一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，該方法采用三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌株，通過斜面培養(yǎng)：在26-28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天；種子培養(yǎng)36-46h后，發(fā)酵培養(yǎng)，第一次加入甜菜堿于26-28℃，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)100-120h，在發(fā)酵42h時(shí)加阻斷劑，同時(shí)第二次加入甜菜堿，至發(fā)酵結(jié)束。過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。本發(fā)明加入甜菜堿后能有效促進(jìn)菌體的呼吸鏈系統(tǒng)，提高菌體的氧消耗速率；同時(shí)能有效的緩解菌體在發(fā)酵過程中受到的滲透壓呼吸抑制，加快氧的傳遞速率，降低能耗；提高了菌體生長率和番茄紅素的含量，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明方法操作簡單，甜菜堿無任何毒副作用，使用方便、安全，適于工業(yè)化生產(chǎn)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及發(fā)酵工程，尤其涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法 。
【背景技術(shù)】
[0002]番茄紅素是一種類胡蘿卜素，作為植物所含的一種天然色素，主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實(shí)中。研究證明番茄紅素具有提高人體免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、保護(hù)皮膚等功效。隨著人們越來越注重綠色、健康，番茄紅素不斷受到人們的廣泛關(guān)注，但是，作為功能性天然色素的番茄紅素，人類自身不能合成，需通過膳食等方式補(bǔ)充。據(jù)美國CMR(客戶管理關(guān)系)國際公司預(yù)測，番茄紅素產(chǎn)品銷售將年增35%，預(yù)計(jì)兩三年內(nèi)到達(dá)200億美元的銷售量，世界跨國醫(yī)藥巨頭和國內(nèi)的醫(yī)藥巨頭們紛紛進(jìn)軍番茄紅素產(chǎn)業(yè)。
[0003]當(dāng)前番茄紅素的生產(chǎn)方法主要有天然提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵等。目前，已證實(shí)天然番茄紅素比化學(xué)合成的番茄紅素更易吸收，而且，化學(xué)合成化學(xué)物殘留的存在，因此，近年來已轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)品的開發(fā)。從植物原料中提取天然番茄紅素易受到條件和產(chǎn)率限制，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然番茄紅素從品質(zhì)、技術(shù)、資源、成本及環(huán)境等因素考慮均優(yōu)于上述兩種方法，因而更具應(yīng)用前景。目前利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的不足之處是微生物不能高水平的積累番茄紅素，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本較高。利用基因工程菌生產(chǎn)番茄紅素尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，距離工業(yè)化生產(chǎn)尚有很大差距，因而，工業(yè)上利用發(fā)酵促進(jìn)劑等方式來優(yōu)化發(fā)酵條件，仍是提高番茄紅素產(chǎn)量的主要方式。
[0004]目前工業(yè)上主要是利用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。三孢布拉霉菌是一種高嗜氧菌，發(fā)酵過程對(duì)氧的需求很大；所使用的培養(yǎng)基固形物含量高、粘度大，使菌體所處外部環(huán)境的滲透壓增加，而且培養(yǎng)基中還含有8%左右的植物油(為代謝提供雙鍵)，致使發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率較低；同時(shí)生產(chǎn)過程中往往受到轉(zhuǎn)速等因素的影響菌體聚集成團(tuán)，導(dǎo)致氧呼吸受阻，造成代謝異常、生物量和代謝產(chǎn)物量降低。為改進(jìn)此缺陷，已有專利報(bào)道在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入液態(tài)烷烴、活性炭來增加氧氣含量(CN101555490A)。但是，液態(tài)烷烴添加濃度過大會(huì)對(duì)菌體造成傷害，后期分離提取也要經(jīng)過脫毒處理，操作繁瑣。添加活性炭也存在增加了設(shè)備動(dòng)力損耗、易堵塞管道、前期處理及后提前工序繁瑣等問題。
[0005]甜菜堿，又名N，N，N-三甲基甘氨酸，是一種季胺型水溶性生物堿。因最初從甜菜中提取而得名甜菜堿，純品為白色片狀結(jié)晶，有甜味，易吸潮，可速溶于水，易被消化吸收，使用安全，無毒副作用。大量的研究已經(jīng)證明，在微生物發(fā)酵中，甜菜堿除了可以作為甲基供體，參與甲基化反應(yīng)以及能提高代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活，來加快菌體生長速率及代謝物產(chǎn)量外，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性，促進(jìn)微生物的呼吸鏈系統(tǒng)，能顯著提高菌體的呼吸特性。此外，甜菜堿作為廣泛應(yīng)用的滲透壓保護(hù)劑，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，降低高滲透壓導(dǎo)致的呼吸抑制，加快氧氣傳遞速率，降低能耗，因此是一種優(yōu)良的發(fā)酵助劑。
[0006]甜菜堿作為發(fā)酵助劑的作用已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)和應(yīng)用。趙琳琳等研究甜菜堿對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響證實(shí)，在脫氮假單胞菌產(chǎn)VB12的發(fā)酵過程中，甜菜堿顯著提升了 VB12的產(chǎn)量，其原因，一是甜菜堿對(duì)菌體的氧利用有快速的刺激作用，緩解高滲透壓對(duì)細(xì)胞呼吸代謝的刺激作用；二是甜菜堿能提高VB12合成途徑關(guān)鍵酶的活性。甜菜堿對(duì)各種氨基酸的發(fā)酵的影響在CN101235401等專利中得到證實(shí)。因而，如何利用甜菜堿提高三孢布拉氏霉菌液體深層次發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量是關(guān)注的熱點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提高三孢布拉氏霉菌液體深層次發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量，研究設(shè)計(jì)加入甜菜堿的方法。
