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)?98°(：108、551€58、721€608,35個(gè)循環(huán);72 1€51^11，第二輪擴(kuò)增的？〇?程序?yàn)?951€ 511^11 ;981€3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán)；72 1€511^11。
[0044] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因第一輪擴(kuò)增的PCR 程序?yàn)椋?8°(：1〇8、551€58、721€6〇8,35個(gè)循環(huán)；72 1€51^11，第二輪擴(kuò)增的？0?程序?yàn)椋?51€ 511^11 ;98。(：1〇8、661€58、721€6〇8、35個(gè)循環(huán)；72 1€511^11。
[0045] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，抗體IgGl重鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因擴(kuò)增的PCR 程序?yàn)椋?41€2111丨11;98°(：1〇8、6〇1€58、72 1€6〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。
[0046] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)編碼基因-PolyA擴(kuò)增的PCR 程序?yàn)椋?5°C5min;98°C30s、68°C90s、35個(gè)循環(huán)；72°C5min ;抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)編碼基因-polyA擴(kuò)增的PCR程序?yàn)?94°C2min;98°C10s、60°C5s、72°C60s、35個(gè)循環(huán) ；72°C5min。
[0047]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，CMV啟動子片段擴(kuò)增的PCR程序?yàn)?95°C5min;98 。〇3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。
[0048] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長序列擴(kuò) 增的 PCR 程序?yàn)椋?51€5111丨11;981€3〇8、68 1€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。
[0049] 本發(fā)明首次建立了全豬源單個(gè)B細(xì)胞PCR抗體技術(shù)，可用于分離任何豬源病毒的全 豬源單克隆抗體。本發(fā)明利用已有的豬抗體基因文庫，設(shè)計(jì)了多套引物，利用套式PCR，從單 個(gè)B細(xì)胞擴(kuò)增出抗體可變區(qū)基因，進(jìn)而獲得具有中和抗體效價(jià)的全豬源單克隆抗體。本發(fā)明 首次建立了一種利用高通量單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法，相較于傳統(tǒng)的 抗體制備技術(shù)具有效率高、全豬源、基因多樣性好等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的提出為研究豬的抗體免 疫應(yīng)答和分離治療性抗體提供了一種新的技術(shù)手段。
【附圖說明】
[0050] 圖1為PEDV抗體監(jiān)測結(jié)果；
[0051] 圖2為重鏈可變區(qū)編碼基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0052] 1:10(^卩]\&^1?^，2-7:來自7個(gè)不同孔的￥!1186?〇^擴(kuò)增結(jié)果；
[0053] 圖3為輕鏈可變區(qū)編碼基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0054] Α.λ鏈可變區(qū)。1-5:不同孔的PCR擴(kuò)增結(jié)果;6:100bp DNA
[0055] Β·κ鏈可變區(qū)。l:l〇〇bp DNA marker;2-5:不同孔的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0056] 圖4為恒定區(qū)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0057] 1：CMV；2:IgG-CH；3:CA；4:Ck；M1:Marker1OObp；M2:DL2000
[0058] 圖5為重輕鏈全長片段PCR組裝擴(kuò)增結(jié)果；
[0059] Ml:100bp Marker；M2:DL2000marker；1:IgG；2：A；3：K
[0060] 圖6為抗體的PEDV病毒抑制實(shí)驗(yàn)的間接免疫熒光結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0061]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0062]下面僅以PEDV為例說明全豬源抗PEDV單克隆抗體的制備過程，對于其他病毒單抗 的制備與此方法相同，根據(jù)需要，只需將免疫程序中所使用的PEDV和篩選的特異性抗原替 換為其他病毒和抗原即可，本實(shí)施例不再進(jìn)行贅述。
[0063]實(shí)施例1利用單個(gè)B細(xì)胞PCR單克隆抗體技術(shù)分離全豬源抗PEDV單克隆抗體方法的 建立
[0064] 1、動物免疫
[0065] 選用3頭35日齡左右的健康長白仔豬，編號分別為#241，#242，#243，分別用2ml的 PEDV CV777病毒株（104TCID5Q/ml)后海穴注射(首免）；間隔2周，用2倍首免劑量滅活病毒再 進(jìn)行后海穴注射(二免）；2周后，用本實(shí)驗(yàn)室分離的，與二免相同劑量的PEDV強(qiáng)毒株LNCT2株 進(jìn)行加強(qiáng)免疫。監(jiān)測ELI SA抗體和中和抗體效價(jià)。剖殺，收集抗凝血和腸系膜淋巴結(jié)。
