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      用于四種細菌pcr檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法

      文檔序號:563753閱讀:568來源:國知局
      專利名稱:用于四種細菌pcr檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及的是一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的方法,具體地說,是一種用于四種 細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法。
      技術(shù)背景金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella)、單 核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)與副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是四種重要的食源性致病菌是公知公開的菌種,它廣泛分布 于自然界,它們主要是通過食品(特別是動物性食品)傳播、感染人體,直接造 成人體健康損害。PCR (聚合酶鏈式反應)技術(shù)具有操作簡便、快速、靈敏度高、 特異性強等特點,現(xiàn)在已廣泛應用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的檢測。但PCR方法在不同的實驗室或檢測部門所檢測的 目的基因和操作流程有一定的差異,沒有形成標準,得到的檢測結(jié)果也不盡相同。 近年來的實踐應用表明,食品和培養(yǎng)基中存在的抑制劑可影響PCR反應,使檢測 結(jié)果呈假陰性。盡管PCR方法在不斷的改進和完善,卻不能有效地阻止假陰性結(jié) 果的發(fā)生。為了解決常規(guī)PCR方法中普遍存在的假陰性問題,近幾年在PCR擴增 體系中引入了擴增內(nèi)標(IAC)。大多數(shù)學者認為在PCR體系中加入擴增內(nèi)標能 有效避免假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),是PCR檢測標準化的措施之一。制備IAC的方法有 很多,根據(jù)不同的實驗目的和要求采用不同的制備方法。初期的擴增內(nèi)標是利用 克隆技術(shù)將目標序列的PCR產(chǎn)物通過插入、刪除或者替換等手段處理后制備的, 制備方法較煩瑣,且制備的擴增內(nèi)標僅能用于單一微生物的檢測。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn),Younes Maaroufi等在《FEMS Immunol Med Microbiol》(免疫醫(yī)學微生物學)2006年第48期183-191頁上發(fā)表的 "Development of a multiple internal control for clinical diagnostic real—time amplification assays"(—禾中運用于臨床診斷突光定量PCR體系的 多重擴增內(nèi)標),該文中提出一種多重擴增內(nèi)標(mIAC)的合成方法,方法為通過重疊PCR技術(shù)將5種病毒的檢測引物序列合成到一條核苷酸序列中構(gòu)建多重 擴增內(nèi)標,通過一條多重擴增內(nèi)標可用于5種病毒的檢測。但無法用于金黃色葡 萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR檢測。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于填補國內(nèi)在多重擴增內(nèi)標研究上的空白,提供一種用于四 種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法。本發(fā)明利用生物信息學的方法,根 據(jù)金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA 基因和副溶血弧菌toxR基因設(shè)計特異性檢測引物,根據(jù)這四對引物序列運用重 疊PCR技術(shù)人工合成了一種多重擴增內(nèi)標,可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏 菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的普通PCR檢測,在確保檢測準確性與 高效性的同時大大降低檢測成本,填補了國內(nèi)在多重檢測內(nèi)標研究上的空白。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的,包括以下步驟第一步,利用生物信息學的方法,根據(jù)金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏 菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設(shè)計特 異性檢測引物;第二步,采用重疊PCR技術(shù)將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA 基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引 物序列拼接成一條核苷酸片段,構(gòu)建多重擴增內(nèi)標;第三步,采用分子生物學技術(shù)將該人工序列克隆到質(zhì)粒載體pMD-18T,構(gòu)建 含多重擴增內(nèi)標序列的質(zhì)粒pMD-mIAC;第四步,多重擴增內(nèi)標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李 斯特氏菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。