一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，該序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。該序列是一種新的BADH基因序列，使人們對BADH基因的研究對象從微生物及常見植物體進一步擴展到瀕危滅絕的荒漠植物。并且，根據(jù)該BADH基因在植物體內(nèi)催化合成的甜菜堿所表現(xiàn)出的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能可以預(yù)料：如果將其通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入玉米等其他植物，將可以培育出具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。本發(fā)明還公開了一種上述來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列的克隆方法。
【專利說明】一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬于豆科沙冬青屬，是第三紀(jì)古地中海消失后殘遺在塔里木盆地邊緣荒漠的超旱生常綠闊葉灌木，間斷性分布于西天山與昆侖山的結(jié)合部。由于自然歷史原因和人類經(jīng)濟活動的影響，特別是過度放牧及樵采，矮沙冬青種群衰退嚴重，被列為國家一級瀕危保護植物，其分布區(qū)內(nèi)氣候干旱，降水量遠小于蒸發(fā)量，年平均氣溫6.8°C，氣溫變化極值可達70°C以上。沙冬青具有很強的抗逆性，在相對瘠薄的土壤條件下仍能在高達70°C左右的地表沙溫和低至零下20°C~30°C的環(huán)境中正常生長發(fā)育。有很強的抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗逆特性。國內(nèi)外關(guān)于沙冬青屬植物的報道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機理及相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)；染色體數(shù)目及核型、減數(shù)分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗等。這些研究都證實了沙冬青具有抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。
[0003]甜菜堿醛脫氫酶是催化合成甜菜堿的關(guān)鍵酶之一，其催化合成產(chǎn)物(甜菜堿)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞滲透勢的調(diào)節(jié)、生物大分子的穩(wěn)定具有重要作用。甜菜堿醛脫氫酶基因的表達能顯著提高植物耐鹽能力；此外，還可以增強植物對干旱脅迫的耐受力。屬于優(yōu)良的抗逆基因資源，在植物抗逆基因工程中廣泛利用。
[0004]矮沙冬青作為優(yōu)秀的抗逆植物，克隆上述抗逆基因?qū)A(chǔ)和應(yīng)用研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要目的就是針對荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因開發(fā)研究的局限性，提供一種來源于植物矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，以期應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)基因作物中使之具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗逆性能。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。
[0007]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，該序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
[0008]該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。
[0009]上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物矮沙冬青葉片中提取總RNA、設(shè)計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到。
[0010](I)總RNA的提取和純化:
可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA。
[0011]常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進方法等，均可用于矮沙冬青葉片總RNA的提??；本發(fā)明中可優(yōu)選試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNA0UT2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)，進行矮沙冬青葉片總RNA提取。
[0012]純化主要是為了去除總RNA中的DNA污染，獲得純化的矮沙冬青葉片總RNA，以滿足后續(xù)對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方法包括:DNA酶消化法(簡稱D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(簡稱E法)等；本發(fā)明中可優(yōu)選DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。
[0013](2)中間片段的克隆:
A、中間片段cDNA第一鏈的合成
以上述步驟(1)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACECore Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3Λ RACE Adaptor 進行反轉(zhuǎn)錄,得到的 cDNA 第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板。
[0014]B、PCR 擴增
以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物(jf)和下游引物(jx)，進行PCR擴增:
jf: 5,-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3,，
jx: 5、GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3,；
擴增得到矮沙冬青的甜菜堿醛脫 氫酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。
[0015]本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為:
TaqPlusPCR Master Mix20 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2Χ 引物(jx/jf)I UL ,
ddH2016 μ L ο
[0016]擴增程序可優(yōu)選為:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C,40 s (30 個循環(huán));
72°C，8 min ;12°C保溫。
[0017](3)3'端的克隆:
C、3Λ-outer PCR 擴增
根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP-3'-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP-3' -outer和TaKaRa公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中:T 端下游引物:T-RACEouter,進行 3'端 outer PCR 擴增:
GSP-3'-outer: 5'-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3'；
3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ；
擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端。[0018]本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2Χ 引物(GSP-3,-outer/3,-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。
[0019]擴增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))；
72°C，8 min ;12°C保溫。
[0020]D、3,-1nner PCR 擴增