[0066] 2、單個(gè)B淋巴細(xì)胞的分離和篩選：
[0067] 采用PEDV Spike蛋白和抗豬IgG雙標(biāo)記選擇PEDV抗原特異性的豬記憶性淋巴細(xì) 胞。
[0068] 2.1 PEDV陽性B淋巴細(xì)胞的分選：
[0069]取PEDV中和抗體陽性豬的外周抗凝血和腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)梯度離心分離淋巴細(xì) 胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至1X106個(gè)ΛΟΟμΙ，在200μ1細(xì)胞中加入2μ1的抗豬IgG-FITC和anti-PEDV S1-PE進(jìn)行雙染，并設(shè)對照，混勻，4°C避光孵育eOminJOOg/min離心5min，l%BSA PBS 洗滌3次，用200μ1 1%BSA的roS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行B淋巴細(xì)胞分選，把FITC和 PE雙陽性單個(gè)B淋巴細(xì)胞分離至96孔板的孔中。
[0070] 2.2單個(gè)B淋巴細(xì)胞的處理：
[0071] 將預(yù)先配制的含RNA抑制劑的細(xì)胞裂解液（1ml dH20，10yl 1M Tris ρΗ8.0,25μ1 RNase Inhibitor)，加入到96孔板中，10μ1/孔。流式細(xì)胞儀分選的單個(gè)Β淋巴細(xì)胞直接放置 干冰上迅速冷凍，冷凍后轉(zhuǎn)移至-80°C保存至RT-PCR。
[0072] 3單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體的制備：
[0073]首先對分選的單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)增出抗體可變區(qū)基因。本實(shí)驗(yàn)針對 豬源抗體的重、輕鏈可變區(qū)設(shè)計(jì)多對引物，用來擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測 序分析，如有功能，應(yīng)用體外重疊 PCR組裝成完整的重鏈和輕鏈，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并分析共 轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞上清所產(chǎn)生抗體的中和活性。
[0074] 3.1單個(gè)B淋巴細(xì)胞Ig基因的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、測序：
[0075] 3.1.1 制備 cDNA:
[0076] 以分選單個(gè)B淋巴細(xì)胞的RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以隨機(jī)引物Random mers和特異 性引物IGH cDNA RT primer，IGAV RT primer，IGkV RT primer，IGA Ext PCR rev primer (分別為表1中SEQ ID No. 1-4所示）為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。操作方法見反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)說明書。引物序列見 表1。
[0077] 表1擴(kuò)增抗體可變區(qū)的引物
[0078]
[0080]
[0081] 注：r=a/G，Y = C/T，S = C/G，M=A/C。
[0082] 3.1.2擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體可變區(qū)基因
[0083] 3.1.2.1抗體可變區(qū)引物設(shè)計(jì)：
[0084] 抗體可變區(qū)基因采用套式PCR擴(kuò)增。豬抗體可變區(qū)基因存在很多變異，根據(jù)抗體基 因文庫（IMGT)已有的豬抗體可變區(qū)基因，在抗體的前導(dǎo)序列、1框架區(qū)及J序列，利用 Primerf軟件設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)（VH)、k輕鏈可變區(qū)(Vk)和λ輕鏈可變區(qū)（νλ)，引 物序列如表1中SEQ ID No.5-25所示。
[0085] 3.1.2.2豬源抗體可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0086] 3.1.2.2.1重鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0087] 以3.1.1擴(kuò)增得到的。0嫩為模板，利用18狀18七？〇??口411161、186 61七？〇?1^￥ primer、IgA Ext PCR rev primer引物（分別為表1中SEQ ID Νο·5-7所示）進(jìn)行套式PCR的 重鏈第一輪擴(kuò)增。PCR 程序:98°(：1〇8、571€58、721€9〇8,35個(gè)循環(huán);72 1€51^11。
[0088] 以第一輪產(chǎn)物為模板，利用IgHV Int PCR F primer，IgGlJl-3 2nd rev primer 和IgGlJ5 2nd rev primer引物(分別為表1中SEQ ID No.8-10所示)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng) 程序:951€51^11;98°(：108、58 1€58、72°(：1111丨11，35個(gè)循環(huán);721€5111丨11。將符合預(yù)期大小?〇?產(chǎn)物 (約400bp)進(jìn)行PCR純化并測序。