所述的特異性檢測引物,是指四對分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、 單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR檢測的檢測引物(vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR),進行PCR檢測時,上述引物能擴增 到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌菌株特有的 檢測基因,或者是PCR體系中添加的擴增內(nèi)標。所述的重疊PCR技術(shù),是指采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了 重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。所述的多重擴增內(nèi)標,是指人工合成DNA片段,該片段是通過重疊PCR技術(shù)人工合成的,其中包含金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌 和副溶血弧菌的特異檢測引物序列,在確保擴增效率的同時減少了非目標菌(大腸桿菌、奇異變形桿菌、空腸彎曲桿菌、腸球菌等)的DNA對PCR檢測的干擾。 其用途是顯示假陰性的發(fā)生,增加PCR檢測的準確率,可分別用于金黃色葡萄球 菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌普通PCR檢測。所述的分子生物學技術(shù),具體如下采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移上述帶有擴增內(nèi)標 的載體到大腸桿菌(E. coli TG-1)中,然后涂布于90ram選擇性平板上,其中 含有100mg/ml氨芐青霉素10 P 1 , 20%的IPTG溶液7 u 1 , 2%的X-gal溶液40 y 1 , 經(jīng)37'C培養(yǎng)12h。用滅菌的牙簽從選擇性平板上挑取白色菌落,接菌到裝有5ml LB培養(yǎng)液的PA瓶中,再在37'C下以150r/min搖床培養(yǎng)8h,提取質(zhì)粒pMD-mlAC, 經(jīng)PCR擴增后,確定獲得轉(zhuǎn)化子。所述的載體,其轉(zhuǎn)化的宿主細胞,在實例中它是大腸桿菌,其中包含有擴增 內(nèi)標的DNA片段。所述的多重擴增內(nèi)標的驗證,是指通過將含多重擴增內(nèi)標的質(zhì)粒pMD-mIAC 添加到普通PCR反應體系中,可以用相應檢測引物與目的基因同時進行擴增,多 重擴增內(nèi)標與目的基因可擴增出大小不同的DNA片段。當樣品中含有的目的基因 時,電泳結(jié)果中含有目的基因和多重擴增內(nèi)標的擴增片段,檢測結(jié)果呈陽性;當 樣品中不含目的基因時,電泳結(jié)果中只有擴增內(nèi)標的擴增片段,檢測結(jié)果為陰性; 當電泳結(jié)果中不含有任何擴增片段時,檢測結(jié)果即為假陰性。所述的目的基因,是指金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、 單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。所述的假陰性,是指PCR反應受到了食品或培養(yǎng)基等物質(zhì)中存在的抑制劑的 影響而沒有發(fā)生反應,或者是由于操作人員的操作失誤導致結(jié)果呈現(xiàn)陰性。本發(fā)明構(gòu)建了可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌普通PCR檢測的多重擴增內(nèi)標。本發(fā)明利用生物信息學的方法, 根據(jù)金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌 hlyA基因、副溶血弧菌toxR基因設(shè)計特異性檢測引物,根據(jù)這四對引物序列運用重疊PCR技術(shù)人工合成了 一種多重擴增內(nèi)標,在確保目標序列擴增效率的同時 與金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌及其它細菌 的基因組非同源。本發(fā)明將所構(gòu)建的擴增內(nèi)標片段添加到PCR反應體系中,有助 于檢測時顯示假陰性的發(fā)生,從而提高PCR檢測的準確率,為滿足檢疫執(zhí)法過程 中所急需的對食源性致病菌調(diào)查和檢測提供有效可靠的技術(shù)手段。在本發(fā)明中,可選用本領(lǐng)域己知的各種載體,如市售的載體,包括質(zhì)粒,粘 粒等。將用于作為擴增內(nèi)標的基因序列可操作地連于表達調(diào)控序列,從而帶有擴 增內(nèi)標的載體。


