一種rna擴(kuò)增與雜交捕獲法相結(jié)合的檢測(cè)核酸方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種RNA擴(kuò)增與雜交捕獲法相結(jié)合的檢測(cè)核酸方法。包括如下步驟，從樣本中抽提核酸或者裂解樣本釋放待測(cè)核酸；將待測(cè)核酸轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物；將所得RNA產(chǎn)物與標(biāo)記有生物素的DNA探針一起加入到固相上進(jìn)行雜交，雜交形成DNA/RNA雜合體，所述固相上包被有識(shí)別雜合體的特異抗體或親和素或鏈霉親和素，雜合體被固相捕獲；向固相加入標(biāo)記具有二次擴(kuò)增能力的酶的親和素或鏈霉親和素或特異識(shí)別DNA/RNA雜合體的抗體，實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的獲得。本發(fā)明避免PCR固有的污染問(wèn)題，可以直接檢測(cè)RNA分子，勿須進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及RNA的預(yù)分離，極大的簡(jiǎn)化了操作步驟。
【專利說(shuō)明】—種RNA擴(kuò)增與雜交捕獲法相結(jié)合的檢測(cè)核酸方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RNA擴(kuò)增與雜交捕獲法相結(jié)合的檢測(cè)核酸方法，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)自1985年問(wèn)世以來(lái)，以其靈敏性、特異性和快速性在醫(yī)學(xué)和分子生物等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，由此可見(jiàn)核酸擴(kuò)增技術(shù)的重要性。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及生物物理技術(shù)的大量應(yīng)用，核酸擴(kuò)增模式也不斷涌現(xiàn)。靶核酸的直接擴(kuò)增主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)等，這些方法都具有很高的靈敏度。
[0003]根據(jù)核酸擴(kuò)增條件的不同，核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)可分為兩類:(I)變溫?cái)U(kuò)增，它通過(guò)擴(kuò)增靶序列來(lái)提高敏感性，(2)核酸等溫?cái)U(kuò)增，它通過(guò)放大信號(hào)強(qiáng)度來(lái)提高敏感性，它反應(yīng)迅速，簡(jiǎn)便易行，沒(méi)有模板擴(kuò)增的干擾因素。并且核酸等溫?cái)U(kuò)增對(duì)儀器要求大大簡(jiǎn)化，更能滿足快速簡(jiǎn)便的要求。目前核酸等溫?cái)U(kuò)增方法大多是采用核酸分子擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的操作模式。例如，以RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄為主要技術(shù)路線的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在恒定的溫度下完成RNA的擴(kuò)增過(guò)程，然后可采用電泳、雜交、點(diǎn)雜交或化學(xué)發(fā)光等諸多方法來(lái)完成對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，常見(jiàn)的檢測(cè)方法有熒光探針比如分子信標(biāo)、Taqman探針等。
[0004]熒光探針是一種寡核苷酸單鏈結(jié)構(gòu)，其一端為熒光基團(tuán)標(biāo)記，另一端為淬滅基團(tuán)標(biāo)記。由于兩端的核苷酸序列互補(bǔ)，其熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近而使得熒光基團(tuán)產(chǎn)生的光子被淬滅基團(tuán)淬滅。例如在使用分子信標(biāo)熒光探針時(shí)，當(dāng)被檢測(cè)核酸分子能夠與熒光探針的單鏈區(qū)域雜交，熒光探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生熒光信號(hào)，而在使用Taqman熒光探針時(shí)，Taqman探針因DNA合成被破壞,產(chǎn)生突光信號(hào)。由于突光信號(hào)的強(qiáng)弱是由被檢測(cè)核酸分子的含量所決定，整個(gè)過(guò)程不存在信號(hào)放大過(guò)程，因此該方法的靈敏度取決于前期的擴(kuò)增結(jié)果。并且熒光探針的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)因其他原因破壞后易造成假陽(yáng)性，而且合成價(jià)格相對(duì)普通探針較為昂貴，不適合大范圍推廣。
[0005]依賴轉(zhuǎn)錄的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA，因而也可采用雜交檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)提高該技術(shù)的敏感性和特異性，例如將與檢測(cè)信號(hào)有關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記在核酸探針上，通過(guò)檢測(cè)該信號(hào)從而間接檢測(cè)RNA產(chǎn)物。核酸探針上是一般可用地高辛(Digoxygenin,DIG)標(biāo)記或者堿性磷酸酶直接標(biāo)記。通過(guò)探針捕獲將標(biāo)記的探針和擴(kuò)增產(chǎn)物吸附到微量反應(yīng)板上，作用于底物顯色，然后通過(guò)分析吸光度來(lái)實(shí)現(xiàn)最終檢測(cè)目的。這種類似酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，儀器投入少，但是在靈敏度、特異性及高通量檢測(cè)方面，還是存在不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì) 現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種RNA擴(kuò)增與雜交捕獲法相結(jié)合的檢測(cè)核酸方法，提高檢測(cè)靈敏度。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟:O從樣本中抽提核酸或者裂解樣本釋放待測(cè)核酸；
2)核酸分子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增