[0089] 3.1 ·2·2·2 λ輕鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0090] 以3.1.1擴(kuò)增得到的〇0財(cái)為模板，利用16人￥3 18七？0??卩411166 16人￥2-6 18七 PCRFprimer，IGλV8 1stPCRFprimer(分別為表l中SEQIDNo·ll-13所示）和IGλVlst Rev primer引物(表1中SEQ ID No. 14所示)進(jìn)行套式PCR的輕鏈λ鏈的第一輪擴(kuò)增;PCR程序 為：98°(：1〇8、551€58、72 1€6〇8,35個(gè)循環(huán)；721€511^11。
[0091]以輕鏈λ鏈的第一輪產(chǎn)物為模板，利用不同的上游引物IGAV8int PCR F primer， IGAV3-2int PCR F primer，IGXV3-3int PCR F primer，IGXV3-5int PCR F primer(分別 為表1中SEQ ID No. 15-18所示）和同一下游引物IGAV 2nd rev primer(表1中SEQ ID 吣.19所示)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)程序:95￡€511^11;98 1€3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán);721€51^11。 將符合預(yù)期大小PCR產(chǎn)物(約350bp)進(jìn)行PCR純化并測序。
[0092] 3.1 ·2·2·3 κ輕鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0093]以cDNA為模板，利用IGkVI 1st PCR F primer，IGKV2 1st PCR F primer(分別為 表1 中SEQ ID Ν〇·20、21所示）和IGkV 1st PCR rev primer引物（表1 中SEQ ID Νο·22所示） 進(jìn)行套式PCR的輕鏈κ鏈的第一輪擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?98°(：1〇8、551€58、721€6〇8,35個(gè)循環(huán) ;72 °C5min〇
[0094] 以輕鏈κ鏈的第一輪產(chǎn)物為模板，利用不同的上游引物IGkVI V3F primer，IGKV2 V3F primer(分別為表1中SEQ ID Νο·23和24所不）和同一下游引物IGKV2nd rev primer (表1中SEQ ID如.25所示）進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95￡€5!1^11;98°(：1〇8、66 1€58、721€ 60s、35個(gè)循環(huán);72°C5min。將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(約350bp)進(jìn)行PCR純化并測序。
[0095] 3.1.3 PCR產(chǎn)物測序和序列分析：
[0096] 利用頂GT-V/QUEST以及NCBI對測序的抗體可變區(qū)進(jìn)行分析。
[0097] 3.1.4抗體重輕鏈全長的擴(kuò)增：
[0098] 利用融合PCR將抗體重輕鏈分別與CMV和恒定區(qū)的片段連接起來，構(gòu)成CMV+VH/VA/ VK+CH/a/CK序列。各引物序列見表2。
[0099]表2擴(kuò)增抗體恒定區(qū)、CMV和全長的引物 「01001
Lmm」3.1.4.1抗體恒定兇-PolyA片段的擴(kuò)增：
[0102] 3.1.4.1.1豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增
[0103]以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)（GenBank:U03781 . 1 )的 pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用IgG-H2ndFprimer(表2中SEQIDNo.26所示）為上游引 物，BGH R1235(表2中SEQ ID化.29所示）為下游引物擴(kuò)增461的恒定區(qū)。反應(yīng)程序:941€ 211^11;98°(：108、60 1€58、721€608、35個(gè)循環(huán)；721€5111丨11 ;將符合預(yù)期大?。?20(^口）的重鏈恒 定區(qū)-Poly A PCR片段回收并純化。
[0104] 3.1.4.1.2豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增
[0105]以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)（GenBank : FP3 1 2898， gl32117 …132442)的 pcDNA3.1 表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用 IgCK2nd F primer(表2 中 SEQ ID No. 28所示)為上游引物，BGH R1235(表2中SEQ ID No. 29所示)為下游引物擴(kuò)增輕鏈κ鏈的 恒定區(qū)。反應(yīng)程序:94￡€211^11;98°(：1〇8、6〇 1€58、721€6〇8、35個(gè)循環(huán)；721€51^11 ;將符合預(yù)期 大小(570bp)的κ輕鏈恒定區(qū)-Poly A PCR片段回收并純化。
[0106] 3.1.4.1.3豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增
[0107] 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)（GenBank:CU467669，g2693. .3009) 的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用IgCλ2ndFprimer(表2中SEQIDNo.27所示）為上游引 物，BGH R1235(表2中SEQ ID No.29所示)為下游引物擴(kuò)增IgGU鏈的恒定區(qū)。反應(yīng)程序:95 ￡€511^11;98 1€3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€51^11 ;將符合預(yù)期大?。?7(^?)的人輕鏈恒定區(qū)- Poly A PCR片段回收并純化。