      圖l多重擴增內(nèi)標的序列特征圖中左側(cè)從外至內(nèi)依次為金黃色葡萄球菌引物vicKF、單核細胞增生李斯 特菌引物hlyAF、沙門氏菌引物invAR和副溶血弧菌引物toxRR;右側(cè)從外至內(nèi) 依次為金黃色葡萄球菌引物vicKR、單核細胞增生李斯特菌引物hlyAR、副溶血 弧菌引物toxRF和沙門氏菌引物invAF。圖2重疊PCR方法合成多重擴增內(nèi)標示意中引物0P1與0P2、 0P3與0P4互為模板分別經(jīng)過第一輪PCR擴增,將 兩組擴增產(chǎn)物混合后進行第二論PCR擴增,取第二輪擴增產(chǎn)物為模板,以引物 0P5與0P6進行第三輪PCR擴增,其產(chǎn)物即為所需的多重擴增內(nèi)標序列。圖3大腸桿菌陽性克隆進行PCR檢測結(jié)果示意中電泳泳道l:以金黃色葡萄球菌引物vicKF/vicKR擴增結(jié)果(221bp)。 M: 100bp DNA分子量標準。圖4添加多重擴增內(nèi)標的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯 特菌和副溶血弧菌PCR檢測驗證結(jié)果示意中電泳泳道l:以單核細胞增生李斯特菌DNA為模板;電泳泳道2:以 沙門氏菌DNA為模板;電泳泳道3:以副溶血弧菌DNA為模板;電泳泳道4:以金黃色葡萄球菌DNA為模板;5-8:陰性對照;M: 100bp DNA分子量標準。
      具體實施方式
      下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進行實施,實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。以下 是實力給出了詳細的實施方式和具體的操作過程,但保護范圍不限于下述的實施 例。實施例一、特異性檢測引物的設(shè)計利用生物信息學分別對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌的已知特異基因進行分析,從中選出用于檢測的目的基因vicK、 invA、 hlyA、 toxR。通過Genbank中公用的BLAST軟件(為現(xiàn)有技術(shù),共用免費), 將vicK、 invA、 hlyA、 toxR基因的序列分別與其他微生物進行比對,選出特異 性較高的序列區(qū)段。然后用軟件Primer 5. 0 (為現(xiàn)有技術(shù),市售,Premier公司, 加拿大)在這段特異序列中設(shè)計一對內(nèi)標引物。引物序列如下-1. 金黃色葡萄球菌檢測引物(vicKF/vicKR) vicKF: 5, _ CGCAGGCTAATACTGAAAG -3,vicKR: 5, -TTCTGTTTCTTCACGGGTA _3,(a) 檢測目的基因的序列特征*長度512堿基對 *類型核酸*鏈型雙鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源金黃色葡萄球菌2. 沙門氏菌檢測引物(invAF/invAR)invAF: 5, -GTCACCGTGGTCCAGTTTA -3,invAR: 5, -CGACAAGACCATCACCAAT -3, (a)檢測目的基因的序列特征-*長度361堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形 (b) 分子類型DNA (C) 最初來源沙門氏菌3. 單核細胞增生李斯特菌(hlyAF / hlyAR) hlyAF: 5' _ TATCCAGGTGCTCTCGT _3,hlyAR: 5, - ACTGTAAGCCATTTCGTC -3'(a) 檢測目的基因的序列特征*長度264堿基對*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源單核細胞增生李斯特菌4. 副溶血弧菌(toxRF / toxRR) toxRF: 5, -CAAATAGTAATTCGCTCGCAG-3,toxRR: 5, -ATTCACAGCAGAAGCCACAG-3 ,(a) 檢測目的基因的序列特征*長度473堿基對 *類型核酸*鏈型雙鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源副溶血弧菌二、多重擴增內(nèi)標的序列的設(shè)計多重擴增內(nèi)標的序列特征(如圖l):*長度221堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線形(b)分子類型DNA(C)最初來源人工合成(d) 序列描述SEQ ID NO. 1:TACCCGTGAAGAAACAGAA三、采用重疊PCR技術(shù)合成多重擴增內(nèi)標1. 根據(jù)內(nèi)標序列設(shè)計重疊PCR引物將人工設(shè)計的擴增內(nèi)標DNA序列按重疊PCR的要求分成六段,每段均作為 引物用于擴增內(nèi)標的合成,具體引物序列如下0P1:TATCCAGGTGCTCTCGTCGACGACAAGACCATCACCAATTCACAGCAGAAGCCACAGCA OP 2:GATGATGTGGGCGGCGAGTGCTCCTATAGATGCTGGTGGTGCCATGCTGTGGCTTCTGC OP 3:GAGCACTCGCCGCCCACATCATCGAAAAGMACACGCGGATGTAAACTGGACCACGGTG OP 4:CTGTAAGCCATTTCGTCGAATTCAAATAGTAATTCGCTCGCAGTCACCGTGGTCCAGTT OP 5: CGCAGGCTAATACTGAAAGTATCCAGGTGCT OP 6: TTCTGTTTCTTCACGGGTACTGTAAGCCATT2. 采用重疊PCR方法合成多重擴增內(nèi)標,具體過程如圖2: 第一輪PCR擴增確定的反應體系如下第一組 第二組 10 X buffer (含Mg") 5.0 y 1 5.0uld證(2. 5 mM) 2. On 1 2. On 1引物(各lOyM) 0P1: lul + 0P2: lul 0P3: lul+0P4: 1 y 1Taq DNA聚合酶(2. 50.5yl 0.5ylU/u 1)補無菌水至 50 ul 50 ulPCR循環(huán)參數(shù)為在94。