將待測(cè)核酸轉(zhuǎn)化成帶有一定啟動(dòng)子的雙鏈DNA，根據(jù)啟動(dòng)子序列選擇相對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)核酸分子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物；
3)通過(guò)雜交捕獲法對(duì)核酸信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)
所述的雜交捕獲有兩種方式。一種是將所得RNA產(chǎn)物與標(biāo)記有生物素的DNA探針一起加入到固相上進(jìn)行雜交，所述固相上包被有識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體，RNA產(chǎn)物與DNA探針雜交形成DNA/RNA雜合體被固相上特異抗體捕獲；向固相加入標(biāo)記具有二次擴(kuò)增能力的酶的親和素或鏈霉親和素，用于DNA探針上生物素的檢測(cè)，然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯色實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的獲得。
[0008]另一種同樣是將所得RNA產(chǎn)物與標(biāo)記有生物素的DNA探針一起加入到固相上進(jìn)行雜交，所述固相上包被有親和素或鏈霉親和素，RNA產(chǎn)物與DNA探針雜交形成DNA/RNA雜合體，通過(guò)DNA探針上標(biāo)記的生物素與親和素或鏈霉親和素的結(jié)合,DNA/RNA雜合體被捕獲至固相上；捕獲到的DNA/RNA雜合體通過(guò)特異識(shí)別DNA/RNA雜合體的抗體進(jìn)行檢測(cè)；然后在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗的作用下，通過(guò)化學(xué)發(fā)光或者顯色實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的獲得。
[0009]步驟2)中，將待測(cè)核酸轉(zhuǎn)化成帶有一定啟動(dòng)子的雙鏈DNA。對(duì)于待測(cè)核酸是DNA的情況，在帶有特定啟動(dòng)子的一對(duì)引物和DNA聚合酶的作用下，合成一帶有特定啟動(dòng)子的雙鏈DNA。
[0010]對(duì)于待測(cè)核酸是RNA的情況，在帶有特定啟動(dòng)子的一條引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將待測(cè)RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，再用RNaseH消化cDNA中的RNA，得到單鏈cDNA，在第二條引物和反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二鏈，形成帶有特定啟動(dòng)子的雙鏈DNA。
[0011]上述雙鏈DNA合成過(guò)程中，包括兩條引物，一條引物的3’端序列與待測(cè)核酸3’端或者靠近3’端的序列互補(bǔ)，5’端為啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列可以為T(mén)7、T3或SP6;—條引物的序列與待測(cè)核酸的負(fù)鏈3’端序列互補(bǔ)。
[0012]當(dāng)待測(cè)核酸為DNA時(shí)，待測(cè)核酸的負(fù)鏈已存在于樣本中；當(dāng)待測(cè)核酸為RNA時(shí)，待測(cè)核酸的負(fù)鏈即為第一條引物和反轉(zhuǎn)錄酶作用下得到的cDNA鏈。該過(guò)程所述的反轉(zhuǎn)錄酶可以為AMV反轉(zhuǎn)錄酶或者M(jìn)MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0013]本發(fā)明中，無(wú)論待檢測(cè)核酸是DNA分子還是RNA分子，擴(kuò)增產(chǎn)物均為RNA，探針均為DNA。所述的特異抗體能夠識(shí)別DNA-RNA核酸雙鏈雜合體。
[0014]所述的DNA探針為多核苷酸分子，其序列與RNA產(chǎn)物序列部分互補(bǔ)。
[0015]所述DNA探針通過(guò)化學(xué)合成的方法加入生物素分子。
[0016]本發(fā)明中，RNA產(chǎn)物與DNA探針形成DNA/RNA雜合體的過(guò)程，與該雜合體被固相特異捕獲的過(guò)程是同步進(jìn)行的，兩個(gè)步驟之間不經(jīng)過(guò)洗滌過(guò)程。
[0017]步驟3)中，所述具有二次擴(kuò)增能力的酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。
[0018]本發(fā)明可通過(guò)將待檢樣本與不同的特異性核酸探針的雜交來(lái)鑒定其中所含有的核酸分子類型，因此可以同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中的多種靶核酸分子，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。
[0019]本發(fā)明將生物素與多核苷酸相連，生物素標(biāo)記探針?lè)€(wěn)定，不易失活，并能配用多種檢測(cè)系統(tǒng)，簡(jiǎn)單方便，在核酸檢測(cè)領(lǐng)域運(yùn)用廣泛。用于生物素檢測(cè)的親和素或鏈霉親和素可標(biāo)記具有二次擴(kuò)增能力的酶(辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)，使得檢測(cè)具有極高的靈敏度。
[0020]本發(fā)明的有益效果還在于本發(fā)明是通過(guò)核酸模板的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雜交捕獲來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的檢測(cè)，而不是基于PCR的模板擴(kuò)增技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而避免PCR固有的污染問(wèn)題。此外，本發(fā)明的技術(shù)可以直接檢測(cè)RNA分子，勿須進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及RNA的預(yù)分離，極大的簡(jiǎn)化了操作步驟。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1本發(fā)明方法原理示意圖，采用雜交捕獲方式1-將識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體包被在固相上。1-識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體；2-RNA擴(kuò)增產(chǎn)物；3_檢測(cè)探針；4-HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素；5-固相。
