一種用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所述。該重組質(zhì)粒局部注射乳腺癌可明顯抑制腫瘤癌旁基質(zhì)中腫瘤相關(guān)蛋白的活性。FuGW-CSD重組質(zhì)粒局部注射乳腺癌可明顯抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制其轉(zhuǎn)移。
【專利說明】一種用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種重組質(zhì)粒，通過表達(dá)目的肽段，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用，達(dá)到對(duì)乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制目的。
【背景技術(shù)】
[0002]上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransition, EMT),即上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的核心環(huán)節(jié)。[0003]基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β是目前已知的參與EMT的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。MMP是具有降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，是目前已知的唯一能降解膠原纖維的酶類，其活性對(duì)細(xì)胞粘附系統(tǒng)的失活有一定作用。其在腫瘤生長(zhǎng)，血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用JGF-β主要通過各整合素信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)EMT的發(fā)生，促進(jìn)Smad3分子依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程，也可以通過非Smad分子依賴的P38MAP激酶途徑及GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)EMT發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，TGF-β促使細(xì)胞周期阻滯，加速凋亡，還能誘導(dǎo)維持EMT狀態(tài)。
[0004]Cav-1通過腳手架區(qū)(CSD區(qū))與TGF-β I受體激酶活性區(qū)結(jié)合，抑制TGF調(diào)節(jié)Smad-2的磷酸化及其下游活動(dòng)，起到激酶抑制劑的作用；CAV基因水平消除MMP2和9的表達(dá)與分泌，而且CAV過表達(dá)顯著降低MMP的分泌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種用于治療抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的重組質(zhì)粒。
[0006]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
[0007]本發(fā)明所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD表達(dá)序列串聯(lián)重復(fù)3次，該小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所述，在FuGW慢病毒質(zhì)粒中泛素化啟動(dòng)子下，通過BamH I和Bgl II酶切位點(diǎn)相連。
[0008]本發(fā)明所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。
[0009]本發(fā)明所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD編碼氨基酸序列如SEQ ID N0:4所述。
[0010]本發(fā)明所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下:
(一)小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD的表達(dá)序列片段的設(shè)計(jì)=WNCBI上獲得CAV-1 CSD區(qū)的表達(dá)序列，將該段序列串聯(lián)重復(fù)三次，在兩端引入BamH I和Bgl II同尾酶酶切位點(diǎn)，根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)用于搭接PCR的引物:
【權(quán)利要求】
1.一種用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，其特征在于:小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD表達(dá)序列串聯(lián)重復(fù)3次，該小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1CSD編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所述，在FuGW慢病毒質(zhì)粒中泛素化啟動(dòng)子下，通過BamH I和Bgl II酶切位點(diǎn)相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，其特征在于:小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒，其特征在于:小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1 CSD編碼氨基酸序列如SEQ ID N0:4所述。
5.如權(quán)利要求1所述的用于抑制乳腺腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下: (一)小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1CSD的表達(dá)序列片段的設(shè)計(jì):從NCBI上獲得CAV-1 CSD區(qū)的表達(dá)序列，將該段序列串聯(lián)重復(fù)三次，在兩端引入BamH I和Bgl II同尾酶酶切位點(diǎn)，根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)用于搭接PCR的引物:
Primerl-Sj:
CAAATATTGGTTTTATCGCGATGGCATTTGGAAAGCGAGCTTTACCACCTTTACCGTGACCAAATATTG ； primerU’:
GTCACGGTAAAGGTGGTAAAGCTCGCTTTCCAAATGCCATCGCGATAAAACCAATATTTGGTCACGGTA ；
primer2-5>:
GGATCCCGCAGCGATGGCATTTGGAAAGCGAGCTTTACCACCTTTACCGTGACCAAATATTGGTTTTATCG ；
primer2-3>: AGATCTGCTGCCGCGATAAAACCAATATTTGGTCACGGTAAAGGTGGTA ； (二)小窩蛋白腳手架區(qū)CAV-1CSD的表達(dá)序列片段的獲得:用搭接PCR的方法得到CAV-1 CSD三次串聯(lián)的序列，PCR過程使用TaqDNA聚合酶，此PCR產(chǎn)物兩端含有單個(gè)堿基A，將其于T載體在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到含有CAV-1 CSD三次串聯(lián)的T載體質(zhì)粒; (三)重組質(zhì)粒FuGW-CSD的構(gòu)建:將步驟(二)得到的T載體質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Bgl II雙酶切，BamH I和Bgl II是同尾酶，將FUGW慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行BamH I單酶切，PCR產(chǎn)物通過BamH I酶切位點(diǎn)克隆入FUGW慢病毒質(zhì)粒泛素化啟動(dòng)子之下。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103540612SQ201310494959
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】孫巍, 遇紅梅, 房明麗, 王麗穎 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)