C預變性3min,接著作15個循環(huán),每個循環(huán)的程序 包括94'C變性30s,退火溫度45°C-60°C (每個循環(huán)升高1°C ),退火時間為60s, 然后在72'C延伸30s,循環(huán)結(jié)束后降溫至4'C,結(jié)束所有操作程序。 第二輪PCR擴增將上述兩組PCR產(chǎn)物混合,取50 y 1進行第二輪PCR反應。 PCR循環(huán)參數(shù)為在94。C預變性3min,接著作15個循環(huán),每個循環(huán)的程序 包括94。C變性30s,退火溫度45°C-60°C (每個循環(huán)升高1°C),退火時間為60s, 然后在72'C延伸30s,循環(huán)結(jié)束后在72'C延伸5min,最后降溫至4'C,結(jié)束所 有操作程序。第三輪PCR擴增取第二輪PCR產(chǎn)物0.2y l作為模板,反應體系如下 10 X buffer 5.0p1MgCl2溶液(25 mM) dNTP (2. 5 mM) 上下游引物(各10uM) Taq DNA聚合酶(2. 5U/ii 1) 模板3.0p 1 2. Oy 1 0P5: lyl+0P6: lul 0. 5u 1 0. 2ii 1補無菌水至50 ulPCR循環(huán)參數(shù)為在94。C預變性3min,接著作30個循環(huán),每個循環(huán)的程序 包括94。C變性30s,退火溫度55。C,退火時間為30s,然后在72。C延伸30s,循 環(huán)結(jié)束后在72X:延伸10min,最后降溫至4'C,結(jié)束所有操作程序。3. 連接按PCR回收試劑盒說明書回收第三輪PCR擴增產(chǎn)物片段?;厥盏臄U增產(chǎn)物 片段與pMD-18T載體在連接緩沖液作用下16。C過夜。4. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌用氯化鈣法轉(zhuǎn)移上述帶有擴增內(nèi)標的載體到大腸桿菌E. coli TG-1中,然 后涂布于90mm選擇性平板上,其中含有100mg/ml氨芐青霉素10u 1,20%的IPTG 溶液7ul和2。/。的X-gal溶液40u 1,經(jīng)過37'C培養(yǎng)12h,用滅菌的牙簽從選擇 性平板上挑取白色菌落用于陽性克隆的檢測。5.檢測將上述白色菌落接種到裝有5ml LB培養(yǎng)液的PA瓶中,在37。C下150r/min搖床培養(yǎng)8h,提取質(zhì)粒pMD-mIAC,利用特異引物(vicKF和vicKR)對提取的質(zhì)粒進行PCR檢測,具體結(jié)果如圖3。 四、多重擴增內(nèi)標的驗證1. 多重擴增內(nèi)標在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和 副溶血弧菌PCR檢測中的擴增大小分別為221bp、 121bp、 184 bp、 124bp。2. 分別提取多重擴增內(nèi)標和金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李 斯特菌和副溶血弧菌的DNA稀釋備用。3. 將多重擴增內(nèi)標分別加入到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌各自的PCR反應體系中。確定的反應體系如下10X buffer2. 5p 1MgCl2溶液(25 mM)1. 1dNTP (2. 5 mM)1. Oy 1上下游引物(各10yM)0. 1 + 0. 1多重擴增內(nèi)標lu 1Taq DNA聚合酶(1 U/n 1)lu 1模板5. On 1補無菌水至25 ulPCR循環(huán)參數(shù)為在95'C預變性3min,接著作35個循環(huán),每個循環(huán)的程序 包括95。C變性30s,退火溫度56。C,退火時間為30s,然后在72。C延伸30s,循 環(huán)結(jié)束后在72'C延伸10min,最后降溫至4'C,結(jié)束所有操作程序。擴增結(jié)果如圖4所示,以金黃色葡萄球菌DNA為模板能擴增出512bp的目標序列特異產(chǎn)物和221bp的擴增內(nèi)標產(chǎn)物;以沙門氏菌DNA為模板能擴增出 361bp的目標序列特異產(chǎn)物和121bp的擴增內(nèi)標產(chǎn)物;以單核細胞增生李斯特菌 DNA為模板能擴增出264bp的目標序列特異產(chǎn)物和184bp的擴增內(nèi)標產(chǎn)物;以副 溶血弧菌基因組DNA為模板皆能擴增出473bp的目標序列特異產(chǎn)物和124bp的擴 增內(nèi)標產(chǎn)物。因此,本發(fā)明成功的構(gòu)建了一段可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、 單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR檢測的多重擴增內(nèi)標,填補了國內(nèi) 在多重檢測內(nèi)標研究上的空白,有助于檢測時顯示假陰性的發(fā)生,在確保檢測準 確性與高效性的同時大大降低檢測成本,為滿足檢疫執(zhí)法過程中所急需的對食源 性致病菌調(diào)査和檢測提供有效可靠的技術(shù)手段。