[0022]圖2本發(fā)明方法原理示意圖，采用雜交捕獲方式2-將識(shí)別生物素的鏈霉親和素或親和素包被在固相上。1-鏈霉親和素或親和素；2-RNA擴(kuò)增產(chǎn)物；3_檢測(cè)探針；4_識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體；5- HRP酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗；6_固相。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1.人呼吸道合胞病毒RSV的檢測(cè):使用將識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體包被于固相上的方法
1.引物和檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)和合成:
根據(jù)genebank中RSV的F基因序列，設(shè)計(jì)引物和檢測(cè)探針的序列，序列如下:
引物 1:GTGGTAATTGTACTACATATGCTAAG (SEQ ID No I)
引物 2:TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAG (SEQ ID No 2)
檢測(cè)探針 I:BiOtin-ATCATTGATTAATGAT (SEQ ID No 3)
檢測(cè)探針 2:Biotin-TTAACATATAAGTGCT (SEQ ID No 4)
2.預(yù)包被:將特異識(shí)別DNA/RNA雜合體的抗體按照1:1000的濃度包被到微孔板上，加入固定液，固定2小時(shí)后室溫風(fēng)干。
[0024]3.樣本收集及前處理:
I)收集病人鼻咽拭子樣本:讓病人頭部揚(yáng)起約45度并盡量保持不動(dòng)，將拭子貼鼻孔壁輕輕插入病人鼻腔，至鼻腭處，然后邊擦拭邊旋轉(zhuǎn)2-3周以收集脫落細(xì)胞，之后慢慢取出拭子，置采樣管(15ml離心管)折斷手接觸部位的塑料柄，使拭子浸泡于采樣液(2 — 3ml)中，旋緊管蓋。
[0025]2)樣本處理:采樣管2500rpm離心10分鐘，棄去l_2ml上清液；管內(nèi)保留Iml左右的上清液與細(xì)胞沉淀重懸后，全部轉(zhuǎn)入干凈的1.5ml離心管內(nèi)，3000rpm再次離心5min ；棄去全部上清液后收集細(xì)胞沉淀。
[0026]3)樣本裂解:用細(xì)胞裂解液裂解收集到的細(xì)胞沉淀，釋放核酸分子。
[0027]4.RNA擴(kuò)增:向PCR管中加入下述試劑，置于PCR儀或恒溫水浴鍋中95°C孵育2分鐘。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)從樣本中抽提核酸或者裂解樣本釋放待測(cè)核酸； 2)核酸分子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 將待測(cè)核酸轉(zhuǎn)化成帶有一定啟動(dòng)子的雙鏈DNA，根據(jù)啟動(dòng)子序列選擇相對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)核酸分子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物； 3)通過(guò)雜交捕獲法對(duì)核酸信號(hào)進(jìn)行檢測(cè) 將所得RNA產(chǎn)物與標(biāo)記有生物素的DNA探針一起加入到固相上進(jìn)行雜交,所述固相上包被有識(shí)別DNA/RNA雜合體的特異抗體，RNA產(chǎn)物與DNA探針雜交形成DNA/RNA雜合體被固相上特異抗體捕獲；向固相加入標(biāo)記具有二次擴(kuò)增能力的酶的親和素或鏈霉親和素，用于DNA探針上生物素的檢測(cè)，然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯色實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA探針為多核苷酸分子，其序列與RNA產(chǎn)物序列部分互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA探針通過(guò)化學(xué)合成的方法加入生物素分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)中，所述具有二次擴(kuò)增能力的酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。
5.一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)從樣本中抽提核酸或者裂解樣本釋放待測(cè)核酸； 2)核酸分子的轉(zhuǎn) 錄擴(kuò)增 將待測(cè)核酸轉(zhuǎn)化成帶有一定啟動(dòng)子的雙鏈DNA，根據(jù)啟動(dòng)子序列選擇相對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)核酸分子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到RNA產(chǎn)物； 3)通過(guò)雜交捕獲法對(duì)核酸信號(hào)進(jìn)行檢測(cè) 將所得RNA產(chǎn)物與標(biāo)記有生物素的DNA探針一起加入到固相上進(jìn)行雜交,所述固相上包被有親和素或鏈霉親和素，RNA產(chǎn)物與DNA探針雜交形成DNA/RNA雜合體，通過(guò)DNA探針上標(biāo)記的生物素與親和素或鏈霉親和素的結(jié)合，DNA/RNA雜合體被捕獲至固相上；捕獲到的DNA/RNA雜合體通過(guò)特異識(shí)別DNA/RNA雜合體的抗體進(jìn)行檢測(cè)；然后在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗的作用下，通過(guò)化學(xué)發(fā)光或者顯色實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA探針為多核苷酸分子，其序列與RNA產(chǎn)物序列部分互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA探針通過(guò)化學(xué)合成的方法加入生物素分子。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525942SQ201310527722
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】李先強(qiáng), 姜昕 申請(qǐng)人:武漢中幟生物科技有限公司