根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段端序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP-3'-1nner，以前述步驟C所得3'端的oute`r PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP-3、inner和TaKaRa 公司:T-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中:T 端下游引物3Λ -RACE inner,進行 3Λ 端 inner PCR 擴增:
GSP-3、inner: 5^-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3^ ；
3Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3^ ；
擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到3'端完整序列。
[0021]本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
3r-outer PCR 產(chǎn)物2 μ L，
2X 引物(GSP-3,-1nner/3,-RACE-1nner)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。
[0022]擴增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))
72°C，8 min ;12°C保溫。
[0023](4) 5'端的克隆:
E、合成5'端的cDNA第一鏈:
以上述步驟(1)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板,經(jīng)過Ambion公司FirstChoice?RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 Y RACE Adapter 后，以 RandomDecamers進行反轉(zhuǎn)錄:
5r RACE Adapter:5Λ-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3^ ；
合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端的cDNA第一鏈。[0024]F、5r-outer PCR 擴增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP-5'-outer，以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP-5'-outer和FirstChoice? RLM-RACE Kit試劑盒中的5Λ 端上游引物5、RACE outer，進行5Λ 端outerPCR擴增:
GSP-5' -outer: 5'-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3'；
5Λ-RACE outer: 5^- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3^ ；
擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5,端。
[0025]本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為:
cDNA 模板IyL,
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP-5,-outer/V-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。
[0026]擴增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))；
72°C，7 min ;12°C保溫。
[0027]G、5,-1nner PCR 擴增
根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP-5'-1nner，以前述步驟F所得5'端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP-5、inner和FirstChoice? RLM-RACE Kit 試劑盒中 Y 端上游引物 Y-RACE inner，進行 Y 端 inner PCR擴增:
GSP-5inner: 5Λ-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3Λ ；
5Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3^ ；
擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到5'端完整序列。
[0028]本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為:
5r-outer PCR 產(chǎn)物I μ L，
10Χ PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP-5,-1nner/V-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)) 1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。
[0029]擴增程序可優(yōu)選為:
95°C，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))；
72°C，7 min，12°C保溫。
[0030](5)全長序列拼接和ORF克隆:將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得:T端inner PCR擴增序列和述步驟(4)所得5Λ端inner PCR擴增序列進行拼接,cDNA全長作為ORF (Open Reading Frame)擴增的cDNA模板。
[0031]以下述上游引物ORF-S和下游引物0RF-A，并進行PCR擴增:
【權(quán)利要求】
1.一種來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列，該序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于:所述的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所述。
3.—種權(quán)利要求1所述的來源于矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟: (1)總RNA的提取和純化: 可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA ； (2)中間片段的克隆: A、中間片段cDNA第一鏈的合成 以上述步驟(1)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACECore Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3Λ RACE Adaptor 進行反轉(zhuǎn)錄,得到的 cDNA 第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板； B、PCR擴增 以前述步驟A所得中間片段的 cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物jf和下游引物jx，進行PCR擴增:
jf: 5,-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3,，
jx: 5、GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3'； 擴增得到矮沙冬青的甜菜堿醛脫氫酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列； (3)3,端的克隆: C、3Λ-outerPCR 擴增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP-3'-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP-3' -outer和TaKaRa公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中:T 端下游引物:T-RACEouter,進行 3'端 outer PCR 擴增:
GSP-3'-outer: 5'-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3'；