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下 〈110〉上海交通大學<120〉用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法<160> 15<170> Patentln version 3.4〈210〉 1<211〉 221〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉采用重疊PCR技術(shù)合成的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標序列 〈400〉 1cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc tctcgtcgac gacaagacca tcaccaattc 60 acagcagaag ccacagcatg gcaccaccag catctatagg agcactcgcc gcccacatca 120 tcgaaaagaa acacgcggat gtaaactgga ccacggtgac tgcgagcgaa ttactatttg 180 aattcgacga aatggcttac agtacccgtg aagaaacaga a 221<210〉 2〈211〉 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物0P1〈400〉 2tatccaggtg ctctcgtcga cgacaagacc atcaccaatt cacagcagaa gccacagca 59〈210〉 3〈211〉 59<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物0P2<400〉 3gatgatgtgg gcggcgagtg ctcctataga tgctggtggt gccatgctgt ggcttctgc 59<210〉 4<211> 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223>用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物0P3〈400〉 4gagcactcgc cgcccacatc atcgaaaaga aacacgcgga tgtaaactgg accacggtg 59〈210〉 5<211〉 59<212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物0P4〈400〉 5ctgtaagcca tttxgtcgaa ttcaaatagt aattcgctcg cagtcaccgt ggtccagtt 59〈210〉 6<211〉 31〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物OP5<> 6cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc t 31〈210〉 7〈211〉 31〈212〉 DNA 〈213>人工序列<220〉<223>用于多重擴增內(nèi)標合成的重疊PCR引物0P6 〈400〉 7ttctgtttct tcacgggtac tgtaagccat t 31<210> 8〈211〉 19〈212〉 DNA<213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <220>〈223〉金黃色葡萄球菌上游檢測引物<400> 8cgcaggctaa tactgaaag 19〈210〉 9〈211〉 19<212〉 DNA〈213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〈220〉〈223〉金黃色葡萄球菌下游檢測引物〈400〉 9ttctgtttct tcacgggta 19<210〉 10〈211〉 19〈212〉 ■〈213〉 沙門氏菌(Salmonella) <220>〈223〉沙門氏菌上游檢測引物〈400〉 10gtcaccgtgg tccagttta 19〈210〉 11〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉 沙門氏菌(Salmonella)<220〉<223〉沙門氏菌下游檢測引物<400〉 11cgacaagacc atcaccaat 19<210〉 12<211〉 17〈212〉 DNA<213> 單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉<223>單核細胞增生李斯特菌上游檢測引物〈400〉 12tatccaggtg ctctcgt 17<210〉 13<211〉 18<212〉 DNA〈213〉 單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉〈223〉單核細胞增生李斯特菌下游檢測引物〈400> 13actgtaagcc atttcgtc 18<210> 14<211〉 21<212> 薩〈213〉 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220〉〈223>副溶血弧菌上游檢測引物<400〉 14caaatagtaa ttcgctcgca g 21<210> 15<211> 20<212〉 腿〈213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220><223>副溶血弧菌下游檢測引物<400〉 15attcacagca gaagccacag 20
      權(quán)利要求
      1、一種用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法,其特征在于,包括以下步驟第一步,利用生物信息學的方法,根據(jù)金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設(shè)計特異性檢測引物;第二步,采用重疊PCR技術(shù)將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引物序列拼接成一條核苷酸片段,構(gòu)建多重擴增內(nèi)標;第三步,采用分子生物學技術(shù)將該人工序列克隆到質(zhì)粒載體pMD-18T,構(gòu)建含多重擴增內(nèi)標序列的質(zhì)粒pMD-mIAC;第四步,多重擴增內(nèi)標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。