[0008]本發(fā)明提供了一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法。具體地，提供了一種加入一定數(shù)量的甜菜堿，發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法。
[0009]本發(fā)明方法包括下列步驟:
[0010]I)斜面培養(yǎng)
[0011]采用PDA培養(yǎng)基，取去皮馬鈴薯20g，切成小塊，加水1000毫升煮沸20分鐘，濾去馬鈴薯塊，濾液加入2g葡萄糖，0.3g K2HPO4,0.2g MgSO4 ? 7H20，0.8mg VB1Jg瓊脂，溶解后定溶至100ml，倒入試管，115°C滅菌20min，趁熱擺斜面，制得固體PDA培養(yǎng)基；分別取三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)菌株劃斜面，在26-28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天；
[0012]2)種子培養(yǎng)
[0013]種子培養(yǎng)基組成為:玉米粉30-60g/L,黃豆粉18-30g/L, KH2PO40.5_2g/L, MgSO4 *7H200.5-2g/L，VB10.001-0.02g/L, pH6.5 ;種子培養(yǎng)基按 50_80ml 每瓶分裝至 4 個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘，接種時(shí)，三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)斜面試管各用IOml無菌生理鹽水洗下孢子，經(jīng)玻璃珠打散并過濾后制成孢子懸液；三孢布拉氏霉菌(+ )菌孢子懸液每次取Iml接入I瓶種子培養(yǎng)基中；三孢布拉氏霉菌(_)菌孢子懸液每次取4ml，依次接入3瓶種子培養(yǎng)基中，在26-28°C，180-200r/min的條件下培養(yǎng)36-46h，分別得到I瓶三孢布拉氏霉菌(+ )菌和3瓶三孢布拉氏霉菌(_)菌種子液；
[0014]3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉15-25g/L，黃豆粉35-50g/L，棉籽油60_100ml/L, KH2P043-7g/L, MgSO4 ? 7H200.l_2g/L，VB10.005-0.lg/L, pH6.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基按 40_60ml 每瓶分裝至500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘，將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌“ + ”菌種培養(yǎng)液和菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液，含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接5-10ml的混合種子液，含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中第一次加入甜菜堿，于26-28°C，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)100_120h，發(fā)酵42h時(shí)三角瓶中加阻斷劑，同時(shí)第二次加入甜菜堿，發(fā)酵結(jié)束，過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到三孢布拉氏霉菌干菌體。
[0016]本發(fā)明方法所述步驟(3 )甜菜堿選自一水甜菜堿、無水甜菜堿或鹽酸鹽甜菜堿，優(yōu)選鹽酸鹽甜菜堿。
[0017]所述步驟(3)第一次甜菜堿的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基接種前發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.05-7g/L，優(yōu)選1.5-4.5g/L ;第二次甜菜堿的加入量為發(fā)酵42h時(shí)發(fā)酵液體積的
0.1-3.5g/L，優(yōu)選 l_2g/L。[0018]所述步驟(3)阻斷劑為煙堿或咪唑，阻斷劑的加入量為發(fā)酵42h時(shí)發(fā)酵液體積的的0.7-1.0mg/ml。優(yōu)選阻斷劑為咪唑，加入量為發(fā)酵42h時(shí)發(fā)酵液體積的0.8mg/ml。
[0019]本發(fā)明方法使用的菌種來源:
[0020]本發(fā)明生產(chǎn)番爺紅素的菌種為三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora),分三孢布拉氏霉菌“ + ”和三孢布拉氏霉菌兩種菌株，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，菌號(hào)為 14059 (+)和 14060 (_)。
[0021]HPLC測定本發(fā)明得到的番茄紅素含量比不加甜菜堿的對(duì)照組提高72%_95%。另外選擇在發(fā)酵42h第二次加甜菜堿，是經(jīng)過多次試驗(yàn)選擇確定的，并且在加阻斷劑的同時(shí)加入，更利于操作。
[0022]本發(fā)明的效果在于:加入甜菜堿后能有效促進(jìn)菌體的呼吸鏈系統(tǒng)，提高菌體的氧消耗速率；同時(shí)能有效的緩解菌體在發(fā)酵過程中受到的滲透壓呼吸抑制，加快氧的傳遞速率，降低能耗；而且甜菜堿本身是一種優(yōu)良的甲基供體，能有效的提供甲基參與代謝過程中的甲基化反應(yīng)，從而促進(jìn)并加快了菌體代謝反應(yīng)速率，提高了菌體生長率和番茄紅素的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明工藝操作簡單，而且甜菜堿本身是由生物體在逆境條件下產(chǎn)生的保護(hù)劑，無任何毒副作用，使用安全。本發(fā)明方法適于工業(yè)化生產(chǎn)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例使用的菌種來源:
[0024]本發(fā)明生產(chǎn)番爺紅素的菌種為三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora),分三孢布拉氏霉菌“ + ”和三孢布拉氏霉菌兩種菌株，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，菌號(hào)為三孢布拉氏霉菌)14059 ( + )和 三孢布拉氏霉菌14060 (_)。
