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      三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系trmf及其建立方法

      文檔序號(hào):523560閱讀:647來源:國(guó)知局
      三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系trmf及其建立方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為C2013110。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系具有對(duì)鯉春病毒血癥病毒的易感性。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的生物學(xué)特性包括:細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣、胞漿豐富貼壁生長(zhǎng)、具有接觸抑制生長(zhǎng)特性,細(xì)胞倍增時(shí)間為36.01小時(shí),特征染色體數(shù)目為75條。
      【專利說明】三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系T RM F及其建立方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]泥嫩(Mis gurn us angui 11 iCaudatus)在分類學(xué)中屬于鯉形目(CypriniformeS)、鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)、泥鰍屬(Misgurnus),是亞洲特有的野生小型淡水魚類,廣泛分布于我國(guó)遼河以南大部分地區(qū)以及越南、朝鮮和日本。我國(guó)各淡水水域,如湖泊、池塘、河溪、水溝、稻田等均有分布。泥鰍肉質(zhì)細(xì)嫩、味美,營(yíng)養(yǎng)豐富,有“水中人參”之稱,除了較高的食用價(jià)值,它還具有一定的滋補(bǔ)藥用功效,是市場(chǎng)上暢銷的特種水產(chǎn)品之一。除了具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值外,泥鰍還是一種很好的細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究材料。與二倍體泥鰍相比,三倍體泥鰍具有生長(zhǎng)快、抗性強(qiáng)的特點(diǎn),但目前對(duì)這些生物學(xué)特性的機(jī)理尚沒有明確的分析。
      [0003]魚類細(xì)胞系的建立可用于病毒的分離、環(huán)境污染物檢測(cè)以及其他一些生物學(xué)特性的研究。三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系與其他魚類細(xì)胞系一樣可以滿足生物學(xué)研究、病毒的分離與擴(kuò)增、功能基因研究以及毒理學(xué)等應(yīng)用研究,除此之外,還可用于三倍體魚類的生長(zhǎng)、抗性等的機(jī)制分析。然而,迄今為止還沒有三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004]基于上述問題,本發(fā)明的目的在于提供一種三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法。
      [0005]所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號(hào)為C2013110。
      [0006]所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF支持鯉春病毒血癥病毒的生長(zhǎng)和復(fù)制。
      [0007]木發(fā)明還提供一種建立三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的方法,包括以下步驟:
      [0008]1、制備細(xì)胞培養(yǎng)液
      [0009]所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基,加入胎牛血清、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型胰島素樣生長(zhǎng)因子和硫酸軟骨素,配制成所述培養(yǎng)液,胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%,人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為10ng/ml,I型胰島素樣生長(zhǎng)因子的終濃度為20ng/ml,硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/ml,所述培養(yǎng)液存放在4°C ;
      [0010]I1、原代培養(yǎng)
      [0011]在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織,先用IOwt%的碘伏浸泡剪下的所述鰭組織15分鐘,再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘,然后用無菌PBS漂洗,將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊,均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時(shí),然后往所述培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加所述培養(yǎng)液,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);
      [0012]II 1、傳代培養(yǎng)[0013]待步驟II的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,移走培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,然后往所述培養(yǎng)瓶中加入
      0.25%的胰蛋白酶溶液對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行消化處理,30秒后吸去胰蛋白酶溶液,利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續(xù)消化I分鐘,加入培養(yǎng)液吹打消化后的細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液按預(yù)定比例轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中,并補(bǔ)加培養(yǎng)液,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
      [0014]IV、按照步驟III的過程傳代,30代后所用培養(yǎng)液為含有20Vol%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基 。
      [0015]本發(fā)明所提供的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系可用于進(jìn)行病毒學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳育種和種質(zhì)保存等理論研究。此外,該細(xì)胞系還可用于病毒疫苗研制等應(yīng)用研究。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0016]圖1是示出在顯微鏡下本發(fā)明三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系形態(tài)的圖。
      [0017]圖2是圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的染色體分析圖。
      [0018]圖3是對(duì)圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系進(jìn)行SSR分析的結(jié)果圖。
      [0019]圖4是示出圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線的圖。
      [0020]圖5是示出接種鯉春病毒血癥病毒四天后,三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的形態(tài)圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0021]以下通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系及其建立方法進(jìn)行說明。
      [0022]1、細(xì)胞系的建立
      [0023]所用的三倍體泥鰍是由二倍體泥鰍和四倍體泥鰍雜交獲得的。
      [0024]該三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF的建立過程包括下述三個(gè)階段。
      [0025](I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液
      [0026]所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基,加入胎牛血清(FBS)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型胰島素樣生長(zhǎng)因子和硫酸軟骨素,配制成細(xì)胞培養(yǎng)液。其中,胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%,人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為10ng/mL,I型胰島素樣生長(zhǎng)因子的終濃度為20ng/mL,硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/mL。配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液存放在4°C。
      [0027](2)原代培養(yǎng)
      [0028]在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織。接下來,先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘,再用青霉素和鏈霉素的混合液(青霉素終濃度為500IU/mL,鏈霉素終濃度為500 μ g/mL)浸泡30分鐘。浸泡結(jié)束之后,再用無菌PBS (配方:8gNaCl、0.2gKCl、
      3.639Na2HP04.12Η20和0.24gKH2P04,溶于蒸餾水并定容至1L)漂洗兩遍。然后,將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊,均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時(shí)。然后往細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至5mL/瓶,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