[0108] 3.1.4.2 CMV啟動子片段的擴(kuò)增：
[0109] 以pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板，以CMVF262(表2中SEQIDNo.30所示)為上游引物， CR942V2(表2中SEQ ID如.31所示)為下游引物擴(kuò)增01^啟動子片段，反應(yīng)程序:95￡€511^11; 98°C30s、68°C90s、35個(gè)循環(huán);72°C5min。將符合預(yù)期大小(650bp)的PCR片段回收并純化。
[0110] 3.1.4.3全長的擴(kuò)增：
[0111] 以CMV F262(表2中SEQ ID No.30所示）為上游引物，BGH R1235(表2中SEQ ID No.29所示)為下游引物，以重/輕鏈的恒定區(qū)、重/輕鏈的可變區(qū)和CMV片段為模板，擴(kuò)增含 有CMV啟動子片段的重鏈/輕鏈的全長序列。反應(yīng)程序 :95°C5min;98°C30s、68°C90s、35個(gè)循 環(huán)；72°C5min。將符合預(yù)期大小的抗體的重鏈（2200bp)和輕鏈（1500bp)PCR片段回收并純 化。
[0112] 3.1.4.4抗體重輕鏈的配對轉(zhuǎn)染：
[0113] 于293T細(xì)胞上，將配對純化的抗體的重鏈和輕鏈片段進(jìn)行共同轉(zhuǎn)染，按照QIAGEN Attractene轉(zhuǎn)染試劑的說明書操作。取重輕鏈PCR各0.6yg(以24孔板為例），加入到100μΙ DMEM中，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的說明書(Qiagen)，加入轉(zhuǎn)染試劑4.5μ1，室溫作用15min，將液體加 入到細(xì)胞(提前用3%FBS，1%雙抗的DMEM換液）；轉(zhuǎn)染后72h收集上清，應(yīng)用PEDV的ELISA試 驗(yàn)和PEDV感染抑制試驗(yàn)對抗體進(jìn)行篩選。
[0114] 4抗體鑒定及篩選
[0115] 4.1 ELISA 檢測方法
[0116] 4· 1 · 1 抗PEDV ELISA檢測方法
[0117] 用PBS稀釋PEDV CV777病毒至2.5X103TCID5〇/ml，包被酶標(biāo)版，100μΙ/孔，4°C過 夜。采用0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min;5%脫脂乳和5%FBS的PBS封閉酶 標(biāo)板，200μ1/孔，37 °C，2h，洗板;用抗體轉(zhuǎn)染上清孵育酶標(biāo)板，37 °C lh，洗板;洗滌后加 HRP標(biāo) 記的抗豬的抗體(Rabbit anti-pig IgG_HRP，catab6777，8000倍稀釋），于37°C作用lh，洗 板;通過TMB(amiresco)使底物顯色，100μ1/孔，37°C作用lOmin;最后以211濃硫酸50μ1/孔終 止反應(yīng)，測定0D450nm值。
[0118] 4.1.2 抗豬IgG ELISA檢測方法
[0119] 用pH9.6的碳酸鹽包被液稀釋鼠抗豬IgG(BD公司，cat552554)至2μg/ml，包被酶標(biāo) 版，1〇〇μ1/孔，4°C過夜。采用0 · 05 % Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min; 5 %脫脂乳和 5%FBS的roS封閉酶標(biāo)板，200μ1/孔，37°C，2h，洗板;用抗體轉(zhuǎn)染293T上清孵育酶標(biāo)板，37°C lh，洗板;洗滌后加 HRP標(biāo)記的抗豬的抗體(Rabbit anti-pig IgG-HRP，catab6777,16000倍 稀釋），于37°C作用lh，洗板;通過TMB(amiresco)使底物顯色，100μ1/孔，37°C作用15min;最 后以211濃硫酸50μ1/孔終止反應(yīng)，測定0D450nm值。
[0120] 4.2抗體的PEDV病毒抑制實(shí)驗(yàn)
[0121] 該實(shí)驗(yàn)包括檢測抗PEDV IgG感染細(xì)胞的制備及間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA)，操作如 下：
[0122] 4.2.1檢測抗PEDV IgG感染細(xì)胞的制備：
[0123] 將Ver〇-E6細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板，至細(xì)胞長成單層后，取160μ1 293T抗體轉(zhuǎn)染上 清，與80μ1 PEDV CV777(104TCID5〇/ml，l:50稀釋，含3μ1/πι1 0.05%胰酶，1%雙抗）混合，37 。(：，孵育lh。用無血清DMEM洗96孔板上的Ver〇-E6細(xì)胞2次，加入上述液體，37°C，繼續(xù)孵育 2h;再用無血清DMEM洗Ver〇-E6細(xì)胞2次洗細(xì)胞，加入3%FBS DMEM營養(yǎng)液。48h后，棄上清液， PBST洗滌3次，每孔加入冷4%多聚甲醛100μΙ，4°C固定30min;甩干，PBST洗滌3次，每孔加入 0 · 2%Triton-ΧΙΟΟ 100μΙ，室溫通透 15min;甩干，PBST洗滌3次，每孔加入 10 %FBS的PBST 100μ1，37Γ封閉2h;甩干，PBST洗滌3次。-20°C凍存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn) (IFA)〇
[0124] 4.2.2間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA):