[0025]實(shí)施例1
[0026]⑴種子培養(yǎng)
[0027]種子培養(yǎng)基組成為:玉米粉47g/L，黃豆粉 23g/L，KH2PO40.5g/L, MgSO4 *7H200.5g/L，VB10.01g/L, pH6.5。種子培養(yǎng)基按60ml每瓶分裝至4個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。接種時(shí)，三孢布拉氏霉菌(+ )菌和三孢布拉氏霉菌(_)菌斜面每支試管統(tǒng)一用IOml無菌生理鹽水洗下孢子，經(jīng)玻璃珠打散并過濾后制成孢子懸液；三孢布拉氏霉菌(+ )菌孢子懸液每次取Iml接入I瓶種子培養(yǎng)基中；三孢布拉氏霉菌(_)菌孢子懸液每次取4ml，依次接入3瓶種子培養(yǎng)基中。在26-28°C，180-200r/min的條件下培養(yǎng)36_44h，得到I瓶三孢布拉氏霉菌(+ )菌種子液和3瓶三孢布拉氏霉菌(_)菌種子液。
[0028]⑵發(fā)酵培養(yǎng)
[0029]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉18g/L，黃豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L，KH2P045.5g/L, MgSO4 ? 7H201g/L, VB10.02g/L, pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按 50ml 每瓶分裝至 6 個(gè) 500ml 的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌(+ )(-)菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液。6個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接8ml的混合種子液，其中3個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng) 基的三角瓶中按1.5g/L的量加入一水甜菜堿
0.075g，作為實(shí)驗(yàn)組。另外3個(gè)三角瓶不加甜菜堿，作為空白組。分別于26-28°C，200_250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)120h結(jié)束。發(fā)酵42h時(shí)加入0.046g咪唑作為阻斷劑，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜堿0.087g。[0030](3)含量測定[0031]番茄紅素含量測定(HPLC法)
[0032](含量測定參考文獻(xiàn):王航等。發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素培養(yǎng)方法的改進(jìn)及優(yōu)化。北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，33 (5):38-40)
[0033]發(fā)酵120h結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。用研磨法粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚靜置萃取直至菌體無色為止，取5ml經(jīng)過濾的萃取液用高效液相色譜法測定番茄紅素的含量。其中，實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.13g/L，空白組為0.654g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高72.8%。
[0034]對(duì)比例1:
[0035]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0036]⑵發(fā)酵培養(yǎng)
[0037]同實(shí)施例1。不同之處在于，第二次添加甜菜堿的時(shí)間不同。實(shí)施例1在發(fā)酵42h加阻斷劑的同時(shí)，第二次添加甜菜堿。而對(duì)比例I在42h時(shí)只加入阻斷劑，在第60h時(shí)第二次添加甜菜堿，即發(fā)酵60h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜堿 0.087g。
[0038](3)含量測定
[0039]測定方法同實(shí)施例1。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.03g/L，空白組為
0.653g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高57.7%。
[0040]對(duì)比例2:
[0041]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0042]⑵發(fā)酵培養(yǎng)
[0043]同實(shí)施例1。不同之處在于，第二次添加甜菜堿的時(shí)間不同。實(shí)施例1在發(fā)酵42h加阻斷劑的同時(shí)，第二次添加甜菜堿。而對(duì)比例I在42h時(shí)只加入阻斷劑，本實(shí)施例在第72h時(shí)第二次添加甜菜堿，即發(fā)酵72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜堿0.087g。
[0044](3)含量測定
[0045]測定方法同實(shí)施例1。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.01g/L，空白組為
0.653g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高54.7%。
[0046]通過對(duì)比例I和2說明:本發(fā)明方法選擇在第42h時(shí)第二次添加甜菜堿，番茄紅素含量可提高72.8% ;優(yōu)于其他時(shí)間的第二次添加甜菜堿。
[0047]實(shí)施例2:
[0048]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0049]⑶發(fā)酵培養(yǎng)