3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 端outer PCR產(chǎn)物； D、3Λ-1nnerPCR 擴增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段端序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP-3'-1nner，以前述步驟C所得3'端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP-3、inner和TaKaRa 公司:T-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中:T 端下游引物3Λ -RACE inner,進行 3Λ 端 inner PCR 擴增:
GSP-3inner: 5^-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3Λ ；
3Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3^ ； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆:E、合成5'端的cDNA第一鏈: 以上述步驟(1)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板,經(jīng)過Ambion公司FirstChoice?RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 Y RACE Adapter 后，以 RandomDecamers進行反轉(zhuǎn)錄: . 5r RACE Adapter:5'-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3'；
合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端的cDNA第一鏈； F、5'-outerPCR 擴增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP-5'-outer，以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP-5'-outer和FirstChoice? RLM-RACE Kit試劑盒中的5' 端上游引物5'-RACE outer，進行5' 端outerPCR擴增:
GSP-5'-outer: 5'-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3'； . 5'-RACE outer: 5'- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3' ； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 端outer PCR產(chǎn)物； G、5'-1nnerPCR 擴增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP-5'-1nner，以前述步驟F所得5'端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP-5、inner和FirstChoice? RLM-RACE Kit 試劑盒中 Y 端上游引物 Y-RACE inner，進行 Y 端 inner PCR擴增:
GSP-5inner: 5'-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3' ； . 5'RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3' ； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到5'端完整序列； (5)全長序列拼接和ORF克隆: 將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得:T端inner PCR擴增序列和述步驟(4)所得5'端inner PCR擴增序列進行拼接,cDNA全長作為ORF (Open Reading Frame)擴增的cDNA模板； 以下述上游引物ORF-S和下游引物ORF-A，并進行PCR擴增:
ORF-S: 5' -GTGGATCC (BamH I ) ATGGCAACCCCAATACCGAATORF-A: 5'-CATCAAGCTT (Hind III)CCTATCACAGCTTTGAAGGAGACTG擴增得到的產(chǎn)物為完整的矮沙冬青甜菜堿醛脫氫酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(1)中，采用的RNA提取方法為試劑盒法；純化方法為DNA酶消化法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(2)中進行PCR擴增時，擴增體系為: TaqPlusPCR Master Mix20 μ L , cDNA 模板
2 μ L , .2X 引物(jx/jf)
I UL , ddH20

16 yL ；擴增程序為:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C,40 s (30 個循環(huán)); 72°C，8 min ;12°C保溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(3)中進行IT-outerPCR擴增時，擴增體系為: IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,cDNA 模板2 μ L , 2Χ 引物(GSP-3,-outer/3,-RACE-outer)I yL , IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L , ddH2028.75 μ L ; 擴增程序為:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))； 72°C，8 min ;12°C保溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(3)中進行:T-1nnerPCR擴增時，擴增體系為: dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L , 3r-outer PCR 產(chǎn)物2 μ L， 2X 引物(GSP-3,-1nner/3,-RACE-1nner)I yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 yL , ddH2028.75 μ L ; 擴增程序為:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán)) 72°C，8 min ;12°C保溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(4)中進行5,-outerPCR擴增時，擴增體系為:cDNA 模板IyL, IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , 2X 引物(GSP-5,-outer/V-RACE outer)2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L ; 擴增程序為:.95。。，3 min ； . 95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))；. 72°C，7 min ;12°C保溫。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(4)中進行5,-1nnerPCR擴增時，擴增體系為:. 5r-outer PCR 產(chǎn)物I μ L， IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , . 2X 引物(GSP-5,-1nner/V-RACE inner)2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L ; 擴增程序為: . 95。。，3 min ； . 95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 個循環(huán))； . 72。。，7 min，12°C保溫。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(5)中進行PCR擴增時，擴增體系為: dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L , .2 X 引物(0RF-S/0RF-A)I μ L， cDNA 模板I μ L , . 5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L , PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L， ddH2032.5 μ L ;
擴增程序為:98°C,30 s ；63°C,30 s ；72°C,1 min 30 s (30 個循環(huán))，12°C保溫。
【文檔編號】C12N9/04GK103497957SQ201310505243
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】李晚忱, 于好強, 付鳳玲, 劉艷萍, 雍太明 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)