      [0029](3)傳代培養(yǎng)
      [0030]待原代培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到干凈容器中備用。接著往細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入ImL0.25%的胰蛋白酶溶液,用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理,30秒后吸去胰蛋白酶溶液,使得瓶底形成一層胰蛋白酶膜,繼續(xù)消化I分鐘,輕柔地磕碰細(xì)胞培養(yǎng)瓶。然后將前述轉(zhuǎn)移到干凈容器中備用的培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用吸管吹打細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。按體積比1:1將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中,并分別補(bǔ)加培養(yǎng)液至5mL。在25°C的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后,按照上述方法進(jìn)行傳代。30代后所用培養(yǎng)液為含20vol% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
      [0031]2、細(xì)胞系的保存
      [0032]所用的細(xì)胞凍存液配方如下:20%FBS,60%DMEM/F12和20%二甲基亞砜。保存于4°C冰箱中備用。
      [0033]取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶溶液消化。消化結(jié)束后,加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,1500rpm離心5min,棄上清,然后用ImL細(xì)胞凍存液重懸沉淀。調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0X IO6個(gè)/mL,然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管中。
      [0034]對(duì)細(xì)胞懸液逐漸降溫,具體降溫程序如下:首先在4°C冰箱中放置30min,然后轉(zhuǎn)入-20°C冰箱中放置2h,接著轉(zhuǎn)入-80°C冰箱中放置24h,最后放入液氮中(_196°C )長(zhǎng)期保存。
      [0035]取在液氮中保存的細(xì)胞,在4(TC水中解凍,待細(xì)胞懸液融化后轉(zhuǎn)入2 5 °C水浴中3min。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管,加入等量的DMEM/F12培養(yǎng)基,1500rpm離心5min,棄上清,用含20vol% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至5mL,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
      [0036]同時(shí),取少量解凍過程中重懸的細(xì)胞液,加入臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)染色,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞的存活率,存活率=(活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))X100 %。
      [0037]凍存的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF存活率為(84.48± 1.13) %。
      [0038]3、染色體分析
      [0039]向培養(yǎng)有三倍體泥鰍鰭細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入終濃度為I μ g/mL的秋水仙素,將培養(yǎng)瓶置于25°C的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3~5h。然后用0.25%的胰蛋白酶溶液消化,將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中,1500rpm離心5min,收集細(xì)胞。用0.075mol/L的KCl溶液低滲40min,然后Carnoy固定液固定15min,固定三次后滴片,干燥后用Giemsa染液染色。
      [0040]顯微鏡下觀察拍照。計(jì)數(shù)染色體數(shù)目,并進(jìn)行核型分析,根據(jù)染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂長(zhǎng)等特征,對(duì)染色體進(jìn)行分組、配對(duì)。
      [0041]本發(fā)明所建立的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的染色體核型如圖2所示。
      [0042]4、SSR 分析
      [0043]通過SSR(Simple Sequence Repeats)技術(shù)來鑒定所建立的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF是否與泥鰍具有相同的遺傳特征。
      [0044]采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取泥鰍肌肉組織(用作陽(yáng)性對(duì)照)和斑馬魚肌肉組織(用作陰性對(duì)照)的基因組DNA。
      [0045]按如下步驟提取三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的基因組DNA:①取出冷凍在_20°C的傳代細(xì)胞,在4°C解凍后放入1.5mL離心管中,離心后去除上清液;②加入250yL的DNA裂解液(含有 I Ommo I/L Tris_Cl、50mmol/LKCl 和 0.5% Tween-20, pH8.0),再加入 5μ L 蛋白酶Κ(濃度為0.5mg/mL),于55°C水浴恒溫裂解3h;③參照苯酚-氯仿抽提法,用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。
      [0046]接下來,進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增。[0047]根據(jù)已報(bào)道的泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn),合成Mac9、Mac50兩對(duì)引物(具體序列見表I)。
      [0048]表1
      【權(quán)利要求】
      1.一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF,于2013年8月19日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為C2013110。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF,其特征在于,所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系支持鯉春病毒血癥病毒的生長(zhǎng)和復(fù)制。
      3.一種建立三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的方法,包括以下步驟: I、制備細(xì)胞培養(yǎng)液 所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基,加入胎牛血清、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、I型胰島素樣生長(zhǎng)因子和硫酸軟骨素,配制成所述培養(yǎng)液,胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%,人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為10ng/ml,I型胰島素樣生長(zhǎng)因子的終濃度為20ng/ml,硫酸軟骨素的終濃度為10μ g/mi,所述培養(yǎng)液存放在4°C ; II、原代培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織,先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘,再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘,然后用無菌PBS漂洗,將漂洗后的鰭組織剪成imm3左右的小塊,均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時(shí),然后往培養(yǎng)瓶中加入所述培養(yǎng)液,在25 °C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng); II I、傳代培養(yǎng) 待步驟II的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,移走培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,然后往培養(yǎng)瓶中加入0.25%的胰蛋白酶溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理,30秒后吸去胰蛋白酶溶液,利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續(xù)消化I分鐘,加入培養(yǎng)液吹打消化后的細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液按預(yù)定比例轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中,并補(bǔ)加培養(yǎng)液,在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng); IV、按照步驟III的過程傳代,30代后所用培養(yǎng)液為含20VOl%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。
      【文檔編號(hào)】C12R1/91GK103525749SQ201310538151
      【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
      【發(fā)明者】李霞, 馬辰, 秦艷杰, 李雅娟, 楊艷津 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)
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