[0050]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉18g/L，黃豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L，KH2P045.5g/L, MgSO4 ? 7H201g/L, VB10.02g/L, pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按 50ml 每瓶分裝至 6 個(gè) 500ml 的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(-)菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液。6個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接8ml的混合種子液，其中3個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中按3g/L的量加入一水甜菜堿0.15g，作為實(shí)驗(yàn)組。另外3個(gè)三角瓶不加甜菜堿，作為空白組。分別于26-280C，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)120h結(jié)束。發(fā)酵42h時(shí)加入0.046g咪唑作為阻斷劑，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶不添加甜菜堿。
[0051](3)含量測定
[0052]發(fā)酵結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。用研磨法粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚靜置萃取直至菌體無色為止，取5ml經(jīng)過濾的萃取液用高效液相色譜法測定番茄紅素的含量。其中，實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為0.997g/L，空白組為0.657g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高51.2%。
[0053]實(shí)施例3:
[0054]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0055]⑷發(fā)酵培養(yǎng)
[0056]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉18g/L，黃豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L，KH2P045.5g/L, MgSO4 ? 7H201g/L, VB10.02g/L, pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按50ml每瓶分裝至6個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液。6個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接8ml的混合種子液，其中3個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中按3g/L的量加入鹽酸鹽甜菜堿0.15g，作為實(shí)驗(yàn)組。另外3個(gè)三角瓶不加甜菜堿，作為空白組。分別于26-280C，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)120h結(jié)束。發(fā)酵42h時(shí)加入0.046g咪唑作為阻斷劑，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入鹽酸鹽甜菜堿0.087g。
[0057]⑶含量測定
[0058]發(fā)酵結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。用研磨法粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚靜置萃取直至菌體無色為止，取5ml經(jīng)過濾的萃取液用高效液相色譜法測定番茄紅素的含量。其中，實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.36g/L，空白組為0.657g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高1.07倍。
[0059]實(shí)施例4:
[0060]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0061](5)發(fā)酵培養(yǎng)
[0062]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉18g/L，黃豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L，KH2P045.5g/L, MgSO4 ? 7H201g/L, VB10.02g/L, pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按50ml每瓶分裝至6個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液。6個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接8ml的混合種子液，其中3個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中按3g/L的量加入鹽酸鹽甜菜堿0.15g，作為實(shí)驗(yàn)組。另外3個(gè)三角瓶不加甜菜堿，作為空白組。分別于26-28°C, 200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)120h結(jié)束。發(fā)酵42h時(shí)加入0.046g咪唑作為阻斷劑，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按3g/L的量第二次加入鹽酸鹽甜菜堿0.174g。
[0063](3)含量測定
[0064]發(fā)酵結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。用研磨法粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚靜置萃取直至菌體無色為止，取5ml經(jīng)過濾的萃取液用高效液相色譜法測定番茄紅素的含量。其中，實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.20g/L，空白組為0.659g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提高82.1%。
[0065]實(shí)施例5:
[0066]⑴種子培養(yǎng)(同實(shí)施例1)
[0067](6)發(fā)酵培養(yǎng)
