一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法。具體步驟為：首先將細(xì)胞沉淀物上層的白色黏液團(tuán)收集至另一離心管，PBS洗滌1次后加入等體積的300IU/ml透明質(zhì)酸酶，吹打混勻，室溫消化1～2min，再用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；余下細(xì)胞沉淀物加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，冰上靜置。本發(fā)明的有益效果是，對(duì)顆粒細(xì)胞存活率無明顯影響，更為省時(shí)高效，有助于建立穩(wěn)定的顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
【專利說明】一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離提純的方法，具體來說，是指一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)最大的細(xì)胞群，與卵泡膜細(xì)胞協(xié)同調(diào)控女性甾體激素的合成，也直接參與了卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育和成熟等生殖事件。因此，顆粒細(xì)胞可作為研究女性生殖細(xì)胞生物學(xué)行為及其功能調(diào)控的良好細(xì)胞模型。當(dāng)今人工輔助生殖技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，操作過程廢棄的卵泡液中含有大量的顆粒細(xì)胞，收集這類顆粒細(xì)胞行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可為了解顆粒 細(xì)胞的某些細(xì)胞活動(dòng)提供參考資料。文獻(xiàn)報(bào)道的顆粒細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法已較成熟，但
分離提純后顆粒細(xì)胞的存活率僅在57.69T75.0%。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞分離、純化的多個(gè)環(huán)節(jié)用兩種不同的方法進(jìn)行比較，旨在建立一個(gè)更高效省時(shí)的顆粒細(xì)胞分離提純方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服上述技術(shù)問題，我們提出了以下技術(shù)方案:
一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法，將細(xì)胞沉淀物上層的白色黏液團(tuán)收集至另一離心管，P B S洗滌I次后加入等體積的3 0 0 IU/ml透明質(zhì)酸酶，吹打混勻，室溫消化f 2min,再用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；余下細(xì)胞沉淀物加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，冰上靜置15 min后，400 Xg離心5 min,棄上清液，沉淀物中加入5倍體積的PBS，洗滌2次后用等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；將2部分細(xì)胞懸液合并混勻，小心移至等體積50% Percoll分離液的表面，500 Xg離心20 min。離心后顆粒細(xì)胞位于上層培養(yǎng)液與下層Per coll分離液的界面處；用移液管小心吸取界面層顆粒細(xì)胞，加入5倍體積的PBS, 150 X g離心3 min后棄上清；加入等體積胰酶，輕輕吹打混勻，室溫消化I min以獲取單細(xì)胞懸液，用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；再次用PBS洗滌細(xì)胞，去除細(xì)胞表面附著的Percoll分離液和EDTA。用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
[0004]本發(fā)明中，對(duì)于所得的顆粒細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率；血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 105/m I后，接種于24孔板，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)5% CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液I次；分別于培養(yǎng)2 4 h、7 2 h、9 6 h、6 d后光學(xué)顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。
[0005]本發(fā)明的有益效果是，對(duì)顆粒細(xì)胞存活率無明顯影響，更為省時(shí)高效，有助于建立穩(wěn)定的顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
【具體實(shí)施方式】
[0006]具體步驟為:首先將細(xì)胞沉淀物上層的白色黏液團(tuán)收集至另一離心管，P B S洗滌I次后加入等體積的3 O O IU/ml透明質(zhì)酸酶，吹打混勻，室溫消化廣2 min,再用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；余下細(xì)胞沉淀物加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，冰上靜置15 min后，400 Xg離心5 min,棄上清液，沉淀物中加入5倍體積的PBS，洗滌2次后用等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；將2部分細(xì)胞懸液合并混勻，小心移至等體積50% Percoll分離液的表面，500 Xg離心20 min。離心后顆粒細(xì)胞位于上層培養(yǎng)液與下層Per coll分離液的界面處；用移液管小心吸取界面層顆粒細(xì)胞，加入5倍體積的PBS，150 Xg離心3 min后棄上清；加入等體積胰酶，輕輕吹打混勻，室溫消化I min以獲取單細(xì)胞懸液，用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；再次用PBS洗滌細(xì)胞，去除細(xì)胞表面附著的Percoll分離液和EDTA。用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；對(duì)于所得的顆粒細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率；血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 105/m I后，接種于24孔板，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)5% CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液I次；分別于培養(yǎng)2 4 h、7 2 h、9 6 h、6 d后光學(xué)顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。 [0007]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法，其特征在于，將細(xì)胞沉淀物上層的白色黏液團(tuán)收集至另一離心管，P B S洗滌I次后加入等體積的3 O O IU/ml透明質(zhì)酸酶，吹打混勻，室溫消化廣2 min,再用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；余下細(xì)胞沉淀物加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，冰上靜置15 min后，400 Xg離心5 min,棄上清液，沉淀物中加入5倍體積的PBS，洗滌2次后用等體積的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；將2部分細(xì)胞懸液合并混勻，小心移至等體積50% Percoll分離液的表面，500 Xg離心20 min ;離心后顆粒細(xì)胞位于上層培養(yǎng)液與下層Per coll分離液的界面處；用移液管小心吸取界面層顆粒細(xì)胞，加入5倍體積的PBS, 150 Xg離心3 min后棄上清；加入等體積胰酶，輕輕吹打混勻，室溫消化I min以獲取單細(xì)胞懸液，用2倍體積含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；再次用PBS洗滌細(xì)胞，去除細(xì)胞表面附著的Percoll分離液和EDTA ；用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的一種卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法，其特征在于，對(duì)于所得的顆粒細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率；血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X 105/m I后，接種于24孔板，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)5% CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液I次；分別于培 養(yǎng)2 4 h、7 2 h、9 6 h、6 d后光學(xué)顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103614334SQ201310519128
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王景文 申請人:王景文