      2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的特異性檢測引物,是指四對分別用于金黃色葡萄球菌、 沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR檢測的檢測引物 vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR,進行PCR檢測時,上 述引物能擴增到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧 菌菌株特有的檢測基因,或者是PCR體系中添加的擴增內(nèi)標。
      3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的重疊PCR技術(shù),是指采用具有互補末端的引物,使PCR 產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的 擴增片段重疊拼接起來。
      4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的多重擴增內(nèi)標,是指人工合成DNA片段,該片段是通過 重疊PCR技術(shù)人工合成的,其中包含金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的特異檢測引物序列,在確保擴增效率的同時減少了非目標菌的DNA對PCR檢測的干擾。
      5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法,其特征是,所述的分子生物學技術(shù),具體如下采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移上述帶有擴增內(nèi)標的載體到大腸桿菌E. coli TG-1中,然后涂布于選擇性平板上,經(jīng) 37t:培養(yǎng)12h,用滅菌的牙簽從選擇性平板上挑取白色菌落,接菌到裝有5mlLB 培養(yǎng)液的PA瓶中,再在37。C下以150r/min搖床培養(yǎng)8h,提取質(zhì)粒pMD-mIAC, 經(jīng)PCR擴增后,確定獲得轉(zhuǎn)化子。
      6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的選擇性平板,是指90mm選擇性平板,其中含有100mg/ml 氨芐青霉素10ul, 20%的IPTG溶液7u 1, 2M的X-gal溶液40ul。
      7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的載體,其轉(zhuǎn)化的宿主細胞,是大腸桿菌,其中包含有擴增 內(nèi)標的DNA片段。
      8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的多重擴增內(nèi)標的驗證,是指通過將含多重擴增內(nèi)標的質(zhì) 粒pMD-mIAC添加到普通PCR反應體系中,用相應檢測引物與目的基因同時進行 擴增,多重擴增內(nèi)標與目的基因可擴增出大小不同的DNA片段,當樣品中含有的 目的基因時,電泳結(jié)果中含有目的基因和多重擴增內(nèi)標的擴增片段,檢測結(jié)果呈 陽性;當樣品中不含目的基因時,電泳結(jié)果中只有擴增內(nèi)標的擴增片段,檢測結(jié) 果為陰性;當電泳結(jié)果中不含有任何擴增片段時,檢測結(jié)果即為假陰性。
      9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的假陰性,是指PCR反應受到了食品或培養(yǎng)基等物質(zhì)中存在 的抑制劑的影響而沒有發(fā)生反應,或者是由于操作人員的操作失誤導致結(jié)果呈現(xiàn) 陰性。
      10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方 法,其特征是,所述的目的基因,是指金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌 invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內(nèi)標的制備方法,步驟為根據(jù)金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設(shè)計特異性檢測引物;采用重疊PCR技術(shù)將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引物序列拼接成一條核苷酸片段,構(gòu)建多重擴增內(nèi)標;將該人工序列克隆到質(zhì)粒載體pMD-18T,構(gòu)建含多重擴增內(nèi)標序列的質(zhì)粒pMD-mIAC;多重擴增內(nèi)標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。本發(fā)明在確保檢測準確性與高效性的同時大大降低檢測成本。
      文檔編號C12Q1/68GK101220393SQ200810032998
      公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
      發(fā)明者史賢明, 張忠明, 施春雷, 馬瑜丹, 飛 龍 申請人:上海交通大學
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