[0125] 檢測時(shí)，于上述細(xì)胞板中，每孔加入100μΙ (100倍稀釋）的抗PEDV核衣殼蛋白鼠源 單克隆抗體腹水(本實(shí)驗(yàn)室提供），于37°C作用30min，用PBST洗滌3次;每孔加入100μ1(200 倍稀釋)Alexa Fluor 546熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗，于37°C作用lh，用PBST洗滌3次;加入100 μL (10000倍稀釋）的DAPI，于室溫作用10min，用PBST洗滌3次;每孔加入50μ1的roS，于倒置 熒光顯微鏡(OLYMPUS型）下觀察。
[0126] 5、結(jié)果：
[0127] 5.1豬免疫后血清的PEDV抗體效價(jià)：
[0128] ELISA抗體監(jiān)測曲線如圖1所示，中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果如表3。
[0129] 表3中和抗體效價(jià)
[0130]
[0131] 5.2重鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0132] 96孔分選的單個(gè)B淋巴細(xì)胞裂解物經(jīng)RT-PCR成功擴(kuò)增得到大小約為400bp的PCR產(chǎn) 物，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致；回收大小正確的PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)與抗體基因庫aMGT)比對 分析證實(shí)PCR產(chǎn)物為豬抗體重鏈可變區(qū)IgG VH(圖2)。
[0133] 5.3輕鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增：
[0134] 96孔分選的單個(gè)B淋巴細(xì)胞裂解物經(jīng)PCR成功擴(kuò)增得到大小約為400bp的PCR產(chǎn)物， 與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致；回收大小正確的PCR產(chǎn)物測序分析，經(jīng)與抗體基因庫aMGT)比對 分析證實(shí)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物分別為豬抗體λ輕鏈可變區(qū)（Ig νλ)和豬抗體κ輕鏈可變區(qū)（Ig Vi〇(圖 3)。
[0135] 5.4恒定區(qū)的擴(kuò)增：
[0136] 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有豬抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板 PCR擴(kuò)增CMV片段大小約650bp; IgG-CH片段大小約1200bp; a和Ck大小約為570bp，與預(yù)期擴(kuò) 增結(jié)果一致(圖4)，并測序確認(rèn)。
[0137] 5.5體外組裝抗體全長片段：
[0138] 利用重疊 PCR將CMV啟動子、抗體可變區(qū)和恒定區(qū)3個(gè)片段組裝含CMV啟動子和Poly A尾巴的重鏈和輕鏈全長片段:IgG全長大小約為2200bp;A和κ鏈全長大小約1500bp;與預(yù)期 擴(kuò)增結(jié)果一致(圖5)。
[0139] 5.6抗體轉(zhuǎn)染上清的ELISA檢測：
[0140] 將293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后含有的抗體上清進(jìn)行ELISA檢測，在陰陽對照成立的情況下，如 表4所示，0D值均較高于陰性對照2倍以上。證明同時(shí)轉(zhuǎn)染本發(fā)明組裝的豬的重鏈和輕鏈后 的293T細(xì)胞成功分泌豬IgG抗體，命名為PC10,并且該抗體能夠結(jié)合PEDV病毒，證實(shí)為豬源 的抗PEDV抗體。
[0141] 表4抗體轉(zhuǎn)染上清的ELISA檢測結(jié)果
[0142]
[0143] 5.7抗體的PEDV病毒抑制實(shí)驗(yàn)：
[0144] 為進(jìn)一步證實(shí)分離到的抗PEDV抗體有中和活性，本發(fā)明進(jìn)行了 PEDV抑制實(shí)驗(yàn)。如 圖6,結(jié)果顯示，陰性對照細(xì)胞對照組和陰性血清對照組的鏡下觀察中，兩者對病毒沒有任 何中和作用，病毒感染大部分Ver〇-E6細(xì)胞，細(xì)胞在鏡下呈現(xiàn)紅色熒光，與細(xì)胞核DAPI染色 重疊，呈現(xiàn)紅藍(lán)相疊的效果;而在PEDV高免陽性血清對照組的鏡下觀察中，如我們所預(yù)期的 一樣，陽性血清幾乎完全中和了病毒，表現(xiàn)為Ver〇-E6細(xì)胞在鏡下僅呈現(xiàn)藍(lán)色的DAPI染色熒 光;在豬源化抗體PC10作用的細(xì)胞孔中，抗體抑制了絕大部分病毒感染，紅色熒光顯著減 少，說明本發(fā)明所獲得的PC10抗體具有抑制PEDV病毒的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的引物組，其特征在于包括： (1) 用于單個(gè)B淋巴細(xì)胞cDNA擴(kuò)增的引物，所述引物由一條隨機(jī)引物和4條特異性引物 組成，所述的4條特異性引物的序列分別如SEQ ID No. 1-4所示； (2) 用于重鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.5-10 所示，其中SEQ ID No.5-7所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.8-10所示的引物用于第 二輪擴(kuò)增； (3) 用于輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.11-18所示，其中SEQ ID No.11-14所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.15-19所示 的引物用于第二輪擴(kuò)增； (4) 用于輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.20-25所示，其中SEQ ID No.20-22所示的引物用于第一輪擴(kuò)增，SEQ ID No.23-25所示 