[0068]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉18g/L，黃豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L，KH2P045.5g/L, MgSO4 ? 7H201g/L, VB10.02g/L, pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按50ml每瓶分裝至6個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘。將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液。6個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接8ml的混合種子液，其中3個(gè)含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中按4.5g/L的量加入無水甜菜堿0.225g，作為實(shí)驗(yàn)組。另外3個(gè)三角瓶不加甜菜堿，作為空白組。。分別于26-280C，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)120h結(jié)束。發(fā)酵42h時(shí)加入0.046g咪唑作為阻斷劑，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入無水甜菜堿0.087g。[0069](3)含量測定
[0070]發(fā)酵結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到干菌體。用研磨法粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚靜置萃取直至菌體無色為止，取5ml經(jīng)過濾的萃取液用高效液相色譜法測定番茄紅素的含量。其中，實(shí)驗(yàn)組番茄紅素的平均含量為1.29g/L，空白組為0.661g/L，即添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)組的番茄紅素含量比對(duì)照組提聞 95.2%。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: 1)斜面培養(yǎng) 采用PDA培養(yǎng)基，取去皮馬鈴薯20g，切成小塊，加水1000毫升煮沸20分鐘，濾去馬鈴薯塊，濾液加入2g葡萄糖，0.3g K2HPO4,0.2g MgSO4 ? 7H20，0.8mg VB1Jg瓊脂，溶解后定溶至100ml，倒入試管，115°C滅菌20min，趁熱擺斜面，制得固體PDA培養(yǎng)基；分別取三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)菌株劃斜面，在26-28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天； 2)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成為:玉米粉30-60g/L，黃豆粉18-30g/L，KH2PO40.5~2g/L, MgSO4 *7H200.5-2g/L，VB10.001-0.02g/L, pH6.5 ;種子培養(yǎng)基按 50_80ml 每瓶分裝至 4 個(gè)500ml的三角瓶中，8層紗布封口，115°C滅菌20分鐘，接種時(shí)，三孢布拉氏霉菌(+ )和三孢布拉氏霉菌(_)斜面試管各用IOml無菌生理鹽水洗下孢子，經(jīng)玻璃珠打散并過濾后制成孢子懸液；三孢布拉氏霉菌(+ )菌孢子懸液每次取Iml接入I瓶種子培養(yǎng)基中；三孢布拉氏霉菌(_)菌孢子懸液每次取4ml，依次接入3瓶種子培養(yǎng)基中，在26-28°C，180-200r/min的條件下培養(yǎng)36-46h，分別得到I瓶三孢布拉氏霉菌(+ )菌和3瓶三孢布拉氏霉菌(_)菌種子液； 3)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米粉15_25g/L，黃豆粉35-50g/L，棉籽油60_100ml/L, KH2P043-7g/L, MgSO4 ? 7H200.l_2g/L，VB10.005-0.lg/L, pH6.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基按 40_60ml 每瓶分裝至500ml的三角瓶中，8層 紗布封口，115°C滅菌20分鐘，將種子液發(fā)酵培養(yǎng)得到的三孢布拉氏霉菌“ + ”菌種培養(yǎng)液和菌種培養(yǎng)液以1:3的比例混合得到混合種子液，含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶每瓶分別轉(zhuǎn)接5-10ml的混合種子液，含發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中第一次加入甜菜堿，于26-28°C，200-250r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)100_120h，發(fā)酵42h時(shí)三角瓶中加阻斷劑，同時(shí)第二次加入甜菜堿，發(fā)酵結(jié)束，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，經(jīng)真空冷凍干燥后得到含番茄紅素的干菌體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)甜菜堿選自一水甜菜堿、無水甜菜堿或鹽酸鹽甜菜堿。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)甜菜堿為鹽酸鹽甜菜堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)第一次甜菜堿的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基接種前發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.05-7g/L ;第二次甜菜堿的加入量為發(fā)酵42h時(shí)發(fā)酵液體積的0.1-3.5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)第一次甜菜堿的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基接種前發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1.5-4.5g/L ;第二次甜菜堿的加入量為發(fā)酵42h時(shí)發(fā)酵液體積的l_2g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)阻斷劑為煙堿或咪唑，阻斷劑的加入量為發(fā)酵液體積的0.7-1.0mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，所述步驟(3)阻斷劑為咪唑，加入量為發(fā)酵液體積的0.8mg/ml。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103525871SQ201310522440
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】馬興群, 劉雨, 宋琦 申請人:山東祥維斯生物科技有限公司