的引物用于第二輪擴(kuò)增； (5) 用于豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.26以及29所示； (6) 用于豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No. 27以及29所示； (7) 用于豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)編碼基因擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No. 28以及29所示； (8) 用于CMV啟動子片段擴(kuò)增的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.30以及31所 示； (9) 用于擴(kuò)增抗體全長的引物，所述的引物的序列分別如SEQ ID No.30以及29所示。2. 權(quán)利要求1所述的引物組在利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體中的用 途。3. -種利用單個(gè)B細(xì)胞PCR技術(shù)生產(chǎn)全豬源單克隆抗體的方法，其特征在于包括以下步 驟： (1) B淋巴細(xì)胞的分離和篩選 從被抗原免疫的動物外周血中分離得到淋巴細(xì)胞，采用密度梯度離心純化;將抗原采 用生物素或熒光素進(jìn)行標(biāo)記后，使其與特異性B淋巴細(xì)胞結(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行B淋巴 細(xì)胞分選，把目標(biāo)單個(gè)B淋巴細(xì)胞分離至96孔板的孔中； (2) 擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞的cDNA 以步驟(1)分選的單個(gè)B淋巴細(xì)胞的RNA為模板，利用隨機(jī)引物和4條特異性引物逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA，所述的4條特異性引物的序列分別如SEQ ID No. 1-4所示； (3) 擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體可變區(qū)的編碼基因 a抗體重鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增： 以步驟(2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No.5-7所示的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增， 然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No.8-10所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，得到 抗體重鏈可變區(qū)的編碼基因片段； b抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增： 以步驟（2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No. 11-14所示的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò) 增，然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No.15-19所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增， 得到抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)的編碼基因片段； c抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因的擴(kuò)增： 以步驟（2)擴(kuò)增得到的cDNA為模板，利用SEQ ID No.20-22所示的引物進(jìn)行第一輪擴(kuò) 增，然后以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，利用SEQ ID No.23-25所示的引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增， 得到抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)的編碼基因片段； (4) 擴(kuò)增單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體恒定區(qū)-PolyA的編碼基因 a抗體IgGl重鏈恒定區(qū)編碼基因-PolyA的擴(kuò)增 以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體IgGl重鏈恒定區(qū)的全基因序列的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模 板，利用SEQ ID No.26以及29所示的引物擴(kuò)增得到IgGl的恒定區(qū)-PolyA編碼基因片段； b抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)編碼基因 -Po lyA的擴(kuò)增 以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體λ輕鏈恒定區(qū)的全基因序列的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板， 利用SEQ ID No.27以及29所示的引物擴(kuò)增得到抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因片段； c抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)編碼基因-PolyA的擴(kuò)增 以構(gòu)建好的含有編碼豬抗體κ輕鏈恒定區(qū)的全基因序列的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板， 利用SEQ ID No.28以及29所示的引物擴(kuò)增得到抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因片段； (5) CMV啟動子片段的擴(kuò)增： 以pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用SEQ ID No. 30以及31所示的引物擴(kuò)增得到CMV啟動 子片段； (6) 含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長序列的擴(kuò)增： 以擴(kuò)增得到的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)、重鏈或輕鏈的可變區(qū)以及CMV啟動子片段為模板， 利用SEQ ID No.29以及30所示的引物，擴(kuò)增得到含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長 序列； (7) 抗體重鏈以及輕鏈的配對轉(zhuǎn)染： 于293T細(xì)胞上，將步驟(6)獲得的含有CMV啟動子片段的重鏈和輕鏈的全長序列進(jìn)行共 同轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后收集上清，對抗體進(jìn)行篩選，即得到所述的全豬源單克隆抗體，其中，優(yōu)選 的，所述的轉(zhuǎn)染是取步驟(6)獲得的含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長序列PCR產(chǎn)物 各0.6yg，加入到100μΙ DMEM中，根據(jù)QIAGENAttractene轉(zhuǎn)染試劑的說明書操作，加入轉(zhuǎn)染 試劑4.5μ1，室溫作用15min后，加入到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后72h收集上清，對抗體進(jìn)行篩選。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于抗體重鏈可變區(qū)編碼基因第一輪擴(kuò)增的PCR程 序?yàn)?98°(：108、571€58、72 1€908,35個(gè)循環(huán);721€51^11，第二輪擴(kuò)增的？〇?程序?yàn)?95 1€51^11; 98。(：1〇8、581€58、72。(：111^11，35個(gè)循環(huán)；721€511^11。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于抗體輕鏈λ鏈可變區(qū)編碼基因的第一輪擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)?98°(：108、551€58、721€608,35個(gè)循環(huán);72 1€51^11，第二輪擴(kuò)增的？〇?程序?yàn)?951€ 511^11 ;981€3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán)；72 1€511^11。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于抗體輕鏈κ鏈可變區(qū)編碼基因第一輪擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)?98°(：108、551€58、721€608,35個(gè)循環(huán);72 1€51^11，第二輪擴(kuò)增的？〇?程序?yàn)?951€ 511^11 ;98。(：1〇8、661€58、721€6〇8、35個(gè)循環(huán)；72 1€511^11。7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于抗體IgGl重鏈恒定區(qū)-PolyA編碼基因擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)椋?41€211^11;98°(：1〇8、6〇1€58、72 1€6〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。8. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于抗體輕鏈λ鏈恒定區(qū)編碼基因-PolyA擴(kuò)增的 PCR程序?yàn)椋?5￡€5!1^11;981€3〇8、68 1€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€51^11;抗體輕鏈1〇鏈恒定區(qū)編碼基 因 -PolyA 擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)?941€211^11;98°(：1〇8、6〇1€58、72 1€6〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。9. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于CMV啟動子片段擴(kuò)增的PCR程序?yàn)?95°C5min; 98。〇3〇8、681€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。10. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于含有CMV啟動子片段的重鏈或輕鏈的全長序 列擴(kuò)增的 PCR 程序?yàn)椋?51€511^11;981€3〇8、68 1€9〇8、35個(gè)循環(huán)；721€511^11。
【文檔編號】C12N15/10GK106086009SQ201610437224
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】劉平黃, 符芳, 薛美, 馮力
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所